Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la classe de récepteurs la plus nombreuse et la plus étudiée. La compréhension du mode de fonctionnement de cette famille de récepteurs fait l'objet d'études intenses, tant au niveau de leur interaction avec le ligand qu'au niveau du processus d'activation suite à cette liaison. Le récepteur de l'U-II (UT) est un membre de la classe A des GPCRs et possède toutes les caractéristiques de cette famille. Notre hypothèse est que le récepteur UT possède des déterminants moléculaires identifiables qui sont impliqués lors de sa liaison à l'U-II et de son activation. Dans un premier temps, des études de marquage par photoaffinité du récepteur UT ont été effectuées en utilisant deux séries de ligands U-II qui contiennent le résidu photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) et qui possèdent un caractère agoniste ou agoniste partiel. Il a été montré pour les deux séries de ligands que les quatre premiers résidus de l'U-II sont à proximité du résidu Met288 dans la 3e boucle extracellulaire du récepteur UT. Cette approche a également été utilisée pour comparer le patron de photomarquage entre deux ligands contenant le Bpa à la position 6, soit de l'analogue agoniste complet avec celui de l'analogue agoniste partiel. Il a été montré que le peptide agoniste photomarque les résidus Met184/Met185 du TMD4 de l'UT, tandis que l'agoniste partiel photomarque plutôt une région délimitée au TMD5. Le deuxième objectif du projet a été l'identification, au moyen de l'approche SCAM (Substituted Cysteine Assessibility Method) de résidus qui bordent la pochette de liaison du récepteur. Chacun des résidus des domaines transmembranaires 6 et 7 ont été mutés, un à un, par une cystéine. Suite au traitement par des composés MTS, la liaison du ligand [indice supérieur 125]I-U-II aux mutants F268C[indice supérieur (6.44)], W278C[indice supérieur (6.54)] et A282C[indice supérieur (6.58)] du TMD6 ainsi qu'aux mutants L298C[indice supérieur (7.34)], Y300C[indice supérieur (7.36)], T302C[indice supérieur (7.38)] et T303C[indice supérieur (7.39)] du TMD7 a été inhibée, démontrant que ces positions du récepteur font face à la pochette de liaison. L'ensemble de ces études mène à une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison et de l'activation du récepteur UT et nous a permis de proposer un modèle moléculaire du récepteur UT ligandé. Ce modèle pourra ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du processus de liaison et d'activation des GPCRs peptidergiques de la classe A.

La symbiose mycorhizienne à arbuscules (MA) est une association bénéfique établie entre les membres d'un ancien sous-phylum de champignons, les Gloméromycètes, et les racines de la majorité des plantes terrestres. Les champignons MA procurent de l'eau et des minéraux (azote et phosphore principalement) à leur plante hôte et obtiennent de cette dernière des molécules carbonées sous forme d'hexoses et de lipides. Des études récentes ont montré que certaines protéines sécrétées par les champignons MA peuvent être des régulateurs importants de l'association (Kloppholz et al., 2011 ; Tsuzuki et al., 2016). Notre objectif était d'identifier de nouvelles protéines fongiques contribuant à la mise en place de la symbiose. Des protéines prédites pour être préférentiellement sécrétées par le champignon MA Rhizophagus irregularis dans les racines ont été identifiées au début de ma thèse (Kamel et al., 2017). Certaines d'entre-elles présentaient une structure ressemblant aux précurseurs de phéromones sexuelles d'Ascomycètes. Ces protéines sont connues pour être maturées dans les voies de sécrétion en petits peptides qui sont ensuite sécrétés. Leur reconnaissance par un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) aboutit à la fusion cellulaire de deux types sexuels opposés. Dans le cas de R. irregularis, seule la reproduction clonale a été décrite, mais des données génomiques récentes remettent en question son statut d'organisme asexué (Ropars et al., 2016). Une grande partie de ma thèse a été dédiée à la caractérisation fonctionnelle de ce type de peptides chez R. irregularis. Nous avons montré que deux peptides étaient effectivement produits et sécrétés par R. irregularis. L'utilisation de peptides synthétiques nous a permis de mettre en évidence que l'un d'eux stimulait la colonisation de M. truncatula mais était également perçu par le champignon lui-même, induisant la transcription de son propre gène précurseur et d'un GPCR. Ce peptide stimulateur de la symbiose est composé de seulement trois acides aminés et il peut être produit à partir de trois précurseurs protéiques. Par des approches de génétique inverse (HIGS et VIGS), nous avons confirmé l'importance de ces précurseurs dans l'établissement de la symbiose.[...] / Arbuscular Mycorrhizal (AM) symbiosis is a beneficial association established between members of an ancient subphylum of fungi, the Glomeromycotina, and the roots of the majority of terrestrial plants. AM fungi provide water and minerals (mainly nitrogen and phosphorus) to their host plant in exchange for organic carbon in the form of hexoses and lipids. Recent studies have shown that certain proteins secreted by AM fungi are important symbiosis regulators (Kloppholz et al., 2011, Tsuzuki et al., 2016). Our aim was to identify new fungal proteins involved in the establishment of symbiosis. Proteins predicted to be preferentially secreted by the AM fungus Rhizophagus irregularis in the roots were identified at the beginning of my thesis (Kamel et al., 2017). We noticed that some of them had a structure resembling the sex pheromone precursors of Ascomycota. These proteins are known to be processed in the secretory pathway into small peptides which are then secreted. Their recognition by a G protein-coupled receptor (GPCR) leads to cell fusion of two opposite sex types. In the case of R. irregularis, only clonal reproduction has been described. However, recent genomic data question its status as an asexual organism (Ropars et al., 2016). A large part of my thesis was dedicated to the functional characterization of this type of processed peptides in R. irregularis. We show that two of them are actually produced and secreted by R. irregularis. Treatments with synthetic forms of these peptides revealed that one of them stimulated the colonization of M. truncatula but was also perceived by the fungus itself, inducing the transcription of its own precursor gene and of a GPCR gene. This symbiosis-stimulating peptide is composed of only three amino acids and can be produced from three different protein precursors. Using reverse genetics (HIGS and VIGS), we confirmed the importance of these precursors in the symbiosis establishment. [...]

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