L'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est une molécule très largement conservée dans le monde du vivant. Chez les bactéries, cette molécule signal est impliquée, entre autres, dans l'adaptation aux changements de milieu, au développement de la virulence, à la sporulation et la compétence. Bien qu'il fut démontré dans les années 1970 que cette molécule nécessitait un transporteur afin de traverser la membrane cellulaire, l'identité de celui-ci restait jusqu'à très récemment inconnue. Ce n'est qu'en 2011 que Hantke et ses collègues démontrèrent l'implication de la protéine TolC dans l'export de l'AMPc. Au cours de ma thèse, j'ai démontré le rôle prépondérant du complexe Opp dans l'import d'AMPc chez Escherichia coli. Ce complexe, formé des protéines OppABCD et F, est connu pour transporter des oligopeptides et se trouve dans la membrane interne de nombreuses bactéries. Pour arriver à la conclusion de son implication dans le transport d'AMPc, une banque de mutants a été créée dans une souche ne produisant pas d'AMPc (cyaA-). Afin d'identifier le transporteur responsable de l'import de l'AMPc, différents cribles qui testent la présence de cette molécule dans la cellule, ont ensuite été réalisée sur ces clones. Après analyse des résultats obtenus, l'opéron opp a été pressenti comme étant nécessaire à l'entrée de l'AMPc dans la cellule. Le double mutant cyaA-oppA- a été créé et de nouvelles expériences sont venues confirmer notre hypothèse. La protéine OppA a ensuite était surexprimée et purifiée pour nous permettre de faire des tests biochimiques d'interaction entre AMPc et OppA, basés sur la fluorescence émise par la protéine elle-même ou un homologue de l'AMPc, l'ε-AMPc. Ces expériences nous ont permis de confirmer l'interaction entre la protéine OppA et l'AMPc. Le système Opp est donc le principal importateur d'AMPc chez Escherichia coli, mais il ne semble pas être l'unique transporteur impliqué. Un autre candidat très intéressant est le complexe Dpp, connu pour transporter les dipeptides. En effet, les expériences préliminaires effectuées démontrent une diminution de la concentration intracellulaire d'AMPc dans une cellule cyaA-dppA- comparée à celle observée dans une souche cyaA-. Les travaux réalisés pendant ces trois dernières années permettent de conclure que le complexe Opp est le principal importateur d'AMPc, très probablement secondé par le complexe Dpp. / Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a signalling molecule conserved in all reigns of life. In bacteria, cAMP plays an important role in processes as diverse as the adaptation to a changing environment, the control of virulence, sporulation and competence. Although it has been proven in the 1970s that this molecule needs an active transporter to traverse the plasma membrane, the first one of these transporters was discovered only a few years ago. In 2011, Hantke et al have shown that the TolC protein is involved in the efflux of cAMP. During my PhD work I have identified the Opp complex as a major player of cAMP import into Escherichia coli. This complex, composed of proteins called OppABCD and F, is known to transport oligopeptides across the inner membrane of numerous bacterial species. To prove the involvement of the Opp complex in cAMP transport, I have used transposon mutagenesis to generate a collection of random mutants in a strain that does not produce cAMP (cyaA-). Different screens were used to detect mutants with impaired transport of extracellular cAMP into the cell. The opp operon emerged as the most promising candidate from this screen. The double mutant cyaA-oppA- was constructed and experiments designed to test the function of OppA confirmed our hypothesis. Subsequently, I overexpressed and purified OppA in order to perform biochemical experiments destined to measure the physical interaction between cAMP and OppA. I show that the Opp system is the major importer of cAMP in Escherichia coli. However, it seems that Opp is not the unique importer of cAMP. The other, very interesting candidate is the complex Dpp, known to transport dipeptides. Preliminary experiments revealed a decreased amount of cAMP in strain cyaA-dppA- compared to strain cyaA-. The experiments carried out during the last three years allow us to conclude that the Opp complex is the major importer of cAMP into E. coli and that the Dpp complex is probably a secondary transporter.

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To survive, neurons and other eukaryotic cells must rapidly repair (seal) plasmalemmal damage. Such repair occurs by an accumulation of intracellular vesicles at or near the plasmalemmal disruption. Diacylglycerol (DAG)-dependent and cAMP-dependent proteins are involved in many vesicle trafficking pathways. Although recent studies have implicated the signaling molecule cAMP in sealing, no study has investigated how DAG and DAG-dependent proteins affect sealing and, whether pharmacological inhibition of such proteins could promote immediate repair of damaged mammalian axons. To this end, I investigated the role of DAG, protein kinase C (PKC) and other DAG-activated proteins in plasmalemmal sealing in B104 neurons in vitro and rat sciatic nerves in vivo. Using dye exclusion to assess Ca2+-dependent vesicle-mediated sealing of transected neurites of individually identifiable rat hippocampal B104 cells, I now report that, compared to non-treated controls, sealing probabilities and rates are increased by DAG and cAMP analogs that activate PKC and Munc13-1, and protein kinase A (PKA). Sealing is decreased by inhibiting DAG-activated novel protein kinase C isozymes η (nPKCη) and θ (nPKCθ) and, Munc13-1, the PKC effector myristoylated alanine rich PKC substrate (MARCKS) or phospholipase C (PLC). DAG-increased sealing is prevented by inhibiting MARCKS or PKA. Sealing probability is further decreased by simultaneously inhibiting nPKCη, nPKCθ and PKA. Extracellular Ca2+, DAG or cAMP analogs do not affect this decrease in sealing. I also report that applying inhibitors of nPKC and PKA to rat sciatic axons crush-severed in vivo under physiological calcium, do not promote immediate repair by polyethylene glycol (PEG), as assessed by compound action potential conduction and dye diffusion through crush sites. These and other data suggest that DAG increases sealing through MARCKS and that nPKCη, nPKCθ and PKA are all required to seal plasmalemmal damage in B104 neurons, and likely all eukaryotic cells. / text

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien. / Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle.