Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme. / Transport and local translation of RNA are found in several organisms and are required for multiple phenomena such as memory, asymmetric cell division and establishment of the axis during development. Staufen, a double-stranded RNA binding protein, was first identified in Drosophila melanogaster. In the fruitfly, it was shown that Staufen is required for the proper localization of the bicoid and oskar transcripts to the anterior and posterior ends of the oocyte, respectively. It was also found that Staufen is important for the translational derepression of oskar once it is adequately localized. In mammals, Stau1 is a ubiquitous protein found in granules in the dendrites of neurons. Also, Stau1 can bind the ribosome in a RNA-independent manner and cofractionates with both ribosomal subunits in a sucrose gradient. The implication of Stau1 in a mechanism allowing translational derepression of certain RNAs in mammals was therefore an interesting path to explore. Accordingly, we decided to verify if mammalian Stau1 had the capacity to stimulate the translation of cellular RNAs through a regulated mechanism. When this thesis was initiated, no cellular RNA target of Stau1 had been identified in mammals. Therefore, double-stranded RNA structures were used to repress the translation of a reporter mRNA. With this model, we showed that Stau1 can stimulate the translation of a transcript when it is bound to its 5’ UTR. With the use of DNA microarrays, we identified cellular mRNAs which distribution in heavy polysomes was altered by Stau1. When Stau1 is overexpressed, this group of mRNAs is enriched heavy polysomes, suggesting a translational stimulation of this population by Stau1. To identify a regulatory mechanism that could influence Stau1’s translational activity, we studied the self-association capacity of this protein. We showed that Stau1, like several double-stranded RNA binding proteins, can self-associate in a RNA-independent manner. We have identified the determinants required for this interaction that as the potential to be important for the regulation of the cellular activities of Stau1. The results presented in this thesis suggest that Stau1 can stimulate the translation of a specific subset of mRNAs in the cell, letting us look at Stau1’s implication in different processes from a new point of view.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire. / Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire. / The various mecanisms of post-transcriptional regulation of gene expression are more and more recognized as essential processes in diverse important physiological phenomenons, like cell proliferation and the DNA damage response (DDR). Two of the proteins implicated in this type of regulation are Staufen1 (Stau1) and Staufen2 (Stau2). They are double-stranded RNA binding proteins contributing to messenger RNA (mRNA) transport, translation control, alternative splicing and are responsible for the degradation of some specific mRNAs. The Staufen proteins are indeed able to associate with particular mRNAs. Interestingly, Stau1 and Stau2 predominantly form complexes with different targets. Recent evidences show the implication of various post-transcriptional regulation mecanisms in the DDR, moreover several RNA binding proteins are involved. Importantly, this response dictates one or several cell fates following damage to the integrity of the cell’s DNA: DNA repair, cell proliferation arrest, apoptosis. We hypothesized that Stau1 and/or Stau2 expression could be affected in response to genotoxic stress, which could consequently modulate the expression and/or the stability of their mRNA targets. Also, our laboratory has recently observed that Stau1 expression varies during the cell cycle. It is elevated up to the beginning of mitosis (prometaphase) and it decreases as cells complete their division. We therefore hypothesized that Stau1 could differentially bind mRNAs in cells blocked in prometaphasis and in asynchronous cells. On the one hand, by using camptothecin (CPT), a DNA damaging agent, to treat cells from the colorectal cancer cell line HCT116, we observed that only the expression of Stau2 is considerably reduced, both at the level of the protein and that of the mRNA. The use of other cytotoxic agents allowed us to confirm this initial observation. We also noted that Stau2 expression is down-regulated even in conditions that do not induce apoptosis, suggesting that the decrease in Stau2 expression may be required for a proper DDR. Indeed, Stau2 overexpression together with the CPT treatment causes a delay in apoptosis induction in HCT116 cells. We also showed that Stau2 down-regulation is due to the regulation of its transcription in response to the genotoxic stress, which necessitates a minimal region in Stau2’s putative promoter. Besides, we identified the E2F1 transcription factor, commonly implicated in the DDR, as a regulator of Stau2 expression. E2F1 thus stimulates an increase in Stau2 expression in non-treated cells, but this up-regulation is abolished in CPT-treated cells, which suggests that CPT could act by inhibiting Stau2 transcriptional activation by E2F1. Finally, we observed that some Stau2-associated mRNAs, which code for proteins implicated in the DDR and apoptosis, are differentially expressed in CPT-treated cells compared to non-treated cells. On the other hand, we identified Stau1-associated mRNAs during prometaphase, when Stau1 expression is at its highest level in the cell cycle, by performing a large-scale study using DNA microarrays in HEK293T cells. We subsequently confirmed the association between Stau1 and some mRNAs of interest, mainly coding for proteins involved in the regulation of cell proliferation and/or mitosis progression. A comparison of the association between Stau1 and these mRNAs in prometaphase-blocked cells with that in asynchronous cells allowed us to notice a preferential association in prometaphase-blocked cells. This suggests a potential increase of the regulation of these mRNAs by Stau1 at that point of the cell cycle. The data presented in this thesis indicate that in all likelihood the post-transcriptional regulation of gene expression controlled by the Staufen proteins happens in part thanks to the modulation of Stau1 and Stau2 expression according to the cellular conditions. We then contemplate that this fluctuation in Staufen proteins expression has consequences on mRNA subsets with which they associate, and that this may mean they have an important role to play in regulating essential physiological processes like DDR and cell cycle progression.

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Le transport et la traduction localisée des ARN messagers sont observés chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phénomènes tels la mémoire, la division cellulaire asymétrique et l’établissement des axes durant le développement. Staufen, une protéine liant l’ARN double-brin, a été identifié dans un premier temps chez la mouche à fruits Drosophila melanogaster. Il a été montré, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux pôles antérieur et postérieur de l’ovocyte, respectivement. Également, Staufen est requis afin que la répression traductionnelle du messager oskar soit levée une fois qu’il est bien localisé. Chez les mammifères, Stau1 est une protéine ubiquiste qui est présente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. Également, Stau1 peut interagir de façon indépendante de l’ARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unité 40S qu’avec la sous-unité 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. L’implication de Stau1 dans un mécanisme permettant la dérépression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifères était donc une voie d’investigation intéressante. Nous avons donc décidé de vérifier si Stau1 mammifère avait la capacité de stimuler la traduction d’un ARNm cellulaire via un mécanisme régulé. Au moment où cette thèse a été entreprise, aucun ARNm cellulaire lié par Stau1 n’avait été identifié chez les mammifères. Des structures d’ARN double-brin ont donc été employées afin de réprimer la traduction d’un ARNm rapporteur. C’est ainsi que nous avons montré que Stau1 peut stimuler la traduction d’un ARNm lorsqu’il lie celui-ci dans sa région 5’ non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces d’ADN, nous avons identifié des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifiée par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite à une surexpression de Stau1, ce qui suggère que Stau1 stimule la traduction de cette population d’ARNm. Afin d’identifier un mécanisme potentiel de régulation de l’activité traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intéressés à la capacité d’auto-association de cette protéine. Nous avons montré que Stau1, tout comme plusieurs protéines liant l’ARN double-brin, est en mesure de s’associer à lui-même, et ce, d’une façon indépendante de l’ARN. Nous avons identifié les déterminants impliqués mettant ainsi au jour un nouveau mécanisme pouvant influencer les activités cellulaires de Stau1. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction d’une sous-population précise d’ARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur l’implication de cette protéine dans divers phénomènes au sein de l’organisme. / Transport and local translation of RNA are found in several organisms and are required for multiple phenomena such as memory, asymmetric cell division and establishment of the axis during development. Staufen, a double-stranded RNA binding protein, was first identified in Drosophila melanogaster. In the fruitfly, it was shown that Staufen is required for the proper localization of the bicoid and oskar transcripts to the anterior and posterior ends of the oocyte, respectively. It was also found that Staufen is important for the translational derepression of oskar once it is adequately localized. In mammals, Stau1 is a ubiquitous protein found in granules in the dendrites of neurons. Also, Stau1 can bind the ribosome in a RNA-independent manner and cofractionates with both ribosomal subunits in a sucrose gradient. The implication of Stau1 in a mechanism allowing translational derepression of certain RNAs in mammals was therefore an interesting path to explore. Accordingly, we decided to verify if mammalian Stau1 had the capacity to stimulate the translation of cellular RNAs through a regulated mechanism. When this thesis was initiated, no cellular RNA target of Stau1 had been identified in mammals. Therefore, double-stranded RNA structures were used to repress the translation of a reporter mRNA. With this model, we showed that Stau1 can stimulate the translation of a transcript when it is bound to its 5’ UTR. With the use of DNA microarrays, we identified cellular mRNAs which distribution in heavy polysomes was altered by Stau1. When Stau1 is overexpressed, this group of mRNAs is enriched heavy polysomes, suggesting a translational stimulation of this population by Stau1. To identify a regulatory mechanism that could influence Stau1’s translational activity, we studied the self-association capacity of this protein. We showed that Stau1, like several double-stranded RNA binding proteins, can self-associate in a RNA-independent manner. We have identified the determinants required for this interaction that as the potential to be important for the regulation of the cellular activities of Stau1. The results presented in this thesis suggest that Stau1 can stimulate the translation of a specific subset of mRNAs in the cell, letting us look at Stau1’s implication in different processes from a new point of view.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire. / Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.

Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire du système immunitaire qui, lorsque sa production est déréglée, induit de nombreuses pathologies chez l’homme (cachexie, arthrite rhumatoïde, etc.) Outre une régulation transcriptionnelle de cette cytokine, il existe aussi une régulation post-transcriptionnelle permettant un contrôle affiné de sa production. Le laboratoire de Biologie du Gène étudie cette régulation post-transcriptionnelle faisant intervenir une séquence consensus dans l’ARNm appelée séquence AU-riche (ou ARE pour AU-rich element) et les protéines qui y sont impliquées. Généralement, les ARNm porteurs d’ARE codent pour des protéines dont l’expression est transitoire. Ces gènes requièrent un contrôle très précis de leur expression et c’est pourquoi, en plus d’être soumis à de nombreux contrôles transcriptionnels, la traduction et la stabilité de leurs ARNm sont très finement régulées. La réponse immune innée implique de nombreux ARNm de ce type. Jusqu’à présent, la fonction de la protéine TIAR dans la régulation de l’expression du TNF-α n’a pas été complètement élucidée. Outre le TNF-α, la participation à la réponse immune innée de nombreuses protéines encodées par des ARNm porteurs d’ARE pourrait conférer à la protéine TIAR un rôle de régulateur essentiel dans le contrôle de l’inflammation. Nous avons donc générés plusieurs lignées de macrophages RAW 264.7 surexprimant la protéine TIAR entière ou différents mutants de TIAR afin de déterminer, par une analyse globale par puces à ADN, les ARNm cibles de TIAR au cours de la réponse immune. Cette approche nous a permis de démontrer que la protéine TIAR exerce un contrôle sur le métabolisme de l’ARNm du TNF-α et de MKP-1 (MAP kinase phosphatase 1), une phosphatase majeure dans la voie de signalisation de la MAPK p38. Cette voie de signalisation joue un rôle essentiel dans la stabilisation et la traduction de nombreux ARNm porteurs d’ARE encodant des protéines de la réponse inflammatoire. D’autre part, nous avons voulu étudier in vivo la fonction de la protéine TIAR au cours de la réponse immune. Nous avons, dans ce but, généré des souris transgéniques surexprimant l’isoforme courte de la protéine TIAR. Si nous n’avons pas encore pu mesurer les effets d’une surexpression de TIAR sur la réponse inflammatoire chez ces souris, ces individus transgéniques ont révélé qu’une expression anormale de la protéine TIAR induit une létalité importante au cours du développement embryonnaire. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La protéine CIRP (Cold Induced RNA binding Protein) est une petite protéine de liaison à l’ARN de 172 acides aminés, qui est constituée du côté amino-terminal d’un domaine de liaison à l’ARN de type RRM (RNA recognition motif), et d’une partie carboxy-terminale riche en glycine et arginine qui comprend plusieurs motifs RGG. Elle a été identifiée comme étant inductible par hypothermie mais aussi par irradiation aux UV et par hypoxie. Nous avons analysé son expression et sa localisation en réponse à différents stress cellulaires. Nous avons montré qu’un traitement à l’arsénite qui induit un stress oxydant n’altère pas l’expression de CIRP provoque sa localisation dans les granules de stress (SG). Les SG sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques contenant des complexes de pré-initiation incompétents pour la traduction, et qui s’accumulent dans les cellules exposées à un stress. Ces structures constituent des sites de triages des ARNm, dans lesquels les ARNm sont soit stockés en attente d’une réinitiation de la traduction une fois le stress surmonté, soit destinés à être dégradés. La protéine CIRP se localise dans les SG que ce soit suite à un stress cytoplasmique ou du réticulum endoplasmique. Nous avons montré également que la localisation de la protéine CIRP dans les SG se déroule indépendamment de la présence de la protéine TIA-1 qui a été décrite comme responsable de l’assemblage des SG. De plus la surexpression de la protéine CIRP conduit à la formation de SG. Nous suggérons donc qu’il existe plusieurs voies qui mènent à l’assemblage de ces structures. En outre, nous avons analysé la localisation de mutants par délétion de la protéine CIRP et avons montré que le domaine RRM et le domaine RGG peuvent indépendamment localiser la protéine dans les SG. Par contre, la méthylation des résidus arginine du domaine RGG est une modification nécessaire à la localisation de CIRP dans les SG. Ensuite, nous avons étudié la fonction de la protéine CIRP dans le métabolisme des ARN messagers. Nous avons montré par une méthode d’adressage, que CIRP est un répresseur de la traduction des ARNm et que le domaine carboxy-terminal est nécessaire et suffisant à cette fonction. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le complexe de pores nucléaires est le seul point d'entrée et de sortie du transport nucléocytoplasmique. Le panier nucléaire, l'un de ses principaux composants, s'est avéré impliqué dans la régulation des gènes et pourrait jouer un rôle majeur dans le contrôle de la qualité de l'export d'ARNm. Cependant, on sait peu de choses sur le fonctionnement du panier dans l'export nucléaire et la régulation des gènes. La principale composante structurelle du panier, la TPR (Translocated Promoter Region), est considérée comme l'acteur principal de la fonction de contrôle de la qualité du panier. Il reste à établir par quel mécanisme cette protéine assure la sélection des mRNP compétentes pour l'exportation. Malgré son implication connue dans le contrôle de la qualité des mRNP, l'exportation et la maturation, des questions demeurent: que fait vraiment le panier, qu'est-ce qui définit le contrôle qualité, comment le panier nucléaire est-il capable d'identifier l'ARN qui n'est pas compétent pour l'exportation et quels sont les rôles de différentes protéines composant le panier nucléaire. Récemment, il a été montré que la protéine TPR est présente dans deux populations, l'une dans le nucléoplasme et l'autre liée au NPC. Nos études préliminaires utilisant FRAP (Fluorescence Recorvery After Photobleaching) et la microscopie à molécule unique montrent que les molécules nucléoplasmiques de TPR ne sont pas impliquées dans un échange rapide avec les molécules assemblant avec les paniers ancrés au NPC et présentent différentes sous-populations basées sur la diffusion. L'analyse de études protéomiques préliminaires de notre laboratoire a révélé que l’interactome de TPR présente un enrichissement inattendu en protéines impliquées dans la maturation de l'ARNm, notamment l'épissage et les facteurs de traitement de l'extrémité 3'. Ces résultats pourraient suggérer des interactions complexes des nouvelles fractions nucléoplasmiques de TPR avec la machinerie de maturation des ARNms et nous amènent à poser les questions suivantes : Quelle est la fonction de la protéine du panier TPR lorsqu'elle n'est pas associée au NPC, et la TPR nucléoplasmique participe-t-elle au métabolisme de l'ARN nucléaire, reliant potentiellement les processus nucléaires au contrôle de la qualité au NPC? Mon projet s'est concentré sur l'étude des fonctions et de la dynamique de la protéine du panier nucléaire TPR à l'aide de techniques d'imagerie fluorescente en cellule vivante et de suivi de protéine unique. Nous avons pu identifier la dynamique et la localisation des différentes populations de TPR à partir des profils de diffusion de leurs trajectoires, qui peuvent être réparties en 5 catégories : Dirigée, Brownienne, Restreinte, Confinée et Butterfly. Nos données suggèrent que les trajectoires confinées pourraient être liée à l’association de TPR à la chromatine tandis que les browniennes représenteraient les molécules de TPR diffusant librement dans le noyau. De plus, nous avons constaté que les trajectoires dirigées et restreintes pourraient être liées à la maturation de l'ARN vu que ces deux sous-populations de TPR sont les plus affectées lorsque la transcription est inhibée. Également, en absence de la transcription par l’ARN polymérase II, TPR forme des granules dans le nucléoplasme, suggérant son implication durant la transcription active. Ainsi, notre étude montre que la fraction nucléoplasmique du TPR est subdivisée en fractions non associées aux pores hétérogènes qui pourraient jouer plusieurs rôles dans le métabolisme de l'ARN et la qualité de l'export. / The nuclear pore complex is the only entry and exit point for the nucleocytoplasmic transport. The nuclear basket, one of its main components, was shown to be involved in gene regulation and could play a major role in quality control of mRNA export. However, little is known on how the basket functions in nuclear export and gene regulation. The main structural component of the basket, TPR (Translocated Promoter Region), is thought to be the main actor in the quality control function of the basket. It is yet to be establish by which mechanism this protein ensures the selection of competent mRNPs for export. With all these involvement of the basket in quality control, export, and maturation, one question remains: What is the basket really doing, what defines quality control, how the nuclear basket can identify RNAs that aren’t competent for export, and what are the roles of the different proteins that make up the basket. Recently it was shown that TPR is present in two populations, one in the nucleoplasm and another bound at the NPC. Our preliminary studies using FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and single molecule microscopy shows that the nucleoplasmic TPR molecules aren’t exchanging with the baskets anchored at the NPC and present different subpopulations based on diffusion. Analysis of preliminary proteomics studies from our laboratory revealed an interactome with an unexpected enrichment of proteins involved in mRNA maturation notably splicing and 3’ end processing factors. These results imply complex interactions of the new fractions of TPR and lead us to ask these following questions: What is the function of the basket protein TPR when it is not associated with the NPC, and does nucleoplasmic TPR participate in nuclear RNA metabolism, potentially linking nuclear processes to quality control at the NPC? My project focused on investigating the functions and dynamics of the nuclear basket protein TPR using fluorescent live-cell and single-protein imaging techniques. We were able to identify the dynamics and localization of the different populations of TPR based on the diffusion profiles of their trajectories, which can be divided in 5 categories: Directed, Brownian, Restricted, Confined and Butterfly. Our data suggest that the confined population might be linked to chromatin association of TPR, whereas the Brownian would represent the free diffusing TPR molecules in the nucleus. We further found that the Directed and Restricted trajectories could be linked to RNA maturation as these two subpopulations of TPR are most affected when transcription is inhibited. Moreover, in absence of transcription, TPR forms granules in the nucleus, suggesting its implication during active transcription. Altogether, our study shows that the nucleoplasmic fraction of TPR is subdivided in heterogenous diffusive fractions that could play several roles in the metabolism of RNA and quality of export

Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit. / The epithelial sodium channel (ENaC) expressed in alveolar epithelial cells plays a major role for lung liquid clearance at birth and lung edema resorption in adulthood. The expression and activity of ENaC are inhibited by many pathophysiological stress that could have an impact in the clinical outcome of acute respiratory distress syndrome (ARDS). Pulmonary inflammation is an important factor in this inhibition that may promote or sustain pulmonary edema. We have previously shown that pro-inflammatory cytokines and lipopolysaccharide (LPS) from Pseudomonas aeruginosa inhibit αENaC mRNA expression by transcriptional and post-transcriptional mechanisms, suggesting that a modulation of αENaC mRNA stability could play a role in this process. The main objective of the present work was to characterize how different pathophysiological stress affect αENaC mRNA expression in alveolar epithelial cells and determine whether this modulation could be explained in part by regulating the stability of the transcript. Our study shows that LPS and cycloheximide decrease the level of αENaC mRNA with a similar time course and via the activation of the MAPK ERK1/2 and p38 signaling pathways. Despite similarities, there were important differences in the mechanisms involved in the modulation of αENaC mRNA expression. While LPS repress αENaC mRNA transcription, cycloheximide triggers post-transcriptional mechanisms involving the 3' untranslated region (3'UTR) of αENaC mRNA. To further study the role of αENaC 3'UTR in this process, we developed a Tet-Off model that allows us to measure the half-life of αENaC mRNA regardless of the use of a transcription inhibitor such as actinomycin D (Act. D). Using this system, we showed a 100 min half-life for αENaC mRNA, a much shorter time then the one reported for this mRNA using Act. D. We showed that Act. D has an important stabilizing effect on αENaC mRNA and cannot be used to assess the stability of the transcript. Using deletion mutants of the αENaC 3'UTR region, we determined how different portions of 3'UTR were important in modulating stability of the transcript. We found that the 3'UTR has dual functions, with portions important to promote stabilization (proximal 3'UTR) and others that strongly destabilize (distal 3'UTR) the transcript. Our system also allowed us to confirm that the decreased expression of αENaC mRNA induced by TNF-α results in part by a decreased stability of the mRNA. Finally, we identified several RNA-binding proteins that interact specifically with αENaC 3'UTR and determined if these proteins had an impact on transcript stability. Surexpression of two of these proteins in alveolar epithelial cells, DHX36 and TIAL1 was able to decrease the level of αENaC mRNA via a downregulation of mRNA stability. The work presented here shows the complexity of the signal transduction pathways elicited by different pathological stress conditions in alveolar epithelial cells and is the first to show that αENaC mRNA stability elicited by sequences in 3’UTR plays an important role in modulating the level of the transcript. The Tet-Off model that we developed allows to accurately estimate the half-life of αENaC mRNA and shows that the 3’UTR portion of the mRNA plays a complex role in the modulation of transcript stability in basal and pro-inflammatory conditions. Finally, we identified two putative RNA-binding proteins able to specifically recognize αENaC 3’UTR and modulate the transcript stability.