Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la classe de récepteurs la plus nombreuse et la plus étudiée. La compréhension du mode de fonctionnement de cette famille de récepteurs fait l'objet d'études intenses, tant au niveau de leur interaction avec le ligand qu'au niveau du processus d'activation suite à cette liaison. Le récepteur de l'U-II (UT) est un membre de la classe A des GPCRs et possède toutes les caractéristiques de cette famille. Notre hypothèse est que le récepteur UT possède des déterminants moléculaires identifiables qui sont impliqués lors de sa liaison à l'U-II et de son activation. Dans un premier temps, des études de marquage par photoaffinité du récepteur UT ont été effectuées en utilisant deux séries de ligands U-II qui contiennent le résidu photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) et qui possèdent un caractère agoniste ou agoniste partiel. Il a été montré pour les deux séries de ligands que les quatre premiers résidus de l'U-II sont à proximité du résidu Met288 dans la 3e boucle extracellulaire du récepteur UT. Cette approche a également été utilisée pour comparer le patron de photomarquage entre deux ligands contenant le Bpa à la position 6, soit de l'analogue agoniste complet avec celui de l'analogue agoniste partiel. Il a été montré que le peptide agoniste photomarque les résidus Met184/Met185 du TMD4 de l'UT, tandis que l'agoniste partiel photomarque plutôt une région délimitée au TMD5. Le deuxième objectif du projet a été l'identification, au moyen de l'approche SCAM (Substituted Cysteine Assessibility Method) de résidus qui bordent la pochette de liaison du récepteur. Chacun des résidus des domaines transmembranaires 6 et 7 ont été mutés, un à un, par une cystéine. Suite au traitement par des composés MTS, la liaison du ligand [indice supérieur 125]I-U-II aux mutants F268C[indice supérieur (6.44)], W278C[indice supérieur (6.54)] et A282C[indice supérieur (6.58)] du TMD6 ainsi qu'aux mutants L298C[indice supérieur (7.34)], Y300C[indice supérieur (7.36)], T302C[indice supérieur (7.38)] et T303C[indice supérieur (7.39)] du TMD7 a été inhibée, démontrant que ces positions du récepteur font face à la pochette de liaison. L'ensemble de ces études mène à une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison et de l'activation du récepteur UT et nous a permis de proposer un modèle moléculaire du récepteur UT ligandé. Ce modèle pourra ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du processus de liaison et d'activation des GPCRs peptidergiques de la classe A.

RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l’expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l’augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l’HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l’HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d’une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l’adulte (ATL). L’HCL et l’ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l’HCL et l’ATL. Notre objectif serait d’y restaurer l’expression de RHOH et ainsi d’essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s’est tout d’abord orienté sur l’étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l’expression du gène RHOH est principalement due à l’activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d’initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l’activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d’une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d’autre part, l’importance des membres de la famille Fos dans l’expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l’activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d’observer une variation biphasique de l’expression des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d’abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l’utilisation d’un ionophore pour le calcium, suivie d’une répression, mimée par l’analogue du DAG. / The hematopoietic GTPase RhoH is an atypical family member of the Rho GTPases as it is constitutively active and not regulated through the classical cycling between GTP- and GDP-bound state. A number of studies investigated the role of RhoH in hematopoietic cells. RhoH is associated with regulation of proliferation of hematopoietic stem and progenitors. This protein exhibits essential functions in thymocyte development and TCR, BCR, FcεRI signaling in T, B and mast cells, respectively. Recently, a report provided evidence implicating RhoH overexpression in the initiation and progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL); on the other hand, RhoH underexpression has been implicated in the progression of Hairy Cell Leukemia (HCL). Most data indicate that RhoH is an important regulatory molecule with antagonistic functions in proliferation, adhesion or migration in hematopoietic cells and therefore must be accurately regulated. Previous experiments from our laboratory reported that HCL is characterized by abnormal underexpression of RhoH, corresponding to a decreased level of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. Reconstitution of RhoH expression reduced proliferation, adhesion and migration that is central in HCL pathogenesis. Transcriptional repression of this gene was also observed in another leukemia, Adult T cell Leukemia (ATL). Aimed at identifying new therapeutic targets to combat HCL and ATL, we wanted to examine molecular mechanisms implicated in RhoH underexpression in both diseases. HCL and ATL are chronic lymphoproliferative disorders characterized by proliferation of mature cells with memory B cell or T-helper cell phenotype, respectively. In the first part of our work, we wanted to investigate molecular mechanisms mediating normal RhoH expression in activated B and T cells, as well as induced pathways; in the second part, we tempted to identify transcription factors implicated in RhoH repression in HCL and ATL. Firstly, our work has focused onto physiological expression of RHOH gene in B and T cells. We showed that RHOH gene expression observed in these cells was mostly due to transcriptional activity of P3 promoter, upstream of RHOH exon 4. The promoter was isolated spanning nucleotides -236/+67 relative to the transcription start site, in B cells. B cells stimulation by PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acétate) induced an increase of P3 promoter activity. PMA is a DiacylGlycerol (DAG) analogous. This result suggested that transcription factors related to DAG pathway stimulation, like AP1 (Activator Protein 1), could be responsible for RHOH expression in B cells. We could show that the Jun family member JunD is able to bind to endogenous P3 promoter and can act as a repressor of RHOH expression in a B cell line, Raji. Other Jun family members seemed not to be implicated in this regulation. We also reported that Fos family members are important in RHOH expression. Our results suggest that the transcription factor AP1 could regulate this process in B cells. T cell activation by antibodies directed against CD3 and CD28 induced biphasic kinetics of expression of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. We observed a high increase of RHOH transcript level, mimicked by use of ionomycin, followed by an important decrease, mimicked by use of PMA. RHOH P3 promoter was isolated in a T cell line, Jurkat, then we investigated putative binding sites for transcription factors, which could be implicated in this biphasic event in T cells. Our preliminary results have shown that some potential binding sites for transcription factors related to calcium pathway and inducing RHOH expression are present between nucleotides -236 and -201; also sites for transcription factors induced by DAG pathway and repressing this gene are present between nucleotides -583 and -380.

La leucémie à tricholeucocytes (ou HCL pour Hairy Cell Leukemia) est un syndrôme lymphoprolifératif B rare du sujet âgé, caractérisé par une infiltration médullaire et splénique de cellules présentant des protrusions cytoplasmiques. Des thérapies de première ligne efficaces existent contre ce cancer et l’intérêt de la recherche biomédicale dans ce domaine réside désormais dans le développement de nouvelles molécules actives contre les cellules leucémiques réfractaires aux traitements de référence. Parmi les voies de signalisation dérégulées dans l’HCL, celle des Rho-GTPases influe sur les phénomènes de croissance cellulaire et d’organisation du cytosquelette d’actine, perturbés dans les tricholeucocytes. Les travaux précédemment menés au laboratoire ont montré la sous-expression dans l’HCL d’une Rho-GTPase atypique, RhoH, dont l’expression ectopique dans un modèle cellulaire d’HCL atténue la progression tumorale. Afin de déterminer les cibles moléculaires de RhoH dans cette leucémie, une étude transcriptomique a été réalisée et a montré la sous-expression du marqueur de surface CD38 lorsque RhoH est surexprimée.Plus qu’un marqueur de différenciation lymphocytaire, CD38 est une molécule à effets pléïotropiques (à la fois récepteur, enzyme et protéine d’adhérence cellulaire), importante dans le développement des lymphocytes B. CD38 a également été décrit comme un marqueur délétère dans la leucémie lymphoïde chronique et représente une cible thérapeutique dans le myélome multiple. Bien qu’exprimé par un tiers des patients porteurs de l’HCL, son rôle dans cette leucémie restait jusqu’alors inconnu.Les travaux présentés dans cette thèse décrivent, d’une part, l’étude de la régulation du gène CD38 par RhoH dans l’HCL, et d’autre part, l’impact de la protéine CD38 dans la progression de cette leucémie. Des données préliminaires sur l’activité de fragments de promoteur du gène CD38 semblent indiquer un rôle du facteur de transcription Smad1 dans la régulation de ce gène par RhoH. Grâce à une technique de genome editing, nous avons produit deux lignées cellulaires HCL knock out pour le gène CD38. Ces modèles nous ont permis de déterminer que CD38 promeut la survie ainsi que l’adhésion à l’endothélium des cellules HCL, et modifie également leurs propriétés migratoires in vitro. Nous avons également observé que CD38 favorisait la progression tumorale dans un modèle murin de xénogreffe de ces lignées cellulaires. Enfin, des données produites par nos collaborateurs ont montré que CD38 est un marqueur de mauvais pronostic pour la rechute des patients atteints d’HCL et qu’il constitue une cible thérapeutique potentielle pour les 30% de patients qui l’expriment.Mimer l’effet de RhoH dans l’HCL à des fins thérapeutiques s’avèrerait délicat. Le ciblage de CD38 semble donc une alternative de choix. En effet, la sous-expression de RhoH dans l’HCL favorise l’expression de cette protéine, dont l’effet est délétère pour les patients puisqu’elle participe à la progression de la leucémie. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques dirigés contre CD38 étant déjà utilisés en clinique pour traiter d’autres leucémies, ce travail ouvre la voie à l’extension de leur utilisation dans le traitement de l’HCL réfractaire, pour les patients qui l’expriment. / Hairy Cell Leukemia (HCL) is a B-lymphoproliferative disorder of the elderly, which is characterized by medullar and splenic homing of “hairy” cells bearing cytoplasmic protrusions. Efficient first-line therapies against this cancer do exist and the real challenge in biomedical research is now to develop new molecules targeting leukemic cells which are resistant to these first-line treatments. Among some deregulated signaling pathways that have been described in HCL, Rho-GTPases are noteworthy, mediating proliferation and reorganization of actin cytoskeleton, being both disrupted in hairy cells. Former works from our laboratory have shown the underexpression in HCL cells of an atypical Rho-GTPase called RhoH, which reconstitution decreased malignant progression in both in vitro and in vivo models of HCL. In order to determine the molecular targets of RhoH, a microarray study was performed that showed underexpression of the cell surface marker CD38 while RhoH is overexpressed.Not only a differentiation marker of lymphocytes, CD38 is a pleiotropic molecule (being at the same time a receptor, an enzyme and an adhesion protein), which is important in B-cell development. It is also known as a bad prognosis marker in chronic lymphocytic leukemia and a therapeutic target in multiple myeloma. Its role in Hairy Cell Leukemia has not been studied yet, despite its expression in one third of HCL patients.The work presented in this thesis deals with, on the one hand, the study of the regulation of CD38 gene by RhoH in HCL, on the other hand, the impact of CD38 protein on HCL progression. Preliminary data seem to indicate a potential role of Smad1 transcription factor in this mechanism of regulation of CD38 by RhoH. Thanks to genome editing technology, we produced two HCL cell lines knock out for the CD38 gene. These models allowed us to prove that CD38 enhances hairy cells survival and adhesion to endothelium, and modulates their migratory features in vitro. We also showed that CD38 promotes disease progression in vivo in an HCL xenograft mouse model. Finally, data from our collaborators indicated that CD38 is a bad prognosis marker for HCL relapses and could be a potential therapeutic target.Mimicking RhoH effects for therapeutic purposes would be somewhat tricky. Targeting CD38 seems an interesting alternative, as RhoH underexpression favours CD38 expression, which is deleterious for patients by enhancing malignant progression. As therapeutic monoclonal antibodies targeting CD38 are already used in clinics to treat other leukemias, this work brings the evidence of their potential usefulness against refractory HCL cases expressing this marker.

Le facteur hétérotrimérique e/aIF2 joue un rôle central dans le démarrage de la traduction chez les Eucaryotes et chez les Archées. Il conduit l'ARNt initiateur méthionylé jusqu'au ribosome et assure la spécificité de sélection du codon de démarrage sur l'ARNm. La structure cristallographique d'aIF2de l'archée Pyrococcus abyssi, précédemment résolue au laboratoire, a révélé une très forte homologie entre aIF2γ, qui constitue le coeur de l'hétérotrimère, et le facteur d'élongation bactérien EF1A. Cependant, possède des caractéristiques structurales propres qui pourraient être responsables de sa spécificité d'action dans le démarrage de la traduction. Une étape cruciale de ce travail a consisté à développer un test de suivi in vitro de l'association d'aIF2 au Met-ARNti Met. Ce test a permis d'évaluer l'importance des caractéristiques du Met-ARNti Met et la contribution de chacune des sous-unités de l'hétérotrimère dans la formation du complexe aIF2:Met-ARNti Met. Ainsi, il a été montré que le résidu méthionine constitue un déterminant majeur dans la reconnaissance du Met-ARNti Met par aIF2. D'autre part, il apparaît que la sous-unité seule est effectivement capable de lier l'ARNt selon un mode similaire à celui observé pour EF1A mais avec une affinité considérablement réduite par rapport à celle de l'hétérotrimère. Nous avons montré que la présence de la sous-unité αétait nécessaire pour retrouver une affinité optimale vis-à-vis de l'ARNt tandis que la sous-unité βne semble pas jouer de rôle dans cette liaison. L'utilisation d'une stratégie de découpage d'en domaines séparés a montré que c'est le domaine 3 d'aIF2qui lie la sous-unité par l'intermédiaire d'une boucle du domaine 2 de . De plus, le dimère D3semble nécessaire et suffisant pour retrouver une affinité pour l'ARNt comparable à celle du facteur natif. Dans un second temps, des cristaux de la sous-unité entière et d'une forme tronquée correspondant aux domaines 2 et 3 ont été obtenus. Les structures d'D2-3 et d'complet ont été résolues à respectivement 2.26 et 3.37 Å de résolution. L'analyse du modèle structural a révélé une mobilité du domaine 3 d'αpar rapport au bloc rigide formé par les domaines 1 et 2. La comparaison de séquences d'e/aIF2a montré que les zones de conservation d'se situaient principalement dans le domaine 1 et dans le domaine 3 de la protéine, qui possèdent tous les deux des propriétés générales de liaison des ARNs. Le domaine 1 d'αpourrait ainsi interagir avec un autre partenaire de type ARN du démarrage de la traduction, tel que l'ARNm ou l'ARN ribosomal. Finalement, des cristaux d'aIF2de Sulfolobus solfataricus ont été obtenus et la structure de l'hétérodimère a été résolue à 3.0 Å. Cette structure a confirmé les données biochimiques précédemment obtenues : le domaine 3 de la sous-unité interagit avec le domaine 2 de , au niveau de la boucle L1 précédemment caractérisée. L'analyse de cette structure a révélé pour la première fois une conformation des régions Switch de similaire à celle observée au sein du complexe EF1A:GDPNP:ARNt, ce qui permet d'expliquer la GTPdépendance de la fixation du Met-ARNti Met par aIF2. La comparaison de cette structure à celle d'EF1A suggère que seule γpourrait être en contact avec l'ARNt au sein de l'hétérodimère αγ. Le renforcement de l'affinité pour l'ARNt observé en présence d'αnous a conduit à envisager un rôle possible d'αdans l'établissement des conformations observées pour les régions Switch dans la structure d'aIF2γ.