Le Ca[exposant]2+ joue un rôle majeur dans la régulation de processus physiologiques et biochimiques de l'organisme. Chez les cellules non-excitables, les TRPCs (transient receptor potential canonical) sont des canaux calciques impliqués dans l'influx de Ca[exposant]2+ à la membrane plasmique. Bien que de nombreux efforts soient déployés, le mécanisme régulant l'activité et le routage des TRPCs est encore mal connu. Au cours des dernières années, l'étude de domaines conservés au sein des protéines a connu un engouement. Tous les TRPCs possèdent un domaine de répétitions similaires à l'ankyrine (ANK), un motif bien connu pour son implication dans des interactions protéine-protéine. Le but de la présente étude était d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs. Pour ce faire, nous avons utilisé l'approche de double-hybride chez la levure afin de cribler une librairie d'ADNc, ce qui nous a permis d'identifier MxA et RNF24. MxA est une protéine faisant partie de la superfamille de la dynamine. Elle possède plusieurs propriétés de la dynamine classique, dont celle d'oligomériser. La première partie de l'étude démontre que MxA interagit au niveau de la deuxième répétition similaire à l'ankyrine de TRPC6 et que cette protéine peut lier tour les TRPCs, autant in vitro qu'in cellulo. Des mesures de Ca[exposant]2+ intracellulaire effectuées sur des cellules HEK 293T démontrent que l'interaction entre MxA et TRPC6 modifie significativement l'activité de TRPC6. De plus, l'utilisation de mutants de MxA démontre que la modulation de l'activité de TRPC6 s'effectue lorsque MxA est sous sa forme monomérique liée au GTP. Les résultats démontrent que MxA lie le domaine ANK de TRPC6 et modifie son activité. La découverte de RNF24 a permis d'identifier une nouvelle protéine membranaire localisée au niveau de l'appareil de Golgi. L'expression de RNF24 réduit spécifiquement l'insertion des TRPCs a la membrane plasmique, cause une rétention intracellulaire des TRPC3 et TRPC6, mais n'affecte pas le processus de maturation de TRPC6. De plus, dans les cellules HEK 293T stimulées par le carbachol, l'influx de Ca[exposant]2+ endogène ou médié par TRPC6 n'est pas affecté par la co-expression de RNF24. Ainsi, les résultats démontrent que RNF24 interagit avec les TRPCs, affecte le routage intracellulaire de ceux-ci sans modifier leur activité. Ces deux études ont permis d'identifier les premiers partenaires d'interaction du domaine ANK des TRPCs, soit MxA et RNF24, et de caractériser l'effet des interactions sur la modulation du routage et de l'activité des TRPCs.

La voie de signalisation HH joue un rôle crucial dans le contrôle de la prolifération et la différenciation cellulaires. Le dérèglement de cette voie est responsable de nombreux cancers. J'ai ainsi mis en place les outils moléculaires nécessaires pour identifier des régions importantes dans les interactions protéines-protéines au sein du complexe intracellulaire de la voie qui vont permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation du facteur de transcription CI en fonction de l'état d'activation de la voie. Mes travaux ouvrent la voie à de nombreuses études structurales et fonctionnelles de ces protéines jusqu'ici peu étudiées.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La voie de signalisation HH joue un rôle crucial dans le contrôle de la prolifération et la différenciation cellulaires. Le dérèglement de cette voie est responsable de nombreux cancers. J’ai ainsi mis en place les outils moléculaires nécessaires pour identifier des régions importantes dans les interactions protéines-protéines au sein du complexe intracellulaire de la voie qui vont permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation du facteur de transcription CI en fonction de l’état d’activation de la voie. Mes travaux ouvrent la voie à de nombreuses études structurales et fonctionnelles de ces protéines jusqu'ici peu étudiées. / The Hedgehog (Hh) signaling pathway is a highly conserved regulator of growth and differentiation that is essential for both vertebrate and invertebrate development. In Drosophila, the HH pathway is regulated by a high molecular weight intracellular protein complex called the Hedgehog Transducing Complex (HTC), whose composition is controlled by the activation of the pathway. My thesis project is to characterise the HTC complex that regulates the fate of the HH transcription factor, CI. I am using structural studies, biochemistry and enzymology to better understand the protein-protein interactions and function that govern the Hedgehog pathway. My work provide a high resolution view of the HTC and help to understand how those proteins work and interact with each other.

Le développement d'une résistance à l'action de l'insuline est fréquemment observée au cours de l'obésité et est à l'origine du diabète de type 2. L'amélioration du signal insulinique au sein de la cellule adipeuse (i.e adipocyte) est une stratégie thérapeutique intéressante en vue d'améliorer la sensibilité à l'insuline systémique de patients pré-diabétiques et diabétiques. Dans cette optique, l'inhibition de la lipase hormono-sensible (LHS) adipocytaire (enzyme responsable de la libération d'acides gras par le tissu adipeux) protège de l'insulino-résistance. Les mécanismes impliqués dans l'amélioration de la sensibilité à l'insuline n'étaient cependant pas encore connus. Mon travail de thèse a donc été axé sur l'identification des mécanismes liant l'inhibition de la LHS et l'amélioration de la sensibilité à l'insuline. Dans des adipocytes humains, l'invalidation de la LHS augmente le transport du glucose, la voie de la lipogenèse de novo (synthèse d'acides gras à partir du glucose) et le signal insulinique. Parmi les enzymes lipogéniques, l'élongase des acides gras à longue chaîne ELOVL6 voit son expression très fortement induite in vitro et in vivo lors d'une déficience pour la LHS, conduisant à un enrichissement en oléate des phospholopides et des triglycérides. L'invalidation d'ELOVL6 dans des adipocytes humains a permis de démontrer le rôle clé de l'élongase dans la médiation des effets bénéfiques de l'invalidation de la LHS. In vivo, une déficience pour ELOVL6 conduit également à une détérioration du signal insulinique dans le tissu adipeux. Dans des études cliniques, l'expression d'ELOVL6 s'effondre au cours de l'insulino-résistance et est restaurée après une chirurgie bariatrique. L'enrichissement en oléate dans les phospholipides par ELOVL6 est responsable des effets protecteurs de l'inhibition de la LHS sur le signal insulinique. Des adipocytes surexprimant ELOVL6 présentent d'ailleurs une augmentation de la fluidité membranaire associée à une amélioration du signal insulinique. Dans le foie, ELOVL6 est une cible du facteur de transcription ChREBP. ChREBP adipocytaire, notamment l'isoforme ChREBPß, a récemment été mis en évidence pour son rôle déterminant sur la sensibilité à l'insuline systémique. Chez l'Homme, nous avons observé in vitro et in vivo d'étroites corrélations positives entre les expressions adipocytaires de ChREBPß et d'ELOVL6. L'inhibition simultanée de la LHS et ChREBP réduit fortement l'expression d'ELOVL6 et annule l'enrichissement en oléate des phospholipides ainsi que l'amélioration du signal insulinique. De manière particulièrement intéressante, nous avons mis en évidence qu'une interaction physique entre la LHS et ChREBP inhibe la translocation nucléaire du facteur et son activité transcriptionnelle. L'activité catalytique de la LHS n'est pas requise pour assurer l'interaction. Nous avons aussi montré que cette interaction est spécifique de la LHS et est restreinte à l'adipocyte. En conclusion, notre travail a mis au jour une nouvelle voie déterminante pour la sensibilité à l'insuline adipocytaire, liant la LHS au facteur de transcription ChREBP et à sa cible, l'élongase des acides gras ELOVL6. L'enrichissement consécutif en oléate des phospholipides conduit à une augmentation de la fluidité membranaire et à une amélioration du signal insulinique. L'inhibition de l'interaction entre la LHS et ChREBP dans le tissu adipeux pourrait donc être bénéfique dans la prise en charge de l'insulino-résistance associée à l'obésité. / Insulin resistance is a feature frequently associated to obesity and an early defect in the development of type 2 diabetes. Improvement of fat cell insulin signaling may favor recovery of whole body systemic insulin sensitivity in pre-diabetic and diabetic states. In this context, inhibition of hormone-sensitive lipase (HSL) in adipocytes (an enzyme responsible for fatty acid release by adipose tissue) was demonstrated to be protective against insulin resistance. However, the mechanisms remained unclear. Consequently, my PhD work aimed at understanding the mechanisms linking HSL inhibition and improvement of insulin sensitivity. In human adipocytes, HSL gene silencing increased glucose transport, de novo lipogenesis and insulin signaling. Among de novo lipogenesis enzymes, ELOVL6 was preferentially induced in vitro and in vivo during HSL partial deficiency, resulting in enrichment of phospholipids and triglycerides in oleic acid. ELOVL6 gene silencing in human adipocytes provided the direct demonstration of the role of the enzyme in the beneficial effect of HSL inhibition. Fat cell insulin signaling was also impaired in adipose tissue of Elovl6 null mice. In clinical studies, ELOVL6 expression was blunted in insulin resistant states and restored after bariatric surgery. ELOVL6-mediated oleic acid enrichment of phospholipids was responsible for the positive effect of HSL inhibition on insulin signaling. FRAP studies revealed an increase in plasma membrane fluidity and insulin signaling in adipocytes overexpressing ELOVL6. In the liver, ELOVL6 is a target of ChREBP. Adipose ChREBP, notably the constitutively active isoform ChREBPß, recently emerged as a major determinant of systemic insulin action on glucose metabolism. In humans, we observed in several in vitro models and in vivo studies a strong positive association between adipose ChREBPß and ELOVL6. Dual HSL-ChREBP inhibition blunted adipose ELOVL6 expression in vivo and in vitro and mirrored ELOVL6 gene silencing on fatty acid profile and insulin signaling. Importantly, we found that physical interaction between HSL and ChREBP impairs ChREBP translocation into the nucleus and its transcriptional activity. A naturally short form of HSL devoid of catalytic activity retained the capacity to bind ChREBP. We also demonstrated that ChREBP-HSL interaction was specific of the lipase and restricted to adipocyte. To conclude, our work identifies a novel pathway critical for optimal insulin signaling in fat cells which links the neutral lipase HSL to the glucose-responsive transcription factor ChREBP and its target gene, the fatty acid elongase, ELOVL6. ELOVL6-mediated oleate enrichment in phospholipids increases membrane fluidity and improves insulin signaling. Inhibition of HSL/ChREBP interaction in adipose tissue may be beneficial in the treatment of obesity-associated insulin resistance.

Le cancer de la prostate représente la deuxième cause de décès liée au cancer. Des stratégies thérapeutiques ciblant des mécanismes moléculaires conduisant à la résistance doivent donc être développées. Une stratégie visant à améliorer les traitements du cancer de la prostate consiste à cibler les gènes qui sont activés lors de la disparition des androgènes, soit pour retarder ou empêcher l'émergence du phénotype de résistance à la castration. Le but de cette thèse est d'identifier et de développer des petites molécules inhibitrices ciblant des interactions protéine-protéine impliquées dans le cancer de la prostate. Cette thèse porte sur l'étude de deux protéines cruciales liées au cancer de la prostate, à savoir, la protéine de choc thermique de bas poids moléculaire (Hsp27) et la protéine TCTP. Nous avons validé deux composés ciblant TCTP en utilisant une chimiothèque dédiée à l'inhibition d'interaction protéine-protéine. Des tests fonctionnels sont actuellement mis au point pour évaluer la capacité de ces molécules à être proposées comme composés potentiels contre le cancer de la prostate. / Prostate Cancer (PCa) is one of most common malignancies, being the second leading cause among cancer-related death. Additional therapeutic strategies targeting molecular mechanisms mediating resistance must be developed because of the defects of docetaxel-based treatments. One strategy to improve therapies in advanced PCa involves targeting genes that are activated by androgen withdrawal, either to delay or prevent the emergence of the CR phenotype. The purpose of my thesis is to identify & develop small molecules inhibitors targeting PPIs involved in prostate cancer. we focuses on 2 crucial prostate cancer related proteins, namely, the small molecular weight Heat shock protein 27 (Hsp27) and the Translationally Controlled Tumor Protein (TCTP). We have validated 2 compounds targeting TCTP by using a "PPI Inhibitor-like" dedicated chemical library. Functional tests are now being developed to evaluate the capacity of such molecules to be proposed as potential compounds against prostate cancer.

Les Archaea sont des micro-organismes rencontrés dans tous les écosystèmes, mais qui apparaissent comme majoritaires dans les environnements dits extrêmes. Les archaea hyperthermophiles, comme Pyrococcus abyssi sont en permanence exposées à des températures qui peuvent augmenter le taux de dommages de l'ADN, pourtant, le taux de mutations spontanés chez ces micro-organismes est similaire à celui des espèces modèles mésophiles. Il est ainsi probable que les hyperthermophiles possèdent des systèmes particulièrement efficaces pour dupliquer, maintenir et stabiliser leur génome. L'objectif de ce projet était d'explorer le réseau d'interaction impliqué dans les processus de réplication et de réparation de l'ADN. L'approche méthodologique mise en oeuvre a consisté à coupler la capture de partenaires d'interaction par pull-down avec leur identification par spectrométrie de masse. J'ai pu ainsi mettre en évidence, au sein l'extrait cellulaire de P. abyssi, un réseau préliminaire reliant des protéines de la maintenance génomique. Nous avons non seulement mis en évidence de nouvelles protéines impliquées probablement dans des mécanismes de réparation, mais également des nouvelles interactions non suspectées entre des composants déjà caractérisés. Les principaux résultats sont les suivants : (1) La nucléase Pab2263, partenaire du PCNA, est un nouvel acteur du métabolisme de l'ADN. (2) Le PCNA forme un macrocomplexe avec les protéines ubiquitaires Mre11 et Rad50 suggérant un rôle de ce complexe dans la réparation des cassures double brin de l'ADN lors de la réplication. (3) Les protéines Fen1 et l'ADN primase interagissent physiquement et peuvent collaborer in vitro pour résoudre une étape intermédiaire de la voie de réparation par excision de base. Ces résultats enrichissent notre compréhension des processus de réparation de l'ADN chez les archées.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficaces. / Arf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors.