Leishmania est un parasite protozoaire dimorphique causant la leishmaniose à travers le monde. Puisque aucune régulation transcriptionnelle n'a été décrite chez ce parasite, l'étude de la régulation de la traduction est devenue essentielle. Il a été décrit chez les eucaryotes supérieurs que le facteur d'initiation de la traduction, eIF2[alpha], lorsqu'il est phosphorylé en condition de stress, est capable d'inhiber la traduction. Les objectifs de ce travail étaient de 1) déterminer si le facteur eIF2[alpha] est phosphorylé chez Leishmania au cours de la différenciation ou à la suite de certains stress et 2) de caractériser une des eIF2[alpha] kinases, la PKR. Cette kinase est activée, entres autres par la présence d'ARN double brins et s'autophosphoryle. Par des expériences d'immunoprécipitation, de précipitation à l'aide d'ARNdb et d'immunobuvardage, il semble que, dans les deux cas (le facteur eIF2[alpha] et la kinase PKR), soit majoritairement phosphorylés au stade amastigote intracellulaire du parasite. Les stress de pH et de température, qui mimiqueraient l'environnement du macrophage, et de la drogue thapsigargine, qui induit un stress du RE, ne semblent pas affecter l'expression de ces facteurs mais auraient un effet sur leur phosphorylation. De plus, ces protéines sont aussi associées particulièrement aux monosomes suggérant un rôle dans l'initiation de la traduction.

Les changements des niveaux d'expression au cours de l'évolution sont d'une grande importance biologique et sont notamment influencés par des évènements récurrents de duplication de gènes. Ce projet de maîtrise visait donc à caractériser et à expliquer la divergence d'expression à l'intérieur des paires de paralogues de la levure Saccharomyces cerevisiae, qui en possède des centaines. Étant donné que l'abondance d'une protéine reflète l'effet combiné de la transcription et de la traduction, nous nous sommes intéressés à l'évolution de l'efficacité de ces deux processus. L'analyse d'un ensemble de données publié a révélé une prédominance de la divergence transcriptionnelle chez les gènes dupliqués. De tels patrons d'évolution pourraient être dus à l'effet de la sélection, ou encore à un biais dans l'apparition des mutations. Nous avons donc considéré deux causes potentielles : un compromis évolutif récemment décrit entre le coût et la précision de l'expression ainsi qu'une plus grande fréquence - ou de plus grands effets - des mutations agissant sur la transcription. L'évolution in silico de paires de paralogues a montré que l'un et l'autre de ces mécanismes pourraient expliquer la divergence observée. Nous avons aussi exploré l'impact potentiel d'une variété de contraintes mutationnelles, soulignant ainsi l'importance de les mesurer afin de comprendre l'évolution de l'expression génique. En mettant en évidence que les paralogues divergent principalement au niveau de la transcription, ces travaux contribuent à améliorer notre compréhension de l'évolution de l'expression génique et du rôle qu'y jouent les duplications de gènes, tout en identifiant plusieurs directions futures de recherche. / Expression level changes throughout evolution are of great biological significance and for instance occur through recurrent gene duplication events. This project's objective was thus to characterize and explain the expression divergence within the paralog pairs of the yeast Saccharomyces cerevisiae. As the cellular abundance of a protein is influenced by both transcription and translation, we studied these two processes. The analysis of a published set of transcription and translation efficiencies first revealed that the divergence of yeast duplicates was mostly transcriptional. Such evolutionary patterns could either be due to selection or to a mutational bias. Accordingly, we considered two potential causes: a recently described evolutionary trade-off between the cost and the precision of expression, and a higher frequency - or larger effects - for mutations acting on transcription. The in silico evolution of paralog pairs showed that both mechanisms are consistent with the observed divergence patterns. We also explored the potential impact of a few types of mutational constraints, thus underscoring the importance of measuring them to fully understand the evolution of gene expression. By highlighting that paralogs mostly diverge in transcription, this work improves our understanding of the evolution of gene expression, especially regarding how gene duplication contributes to it, while also identifying future research directions.

Au Canada, il est estimé qu’une personne sur deux sera diagnostiqué pour un cancer et qu’une personne sur quatre en décédera, faisant du cancer la première cause de mortalité (Statistiques canadiennes sur le cancer 2017. Toronto, ON: Société canadienne du cancer, 2017). La formation de métastases est la principale cause des décès puisqu’elle y est associée à 90%. Lors de ce processus, les cellules épithéliales cancéreuses quittent la tumeur primaire et envahissent les tissus distants après avoir subi la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT), ce qui leur permet d’accroître leur capacité migratoire. Plusieurs travaux ont montré un lien de causalité entre les protéines liant l’ARN et la progression tumorale. C’est le cas de l’étude qui a identifié les SICs (Spreading Initiation Centers), une structure transitoire présente lors de l’initiation de l’adhésion et défini comme présente uniquement dans les cellules mésenchymateuses. Nous proposons que les SICs contrôlent l’adhésion et la transition vers l’étalement cellulaire. Ainsi, nous avons cherché à caractériser cette structure et sa fonction. Nos données indiquent que la formation des SICs est contrôlée par l’activation de la voie RhoA et que son inhibition affecte leur formation et la consolidation de l’adhésion des cellules mésenchymateuses. Cette consolidation est liée au recrutement et à l’enrichissement spécifique de certaines protéines liant l’ARN, d’ARNm et d’un fort taux de traduction locale au niveau des SICs. De plus, nous montrons que lors de l’adhésion, une reprogrammation traductionnelle s’effectue afin de traduire des ARNm impliqués dans l’adhésion cellulaire. À l’aide d’une nouvelle méthode basée sur la puromycine, nous avons été capable d’identifier les protéines synthétisées lors de ce processus et avons montré que l’enrichissement de leur ARNm au niveau des SICs est dépendant de leur région 3’UTR. Enfin, l'inhibition de la traduction lors de l’adhésion diminue uniquement la capacité d’adhésion des lignées cellulaires mésenchymateuses et des cellules cancéreuses hautement métastatiques qui ont subi l’EMT. En conclusion, nous montrons que le métabolisme des SICs est régulé par leur capacité à traduire des ARNm spécifiques. Nous proposons que les SICs agissent comme un point de contrôle d’adhérence dans les cellules métastatiques leur permettant ainsi de moduler leur dissémination. / In Canada, one person out of two will be diagnosed with cancer and one out of four will die of it, making cancer the leading cause of death (Statistiques canadiennes sur le cancer 2017. Toronto, ON: Société canadienne du cancer, 2017). This is mainly caused by metastasis formation, which is associated to more than 90% of the death related to cancer. While majority of cancers mostly originates from epithelial tissues, pre-metastatic cancerous cells can only leave the primary tumor after undergoing the epithelial mesenchymal transition (EMT). This transition allows cancerous cell lines to increase their ability to migrate through the highly structured stroma, invade the blood stream in order to disseminate in distant tissues. Increasing studies have shown causality in between RNA binding protein (RBP) and tumor progression. Our discoveries strengthen this hypothesis, as our work on Spreading initiation center (SIC), a transient structure during early adhesion, showed that RBPs regulation translation regulates these structure during mesenchymal cells adhesion and spreading. We found that SICs formation is controlled by RhoA activation and its inhibition will affect their formation and adhesion consolidation of mesenchymal cells. This consolidation is done with recruitment and enrichment of specific RBPs, mRNA and a high level of local translation in SICs. We also showed translational reprograming events during early adhesion, allowing us to find adhesion-regulated translation of specific mRNAs known to be implicated in cellular adhesion. Using our specifically engineered methods based on puromycin incorporation capacities, we identified neosynthesized proteins during early adhesion, showing a distinct translational activity. This also led us to show a specific enrichment of the mRNA coding for the newly synthetized proteins, through 3’UTR, within SICs. Finally, we showed that translation inhibition decreased the adhesion ability of mesenchymal cells and highly metastatic cancerous cells that undergo EMT, while not affecting epithelial cells or non-metastatic ones. Taken together, we conclude that SIC-regulated mechanism regulate mesenchymal cell adhesion through their ability to translate specific RNA, and that SICs can act as an adhesion checkpoint for metastatic cells, thus modulating their ability to disseminate and form metastases.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / 5 vidéos en format mp4. MovieS1: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics formed on a typical MRC-5 cell adhering ; Movie S2A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, Untreated MRC-5 cell adhering ; MovieS2B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, MRC-5 cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS3A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, Untreated HeLa cell adhering ; MovieS3B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, HeLa cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS4: Time-lapse cell imaging of SIC inhibition and increased spreading of newly adhering MRC-5 cell treated with Y27632 (ROCK inhibitor). / La majorité des cancers proviennent du tissu épithélial. Lors de l'évolution d'une tumeur, les cellules cancéreuses épithéliales subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse afin d'amorcer la progression tumorale. La migration et l'adhésion cellulaire sont des processus biologiques essentiels à l'établissement de métastases, qui sont la principale cause de décès associés au cancer. Ainsi, cibler l'un ou l'autre de ces processus et affecter la progression tumorale pourrait potentiellement améliorer le pronostic. Mon projet de doctorat s'est donc penché sur les mécanismes de régulation de l'initiation de l'adhésion spécifiques aux cellules ayant subi une transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude de l'initiation de l'adhésion a mis en lumière une structure impliquée dans la maturation des adhésions focales, les spreading initiation centers (SICs). Les SICs se situent au-dessus de futurs sites de formation d'adhésions focales et sont composés de complexes ribonucléoprotéiques confinés sous une gaine d'actine. Parmi les protéines faisant partie des SICs, on retrouve plusieurs protéines impliquées dans l'adhésion, mais également plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous avons montré que les RBPs ainsi que les ARNm sont présents de façon enrichie dans les SICs, suggérant une traduction localisée. En effet, l'inhibition de la traduction freine l'adhésion spécifiquement chez les cellules de types mésenchymateuses et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse. Nous avons mis en lumière une régulation spatiotemporelle de la traduction, spécifique aux cellules mésenchymateuses. Au fil de l'adhésion, la machinerie traductionnelle est tout d'abord inhibée puis stimulée. Cette régulation spatiotemporelle permet une reprogrammation de la traduction vers une traduction localisée et spécifique de protéines impliquées dans la formation des adhésions focales. Nous avons montré que la régulation temporelle de la traduction est assurée par la phosphorylation de la sous-unité alpha de l'EIF2. L'inhibition de la traduction est donc un moyen direct d'étudier les différences dans l'initiation de l'adhésion entre les cellules épithéliales et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse lors de la progression tumorale. / Most cancers originate in epithelial tissue. Epithelial cancer cells then undergo an epithelial to mesenchymal transition to initiate tumor progression. Cell migration and adhesion are essential biological processes for metastasis formation. Metastases are the leading cause of cancer-associated deaths, so targeting any of these processes would greatly affect tumor progression, which could lead to a better prognosis. My doctoral project therefore centered on the mechanisms of regulation of adhesion initiation specific to cells that have undergone an epithelial to mesenchymal transition. The study of adhesion initiation has highlighted a structure involved in the maturation of focal adhesions called spreading initiation center (SIC). This structure has been shown to localize above the formation sites of focal adhesions and to be composed of ribonucleoprotein complexes confined under an actin sheath. Among the proteins identified as part of the SICs are several proteins involved in adhesion and several RNA binding proteins. We have shown that RNA binding proteins and mRNA are enriched within SICs, suggesting the presence of translational activity. We subsequently confirmed an enrichment in translation in the SICs during the initial phase of adhesion. Indeed, inhibiting translation only inhibits cellular adhesion in mesenchymal cells and in epithelial cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition. By further studying the translation dynamics during adhesion, we have highlighted a spatiotemporal regulation specific to mesenchymal cells. The translational machinery is first inhibited, after which there is an upsurge in translation. This spatiotemporal regulation allows a reprogramming of the translatome, inducing the specific translation of proteins involved in the formation of focal adhesions. We have shown that the temporal regulation of translation is regulated by the phosphorylation of the alpha subunit of eIF2. The initiation of translation is therefore an interesting target to study the differences between the adhesion initiation of epithelial cells and that of cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition during tumor progression.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

Durant sa croissance, l’ovule entrepose des organelles, des protéines et des ARNm dits maternels qui permettront de supporter les premières étapes du développement embryonnaire dans le but primordial d’activer le génome embryonnaire. Un ovocyte capable de supporter cette étape est dit compétent au développement embryonnaire. Le premier objectif avait pour but de déterminer des populations d’embryons ayant différents niveaux de compétence au développement. Le développement d’une nouvelle approche, la triple sélection consiste à utiliser en même temps deux caractères reliés à l’ovule tels que la taille d’origine de son follicule et la morphologie de son complexe cumulus-ovocyte, et un caractère relié à l’embryon, soit le temps du premier clivage. Les différentes populations générées par la sélection permettront ainsi la recherche des facteurs de compétence au développement. Le deuxième objectif avait pour but de connaître le protéome traduit de la traduction des ARNm maternels lors du développement embryonnaire, ainsi que de connaître les besoins constants en protéines de l’embryon, mais également de l’ovocyte, soit les protéines "housekeeping" maternels. Cette expérience a démontré clairement que suite à la reprise de la méiose (Coenen et al., 2004) et ensuite de la fécondation, la traduction des ARNm maternels présente un continuum d’évènements qui mène à l’activation du génome embryonnaire. Malgré un réservoir commun d’ARNm, les besoins lors de la maturation de l’ovocyte et lors du développement de l’embryon sont loin d’être les mêmes. Seulement une cinquantaine de protéines sont communément traduites lors de ces deux évènements cellulaires. Onze de ces protéines ont été identifiées : les protéines de choc thermique 71 et 70, la cyclophiline A (2 fois), la glutathione-S-transférase mu 5, la protéine épithéliale liant les acides gras, la 2,3-biphosglycérate mutase, la sous-unité epsilon TCP-1 de la chaperonine, l’ubiquitine carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, l’enzyme conjuguant l’ubiquitine E2D3 et l’isoforme alpha et gamma de l’actine. Le troisième objectif avait pour but de déterminer des facteurs de compétence au niveau de l’embryon à 2-cellules basé sur les populations observées lors de la triple sélection. Nous ii avons compris la traduction des ARNm maternels dans les embryons incompétents au développement. Ces derniers présentent une traduction basale des ARNm maternels, tandis que les plus compétents présentent bon nombre de protéines exclusives qui représentent des facteurs de compétence potentiels. Afin d’identifier ces facteurs de compétence, nous avons pu observer que les protéines traduites lors du développement embryonnaire ne sont que transitoires, observation supportée également par la seconde expérience. Les protéines ne s’accumulent pas dans le cytoplasme rendant ainsi leur identification très difficile. Malgré tout, six protéines ont été identifiées: la thiolase cytosolique, l’isocitrate déshydrogénase, la peroxiredoxine 6, la sous-unité alpha du proteasome-6 et la thiamine triphosphatase. Deux protéines « housekeeping » d’origine maternelle découvertes durant l’expérience précédente sont également moins présentes dans les embryons non compétents. De ces expériences de protéomique a découlé une nouvelle méthode de confirmation de l’identification des protéines, la confirmation in silico. Le génome et le protéome de Bos taurus étant limité, l’identification de nos protéines a souvent été faite soit chez d’autres espèces ou uniquement à partir de fragments d’ADN des banques de EST de Bos taurus. Cette méthode permet donc de reconstruire le messager bovin, d’en traduire la protéine bovine, d’identifier le patron peptidique théorique et de le comparer à nos résultats de séquençage, augmentant ainsi le recouvrement de notre protéine. En conclusion, la protéomique de la compétence au développement de l’ovocyte bovin a permis l’identification de candidats qui comparativement à la génomique sont plus restreints. Une nouvelle méthode a découlé de ces expériences. La confirmation in silico permet maintenant la confirmation des protéines identifiées sans utilisation de matériel supplémentaire. / During the growth and the maturation of the oocyte, organelles, proteins and mRNA known as maternal are stockpiled in order to prepare and supply material to the developing embryo in the main goal to activate the embryonic genome. An oocyte that is able to supply to this step is called developmental competent. The objective of the first experiment was to determine an embryos population with different level of developmental competence. The triple selection lies in two characters related to the oocyte, which are the follicular size and the morphology of the COC and one is related to the embryo, which is the time of first cleavage post insemination. The different population generated by this selection has provided a population highly competent to development and a population lacking developmental competence that will be useful for the study of developmental competence. The objective of the second experiment was the study of the proteomic of the translated maternal mRNA during the early embryo development. We wanted to know which proteins play the role of maternal housekeeping proteins during oocyte maturation and early embryo development. This experiment has clearly demonstrated that when the oocyte resume meiosis (Coenen et al., 2004) and after fertilization, the translated protein pattern follows a continuum events which conducts embryo to his activation. Although they are supply by the same reservoir of mRNA, the needs of the oocyte and the embryo are different. Only about fifty proteins are commonly translated during oocyte maturation and early development. Eleven of them have been identified: HSC71; HSP70; CypA (2 times); UCHL1; GSTM5; Cct5; E-FABP; 2,3-BPGM, ubiquitin-conjugating enzyme E2D3; and β- actin/γ-actin. The third experiment consists of the discovery of factors related to developmental competence. Three populations from the triple selection with high, low and developmental competence was compared by a proteomic study. This study has shown that developmental incompetent embryos translate a minimum of maternal mRNA, which the majority is the embryo housekeeping found in the previous study. Whereas high and low developmental iv competent embryos present shared and exclusive translated proteins, these proteins represent potential factors related to developmental competence. By trying to identify these proteins, we have found that most translated proteins are transient and are not accumulated in the cytoplasm. In spite of this observation, we have identified six proteins: cytosolic thiolase, isocitrate dehydrogenase 1, peroxiredoxin 6, proteasome-α6, hypothetical protein My027 and thiamine triphosphatase. Two maternal housekeeping proteins were also missing for the incompetent 2-cell embryos: UCH-L1 and CypA. From these experiments, a new method of protein identification confirmation, called in silico confirmation, was developed. As the genome and the proteome of Bos taurus is limited, the protein identification was made in foreign species or from Bos taurus EST databases. This method as made possible to rebuilt the bos taurus messager, to translate the bovine protein, find his theoretical peptide mass fingerprint and compare it to the experimental spectrum and thus increase the number of matched peptides. In conclusion, the proteomic study on the developmental competence of the bovine oocyte has identified of a reduce number of candidates compared to genomic studies. A new method has been developed during this work. The in silico confirmation allowed the confirmation of protein identification without additional material.

Leishmania est un parasite protozoaire et l'agent étiologique de la leishmaniose. Ce parasite possède un cycle de vie dimorphique alternant entre le stade promastigote, présent chez l'insecte vecteur, et le stade amastigote résidant à l'intérieur des phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. Lors de cette différenciation, le parasite est exposé à de nombreux stress environnementaux qui vont moduler l'expression de ses gènes et de ses protéines afin qu'il s'adapte à son nouvel environnement. La réponse au stress chez les eucaryotes supérieurs est un mécanisme très conservé et implique, entre autres, la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2a par des kinases spécifiques, notamment PERK, une kinase résidente du reticulum endoplasmique (RE). Leishmania possède un homologue de PERK qui co-localise avec la protéine chaperonne BIP dans le RE. PERK est activé par des stress environnementaux qui permettent son autohyperphosphorylation et la phosphorylation d'eIF2a sur la threonine 166. Un mutant dominant négatif de PERK dépourvu de son domaine régulateur en N-terminal est incapable de phosphoryler eIF2tx lors d'un stress du RE ou lors de la différenciation du parasite en amastigote. L'absence de phosphorylation d'eIF2a chez ce mutant provoque un délai important du processus de différenciation du parasite à l'intérieur de macrophages infectés. La phosphorylation d'eIF2a par PERK semble donc être un mécanisme important dans le cycle de vie du parasite afin de favoriser sa différenciation en amastigote. L'homologue d'eIF2a chez Leishmania se distingue de ses homologues eucaryotes par la présence d'une extension de 94 acides aminés (~11 kDa) à l'extrémité N-terminale de la protéine. Cette extension joue un rôle essentiel dans la régulation post-traductionnelle de la protéine eIF2a qui permet le clivage de la protéine de 47 kDa en fragments peptidiques de 41, 35 et 25 kDa uniquement au stade promastigote. Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme de régulation impliquant l'excision de la methionine initiatrice par une methionine aminopeptidase, suivi par d'autres clivages protéolytiques. Nous avons également démontré que la methionine aminopeptidase impliquée dans le clivage d'eIF2a est aussi régulée selon le stade du parasite. De plus, nos résultats suggèrent que l'extrémité N-terminale d'eIF2a est essentielle pour le clivage et que cette régulation spécifique joue un rôle dans la phosphorylation d'eIF2a chez le stade promastigote.

Le redressement du peuplier suite à une stimulation gravitationnelle implique un processus de courbure locale lié à une élongation différentielle dans les zones en croissance primaire et un processus de courbure lié à la différenciation du bois de réaction dans les zones en croissance secondaire. Ces modifications morphogénétiques sont détectées au niveau de la région basale et apicale de la tige de peuplier inclinée. La région basale a développé le bois de tension une semaine après l'inclinaison, alors que la région apicale est réorientée 24 h après l'inclinaison. Ceci implique que les tissus de la région basale et apicale de la tige répondent de façon différente à l'inclinaison. Une étude d'expression menée au niveau du transcriptome a été réalisée à partir des ARNm extraits de tiges ayant été ou non inclinées pendant 45 min. En 45 min., la plante ne s'est pas redressée, mais a perçu le signal. Cette approche a permis d'identifier des transcrits de gènes impliqués dans la graviperception. L'étude de la régulation du transcriptome a été élargie par une analyse de la variation de l'accumulation des protéines extraites de tiges inclinées ou non. Les profils d'électrophorèse bidimensionnelle des conditions non stressées et stressées de la région basale et apicale ont montré une variation dans l'accumulation des protéines. Une analyse par RT-PCR quantitative de certaines protéines différentielles dont l'activité est potentiellement régulée par la thioredoxine (Trx) montre une accumulation de transcrits variable entre la région apicale et basale et des changements d'expression rapides et transitoires. Une étude complémentaire sur 2 thiorédoxines (Trx) (western blot, immunolocalisation in situ) a permis de montrer d'une part l'expression de Trx h1 une semaine après l'inclinaison et d'autre part la localisation de Trx h1 et Trx h2 au niveau des amyloplastes. L'ensemble de ces résultats a conduit à suggérer que les évènements moléculaires conduisant à la réorientation de la tige sont différents selon le tissu analysé. Probablement, chaque partie de la tige reçoit et répond différemment au signal gravité.

La protéine CIRP (Cold Induced RNA binding Protein) est une petite protéine de liaison à l’ARN de 172 acides aminés, qui est constituée du côté amino-terminal d’un domaine de liaison à l’ARN de type RRM (RNA recognition motif), et d’une partie carboxy-terminale riche en glycine et arginine qui comprend plusieurs motifs RGG. Elle a été identifiée comme étant inductible par hypothermie mais aussi par irradiation aux UV et par hypoxie. Nous avons analysé son expression et sa localisation en réponse à différents stress cellulaires. Nous avons montré qu’un traitement à l’arsénite qui induit un stress oxydant n’altère pas l’expression de CIRP provoque sa localisation dans les granules de stress (SG). Les SG sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques contenant des complexes de pré-initiation incompétents pour la traduction, et qui s’accumulent dans les cellules exposées à un stress. Ces structures constituent des sites de triages des ARNm, dans lesquels les ARNm sont soit stockés en attente d’une réinitiation de la traduction une fois le stress surmonté, soit destinés à être dégradés. La protéine CIRP se localise dans les SG que ce soit suite à un stress cytoplasmique ou du réticulum endoplasmique. Nous avons montré également que la localisation de la protéine CIRP dans les SG se déroule indépendamment de la présence de la protéine TIA-1 qui a été décrite comme responsable de l’assemblage des SG. De plus la surexpression de la protéine CIRP conduit à la formation de SG. Nous suggérons donc qu’il existe plusieurs voies qui mènent à l’assemblage de ces structures. En outre, nous avons analysé la localisation de mutants par délétion de la protéine CIRP et avons montré que le domaine RRM et le domaine RGG peuvent indépendamment localiser la protéine dans les SG. Par contre, la méthylation des résidus arginine du domaine RGG est une modification nécessaire à la localisation de CIRP dans les SG. Ensuite, nous avons étudié la fonction de la protéine CIRP dans le métabolisme des ARN messagers. Nous avons montré par une méthode d’adressage, que CIRP est un répresseur de la traduction des ARNm et que le domaine carboxy-terminal est nécessaire et suffisant à cette fonction. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished