Les lymphocytes Th17 sont une sous-population de lymphocyte T découverte récemment et dont la particularité est de produire de l’IL-17. Ces cellules ont été impliquées dans le développement de maladies auto-immunes. Toutefois, les mécanismes régulant les fonctions des lymphocytes Th17 dans ces maladies ne sont pas très bien connus. Plusieurs études indiquent que les intégrines liant le collagène sont des molécules de costimulation pour les lymphocytes T effecteurs. De plus, ces intégrines ont été impliquées dans le développement de plusieurs maladies auto-immunes. On les retrouve entre autres sur les lymphocytes T arthritiques du liquide synovial. Cependant, l’expression et les fonctions des intégrines liant le collagène chez les lymphocytes Th17 sont inconnues. Nous avons montré que l’intégrine liant le collagène alpha2beta1 (α2β1) est exprimée sur les cellules Th17, mais que l’intégrine α1β1 ne l’est pas. Nous avons également observé que les collagènes de type I et de type II costimulent la production d’IL-17A, d’IL-17F et d’IFN-γ dans les lymphocytes Th17 humains activés par le récepteur des cellules T (TCR) alors que le collagène de type IV, liant l’intégrine α1β1, n’a pas d’effet sur la production de ces cytokines. Nous avons également montré que les lymphocytes T expriment un autre récepteur pour le collagène, soit DDR1. Nos résultats suggèrent que ce récepteur n’est pas impliqué dans l’adhésion, mais plutôt dans la migration des lymphocytes T dans le collagène tridimensionnel. Nous avons trouvé que les lymphocytes Th17 expriment DDR1, mais que celui-ci n’est pas impliqué dans la costimulation par le collagène. Nos résultats ont mis en évidence le rôle des voies de signalisation MAPkinases ERK, JNK et la voie PI3K/AKT pour l’expression et la production d’IL-17 suite à la stimulation par le TCR alors que la voie MAPkinase p38 n’est importante que pour la costimulation de l’IL-17 par l’intégrine α2β1. Nos résultats ont également montré que l’expression du facteur de transcription RORc, qui joue un rôle central dans la différenciation Th17 et l’expression de l’IL-17, est augmentée par la costimulation du collagène. L’expression de RORc nécessite les voies MAPkinase ERK et PI3K/AKT qui sont aussi augmentées par le collagène. Nos résultats indiquent que l’intégrine α2β1 participe à l’activation des lymphocytes Th17 et de ce fait peut réguler à la hausse le développement des maladies auto-immunes dans les tissus riches en collagène.

Au Canada, il est estimé qu’une personne sur deux sera diagnostiqué pour un cancer et qu’une personne sur quatre en décédera, faisant du cancer la première cause de mortalité (Statistiques canadiennes sur le cancer 2017. Toronto, ON: Société canadienne du cancer, 2017). La formation de métastases est la principale cause des décès puisqu’elle y est associée à 90%. Lors de ce processus, les cellules épithéliales cancéreuses quittent la tumeur primaire et envahissent les tissus distants après avoir subi la transition épithéliale mésenchymateuse (EMT), ce qui leur permet d’accroître leur capacité migratoire. Plusieurs travaux ont montré un lien de causalité entre les protéines liant l’ARN et la progression tumorale. C’est le cas de l’étude qui a identifié les SICs (Spreading Initiation Centers), une structure transitoire présente lors de l’initiation de l’adhésion et défini comme présente uniquement dans les cellules mésenchymateuses. Nous proposons que les SICs contrôlent l’adhésion et la transition vers l’étalement cellulaire. Ainsi, nous avons cherché à caractériser cette structure et sa fonction. Nos données indiquent que la formation des SICs est contrôlée par l’activation de la voie RhoA et que son inhibition affecte leur formation et la consolidation de l’adhésion des cellules mésenchymateuses. Cette consolidation est liée au recrutement et à l’enrichissement spécifique de certaines protéines liant l’ARN, d’ARNm et d’un fort taux de traduction locale au niveau des SICs. De plus, nous montrons que lors de l’adhésion, une reprogrammation traductionnelle s’effectue afin de traduire des ARNm impliqués dans l’adhésion cellulaire. À l’aide d’une nouvelle méthode basée sur la puromycine, nous avons été capable d’identifier les protéines synthétisées lors de ce processus et avons montré que l’enrichissement de leur ARNm au niveau des SICs est dépendant de leur région 3’UTR. Enfin, l'inhibition de la traduction lors de l’adhésion diminue uniquement la capacité d’adhésion des lignées cellulaires mésenchymateuses et des cellules cancéreuses hautement métastatiques qui ont subi l’EMT. En conclusion, nous montrons que le métabolisme des SICs est régulé par leur capacité à traduire des ARNm spécifiques. Nous proposons que les SICs agissent comme un point de contrôle d’adhérence dans les cellules métastatiques leur permettant ainsi de moduler leur dissémination. / In Canada, one person out of two will be diagnosed with cancer and one out of four will die of it, making cancer the leading cause of death (Statistiques canadiennes sur le cancer 2017. Toronto, ON: Société canadienne du cancer, 2017). This is mainly caused by metastasis formation, which is associated to more than 90% of the death related to cancer. While majority of cancers mostly originates from epithelial tissues, pre-metastatic cancerous cells can only leave the primary tumor after undergoing the epithelial mesenchymal transition (EMT). This transition allows cancerous cell lines to increase their ability to migrate through the highly structured stroma, invade the blood stream in order to disseminate in distant tissues. Increasing studies have shown causality in between RNA binding protein (RBP) and tumor progression. Our discoveries strengthen this hypothesis, as our work on Spreading initiation center (SIC), a transient structure during early adhesion, showed that RBPs regulation translation regulates these structure during mesenchymal cells adhesion and spreading. We found that SICs formation is controlled by RhoA activation and its inhibition will affect their formation and adhesion consolidation of mesenchymal cells. This consolidation is done with recruitment and enrichment of specific RBPs, mRNA and a high level of local translation in SICs. We also showed translational reprograming events during early adhesion, allowing us to find adhesion-regulated translation of specific mRNAs known to be implicated in cellular adhesion. Using our specifically engineered methods based on puromycin incorporation capacities, we identified neosynthesized proteins during early adhesion, showing a distinct translational activity. This also led us to show a specific enrichment of the mRNA coding for the newly synthetized proteins, through 3’UTR, within SICs. Finally, we showed that translation inhibition decreased the adhesion ability of mesenchymal cells and highly metastatic cancerous cells that undergo EMT, while not affecting epithelial cells or non-metastatic ones. Taken together, we conclude that SIC-regulated mechanism regulate mesenchymal cell adhesion through their ability to translate specific RNA, and that SICs can act as an adhesion checkpoint for metastatic cells, thus modulating their ability to disseminate and form metastases.

Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence, E sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique. Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement. L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle de sélectines, chimiokines et intégrines. Le blocage de l'augmentation de l'activité de SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par l’adhérence de la voie SAPK2/p38. / Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29 cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27. Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38 and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins, chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1) adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2p38 pathway.

La polarisation apico-basale des cellules épithéliales est cruciale pour le maintien de l'intégrité des tissus épithéliaux et sa perte contribue à la progression tumorale. Les protéines établissant cette polarité sont divisées en modules apicaux et basolatéraux qui s'excluent mutuellement de leur domaine respectif. La zonula adherens (ZA) forme l'interface entre ces deux domaines. La ZA joue aussi un rôle clé dans la cohésion intercellulaire et la morphogenèse épithéliale. Elle est composée de protéines d'adhésion, d'une ceinture d'actomyosine et de protéines de polarité. L'homéostasie épithéliale est déterminée par une fine collaboration entre les protéines de polarité et celles de la ZA. Le but de mon doctorat a été d'étudier ce lien existant entre les protéines de polarité et celles composant la ZA. Pour cela, au laboratoire nous utilisons un outil in vivo avantageux se nommant Drosophila melanogaster ainsi que des modèles de cellules épithéliales humaines cultivées en 2 ou 3 dimensions. Dans un premier temps, mes travaux de thèse se sont concentrés sur les protéines Girdin. Girdin chez la drosophile et GIRDIN, son orthologue humain, sont des protéines d'échafaudage qui sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont celui qui nous a principalement intéressé au cours de mon doctorat : l'adhésion intercellulaire. Au laboratoire, Dre Élise Houssin a montré que Girdin renforçait l'ancrage des protéines d'adhésion à la ceinture d'actomyosine constituant la ZA (Houssin et al., 2015), une fonction conservée chez son orthologue humain (Wang et al., 2018a). De plus, GIRDIN interagit physiquement avec des protéines de polarité, telles que Par3 et aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015). Nous avons donc émis l'hypothèse que les protéines Girdin jouaient un rôle dans le maintien de la polarité épithéliale. Pour y répondre, nous avons réalisé des interactions génétiques entre girdin et différents gènes de polarité. L'interprétation de l'ensemble de nos résultats indique que Girdin et son orthologue soutiennent les déterminants latéraux de polarité en réprimant l'activité de la kinase apicale aPKC. De plus, nous avons mis en lumière que la sous-expression de GIRDIN est associée à la dissémination de cellules issues de sphères tumorales, un phénomène également observé in vivo pour son orthologue de drosophile (Houssin et al., 2015). La perte de la polarité épithéliale ainsi que la dissémination cellulaire observées dans les sphères tumorales sous-exprimant GIRDIN indiquent qu'elle pourrait contrer la progression tumorale en maintenant la polarité épithéliale et la cohésion cellulaire. Nos observations ont été appuyées par l'analyse de tissus tumoraux de patients qui a établi un lien entre l'altération de l'expression de GIRDIN et une faible espérance de survie de ces patients dans deux sous-types de cancer du sein et du poumon. Dans un deuxième temps, les travaux présentés dans cette thèse ont également contribué à une meilleure compréhension du rôle de la protéine Yurt (Yrt) dans le maintien de l'architecture épithéliale (chapitre 2 et 3). Tout d'abord, nous avons mis en lumière le rôle de cette protéine de polarité dans l'induction de la tension épithéliale. La caractérisation de cette fonction nous a permis d'explorer les régulateurs et effecteurs de Yrt. Ainsi, nous avons constaté que Yrt est recrutée au domaine apical par la protéine apicale Crumbs pour promouvoir la tension épithéliale. De plus, la kinase aPKC et le module Pak1-PP2A ont des effets antagonistes sur son activité. aPKC phosphoryle Yrt pour l'inhiber alors que l'axe Pak1-PP2A la déphosphoryle afin d'induire son activité. J'ai également étudié le rôle d'un partenaire physique de Yrt, la NAD synthetase (Nadsyn) qui m'a conduit à explorer une nouvelle voie de signalisation effectrice de Yrt. En effet, nous avons constaté que Yrt pourrait recruter la Nadsyn aux membranes plasmiques pour produire localement du NAD⁺, le co-substrat de la famille des sirtuines, activant ces déacétylases. Cette activation locale permettrait de désacétyler des protéines clés de la contraction cellulaire et/ou de la polarité épithéliale afin de réguler l'architecture épithéliale. Ces deux études dévoilent les modes de régulation et d'action de la protéine Yrt chez la drosophile. Ses deux orthologues étant fortement surexprimés dans de nombreux cancers agressifs, il sera pertinent de valider la conservation de ces mécanismes chez l'humain, afin de déceler de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'homéostasie épithéliale. La perte de l'architecture épithéliale étant étroitement liée à la progression tumorale, ses travaux ouvrent la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Epithelia form the basis of animal tissue architecture, establishing a barrier against diffusion and providing mechanical structure by their apico-basal asymmetry and adhesive properties. This apico-basal polarity is regulated through various polarity protein complexes characterized by a mutual antagonism between apical and basolateral complexes. Cells adhere to each other with the major cohesive and contractile adhesion of epithelial cells, the zonula adherens (ZA). The ZA machinery contains a strong cohesive complex linked to an actomyosin belt, and forms the interface between the apical and basolateral domains. This actomyosin belt is the main modulator of the epithelial tension. Apico-basal proteins collaborate with the ZA machinery to control tissue architecture homeostasis. Loss of epithelial architecture, such as apico-basal polarity loss or cell-cell cohesion loss, is a hallmark of tumoral progression. My PhD work was aimed at deciphering the molecular mechanisms controlling epithelial polarity and ZA homeostasis using the sophisticated in vivo model Drosophila melanogaster. First, we investigated the role of the scaffold Girdin proteins in epithelial architecture. Previously in the laboratory, the drosophila Girdin protein has been shown to localize at and to reinforce the ZA cohesion (Houssin et al., 2015), a function shared by its human ortholog GIRDIN (Wang et al., 2018a). Furthermore, GIRDIN has been shown to physically interact with polarity proteins such as Par3 and aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015), but its role in cell polarity remained unclear. Using genetic interactions combined with biochemistry technics we demonstrated that Girdin proteins support basolateral determinants by negatively regulating the apical kinase aPKC. In addition, we observed cell detachment and dissemination from GIRDIN knockdown cysts, a phenomenon also reported in girdin null embryos (Houssin et al., 2015). Thus, GIRDIN is required for the cohesion of multicellular epithelial structures that is crucial to prevent various pathological conditions such as cancer progression (Halaoui & McCaffrey, 2015). Indeed, we found a correlation between a low expression of GIRDIN mRNA and a decreased survival in more aggressive breast cancer subtypes and lung adenocarcinoma. The second and third result chapters show that the Drosophila polarity protein Yrt plays a role in epithelial tension and explore the upstream activators and downstream effectors pathways of Yrt. Yrt was previously shown to limit the ability of Crumbs to promote apical membrane growth, thereby defining proper apical/lateral membrane ratio in epithelial cells (Laprise et al., 2006; Laprise et al., 2009). Our results show that Yrt, by interacting with Crumbs, also induces epithelial tension by organizing the apical localization of the non-muscle myosin II, which is needed during embryogenesis. Mechanistically, the apical kinase aPKC phosphorylates Yurt, thereby dislodging Yrt from the apical domain and releasing apical tension. In contrast, the Pak1- PP2A module promotes Yrt dephosphorylation, leading to its apical localization and function. We then investigated how Yrt could reorganize the cytoskeleton to induce epithelial tension. We performed a genetic screen on the Yrt physical interactome. We identified the NAD synthetase (Nadsyn), an enzyme responsible for the de novo NAD⁺ synthesis, as a strong interactor of Yrt. We observed that Yrt recruits Nadsyn to the plasma membrane and that apical constriction induced by Yrt is Nadsyn- and NAD⁺-dependent. Based on these novel findings, we proposed that Yrt may recruit Nadsyn to locally produce a NAD⁺ pool that activates the deacetylases Sirtuin1 or 2, thereby deacetylating proteins involved in cell contractility and cell polarity. This model remains to be clarified by further work. Since Yrt's human orthologs are overexpressed in many epitheliaderived tumors and are associated with a poor survival outcome, deciphering whether the signaling pathways uncovered in our work are preserved in humans could help uncovering novel therapeutic approaches. In conclusion, my PhD work dissected the role of new proteins and pathways involved in the maintenance of epithelial cell architecture. Since the maintenance of an epithelial structure counteracts tumor progression, it also highlights new therapeutic possibilities.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / 5 vidéos en format mp4. MovieS1: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics formed on a typical MRC-5 cell adhering ; Movie S2A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, Untreated MRC-5 cell adhering ; MovieS2B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in MRC-5, MRC-5 cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS3A: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, Untreated HeLa cell adhering ; MovieS3B: Time-lapse cell imaging of SIC dynamics in HeLa, HeLa cell adhering in presence of 50 μg mL-1 of cycloheximide ; MovieS4: Time-lapse cell imaging of SIC inhibition and increased spreading of newly adhering MRC-5 cell treated with Y27632 (ROCK inhibitor). / La majorité des cancers proviennent du tissu épithélial. Lors de l'évolution d'une tumeur, les cellules cancéreuses épithéliales subissent une transition épithéliale à mésenchymateuse afin d'amorcer la progression tumorale. La migration et l'adhésion cellulaire sont des processus biologiques essentiels à l'établissement de métastases, qui sont la principale cause de décès associés au cancer. Ainsi, cibler l'un ou l'autre de ces processus et affecter la progression tumorale pourrait potentiellement améliorer le pronostic. Mon projet de doctorat s'est donc penché sur les mécanismes de régulation de l'initiation de l'adhésion spécifiques aux cellules ayant subi une transition épithéliale-mésenchymateuse. L'étude de l'initiation de l'adhésion a mis en lumière une structure impliquée dans la maturation des adhésions focales, les spreading initiation centers (SICs). Les SICs se situent au-dessus de futurs sites de formation d'adhésions focales et sont composés de complexes ribonucléoprotéiques confinés sous une gaine d'actine. Parmi les protéines faisant partie des SICs, on retrouve plusieurs protéines impliquées dans l'adhésion, mais également plusieurs protéines de liaison à l'ARN (RBPs). Nous avons montré que les RBPs ainsi que les ARNm sont présents de façon enrichie dans les SICs, suggérant une traduction localisée. En effet, l'inhibition de la traduction freine l'adhésion spécifiquement chez les cellules de types mésenchymateuses et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse. Nous avons mis en lumière une régulation spatiotemporelle de la traduction, spécifique aux cellules mésenchymateuses. Au fil de l'adhésion, la machinerie traductionnelle est tout d'abord inhibée puis stimulée. Cette régulation spatiotemporelle permet une reprogrammation de la traduction vers une traduction localisée et spécifique de protéines impliquées dans la formation des adhésions focales. Nous avons montré que la régulation temporelle de la traduction est assurée par la phosphorylation de la sous-unité alpha de l'EIF2. L'inhibition de la traduction est donc un moyen direct d'étudier les différences dans l'initiation de l'adhésion entre les cellules épithéliales et les cellules ayant subi une transition épithéliale à mésenchymateuse lors de la progression tumorale. / Most cancers originate in epithelial tissue. Epithelial cancer cells then undergo an epithelial to mesenchymal transition to initiate tumor progression. Cell migration and adhesion are essential biological processes for metastasis formation. Metastases are the leading cause of cancer-associated deaths, so targeting any of these processes would greatly affect tumor progression, which could lead to a better prognosis. My doctoral project therefore centered on the mechanisms of regulation of adhesion initiation specific to cells that have undergone an epithelial to mesenchymal transition. The study of adhesion initiation has highlighted a structure involved in the maturation of focal adhesions called spreading initiation center (SIC). This structure has been shown to localize above the formation sites of focal adhesions and to be composed of ribonucleoprotein complexes confined under an actin sheath. Among the proteins identified as part of the SICs are several proteins involved in adhesion and several RNA binding proteins. We have shown that RNA binding proteins and mRNA are enriched within SICs, suggesting the presence of translational activity. We subsequently confirmed an enrichment in translation in the SICs during the initial phase of adhesion. Indeed, inhibiting translation only inhibits cellular adhesion in mesenchymal cells and in epithelial cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition. By further studying the translation dynamics during adhesion, we have highlighted a spatiotemporal regulation specific to mesenchymal cells. The translational machinery is first inhibited, after which there is an upsurge in translation. This spatiotemporal regulation allows a reprogramming of the translatome, inducing the specific translation of proteins involved in the formation of focal adhesions. We have shown that the temporal regulation of translation is regulated by the phosphorylation of the alpha subunit of eIF2. The initiation of translation is therefore an interesting target to study the differences between the adhesion initiation of epithelial cells and that of cells having undergone an epithelial to mesenchymal transition during tumor progression.

Les neutrophiles jouent un rôle important dans les défenses immunitaires contre l'invasion des bactéries et des virus. Cette fonction est facilitée par l'expression de divers récepteurs à la surface des neutrophiles dont les récepteurs Toll-like (TLR). Les TLR reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) qui sont exprimés sur les agents infectieux, et leur activation induit la médiation de la production de cytokines nécessaires pour le réponse immunitaire efficace. Les neutrophiles expriment divers TLR comme par exemple le TLR1/2 qui est activé par les composants de bactéries Gram-positives comme les peptidoglycane et les lipopeptides, . En plus des TLRs, les neutrophiles expriment des récepteurs P2, qui sont activés par des nucléotides extracellulaires. Plusieurs évidences montrent que les récepteurs P2 régulent des réponses pro-inflammatoires importantes chez le neutrophile. De plus, l'adhérence des neutrophiles à l'endothélium est médiée par une classe de protéines membranaires appelé intégrines dont l’antigène Macrophage-1 (ou αMβ2 intégrine) qui est un récepteur du complément (« CR3 ») composé de CD11b (intégrine αM) et CD18 (intégrine β2). Mac-1 (CD11b/CD18) est l'une des molécules d'adhésion importantes qui régule l'adhérence des neutrophiles à l'endothélium. Des études antérieures ont montré que les récepteurs P2 sont impliqués dans la migration des neutrophiles via la stimulation de la libération de chimiokines. Dans cette maîtrise nous avons cherché à savoir si ces récepteurs sont impliqués dans ces réponses induites par l’activation du TLR1/2. En accord avec un rôle des récepteurs P2, l'induction de l’adhérence des neutrophiles stimulées par un agoniste du TLR1/2 était inhibées par les antagonistes des récepteurs de P2, la suramine et le réactif bleu 2 (RB-2). La participation des récepteurs P2Y4 P2Y1, P2Y6 et P2Y11 ont été exclus avec des antagonistes sélectifs. Comme il n'y a pas d'antagoniste spécifique du récepteur P2Y2, un agoniste spécifique non hydrolysable pour P2Y2 à savoir PSB1114 a été utilisé. PSB1114 a régulé à la hausse l'expression de Mac-1 à la surface des neutrophiles, indiquant que P2Y2 est impliqué dans cette régulation. En outre, UTP et l'ATP, les ligands naturels du P2Y2 ont potentialisés fortement cette réponse induite par un agoniste du TLR1/2 (Pam3CSK4) à faible concentration. Cependant l'ATP et UTP seul ont induit une réponse modéré sur l'adhésion des neutrophiles sur une plaque coaté avec du fibrinogène. Nos résultats suggèrent que le récepteur P2Y2 contrôlent l’induction de l’expression de Mac-1 induite par le TLR1/2 in vitro et nous avons aussi confirmé que tel que nous nous attendions le P2Y2 contrôlait aussi l’adhesion des neutrophiles. / Neutrophils play an important role in immune defences against invading bacteria and viruses. This function is facilitated by the expression of Toll-like receptor (TLR) family members by neutrophils. TLRs recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) that are expressed on infectious agents, and mediate the production of cytokines necessary for the development of effective immunity. Neutrophils express various TLRs. For example TLR1/2 is activated by peptidoglycan and lipopeptide, components of Gram-positive bacteria. In addition to TLR, neutrophil express P2 receptors, those are activated by extracellular nucleotides. There is growing evidence indicating that P2 receptors mediate some important pro-inflammatory responses. Moreover, neutrophil adhesion to endothelium is mediated by a class of membrane proteins called integrins. Macrophage-1 antigen (or integrin αMβ2) is a complement receptor ("CR3") consisting of CD11b (integrin αM) and CD18 (integrin β2) Mac-1(CD11b/CD18 is one of the important adhesion molecules that mediate neutrophil adhesion to the endothelium. Previous studies showed that P2 receptors are involved in neutrophil migration via stimulation of chemokine release and by facilitating chemoattractant gradient sensing. Here, we have investigated whether these receptors are involved in TLR1/2-induced neutrophil activation and adhesion. In line with a role of P2 receptors, neutrophil activation and adhesion induced by a TLR1/2 agonist were inhibited by the P2 receptor antagonists, suramin and reactive blue 2 (RB-2). The involvement of P2Y4 was unlikely as this receptor is insensitive to suramin while P2Y1, P2Y6 and P2Y11 were excluded with selective antagonists. As there is no specific antagonist for P2Y2 receptor, a non-hydrolysable specific agonist for P2Y2 namely PSB1114 was used. PSB1114 up-regulates surface expression of Mac-1 a result that suggests that P2Y2 involved in the regulation of Mac-1. Moreover, UTP and ATP, the natural P2Y2 ligands, markedly potentiated TLR1/2 agonist-induced neutrophil adhesion. Interestingly, ATP and UTP without Pam3CSK4 stimulation have shown a moderate effect on neutrophil adhesion in fibrinogen adhesion assay. Our data suggest that P2Y2 receptors control the TLR1/2 agonist-induced neutrophil adhesion in vitro via up regulation of Mac-1.

La polarisation apico-basale des cellules épithéliales est cruciale pour le maintien de l'intégrité des tissus épithéliaux et sa perte contribue à la progression tumorale. Les protéines établissant cette polarité sont divisées en modules apicaux et basolatéraux qui s'excluent mutuellement de leur domaine respectif. La zonula adherens (ZA) forme l'interface entre ces deux domaines. La ZA joue aussi un rôle clé dans la cohésion intercellulaire et la morphogenèse épithéliale. Elle est composée de protéines d'adhésion, d'une ceinture d'actomyosine et de protéines de polarité. L'homéostasie épithéliale est déterminée par une fine collaboration entre les protéines de polarité et celles de la ZA. Le but de mon doctorat a été d'étudier ce lien existant entre les protéines de polarité et celles composant la ZA. Pour cela, au laboratoire nous utilisons un outil in vivo avantageux se nommant Drosophila melanogaster ainsi que des modèles de cellules épithéliales humaines cultivées en 2 ou 3 dimensions. Dans un premier temps, mes travaux de thèse se sont concentrés sur les protéines Girdin. Girdin chez la drosophile et GIRDIN, son orthologue humain, sont des protéines d'échafaudage qui sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont celui qui nous a principalement intéressé au cours de mon doctorat : l'adhésion intercellulaire. Au laboratoire, Dre Élise Houssin a montré que Girdin renforçait l'ancrage des protéines d'adhésion à la ceinture d'actomyosine constituant la ZA (Houssin et al., 2015), une fonction conservée chez son orthologue humain (Wang et al., 2018a). De plus, GIRDIN interagit physiquement avec des protéines de polarité, telles que Par3 et aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015). Nous avons donc émis l'hypothèse que les protéines Girdin jouaient un rôle dans le maintien de la polarité épithéliale. Pour y répondre, nous avons réalisé des interactions génétiques entre girdin et différents gènes de polarité. L'interprétation de l'ensemble de nos résultats indique que Girdin et son orthologue soutiennent les déterminants latéraux de polarité en réprimant l'activité de la kinase apicale aPKC. De plus, nous avons mis en lumière que la sous-expression de GIRDIN est associée à la dissémination de cellules issues de sphères tumorales, un phénomène également observé in vivo pour son orthologue de drosophile (Houssin et al., 2015). La perte de la polarité épithéliale ainsi que la dissémination cellulaire observées dans les sphères tumorales sous-exprimant GIRDIN indiquent qu'elle pourrait contrer la progression tumorale en maintenant la polarité épithéliale et la cohésion cellulaire. Nos observations ont été appuyées par l'analyse de tissus tumoraux de patients qui a établi un lien entre l'altération de l'expression de GIRDIN et une faible espérance de survie de ces patients dans deux sous-types de cancer du sein et du poumon. Dans un deuxième temps, les travaux présentés dans cette thèse ont également contribué à une meilleure compréhension du rôle de la protéine Yurt (Yrt) dans le maintien de l'architecture épithéliale (chapitre 2 et 3). Tout d'abord, nous avons mis en lumière le rôle de cette protéine de polarité dans l'induction de la tension épithéliale. La caractérisation de cette fonction nous a permis d'explorer les régulateurs et effecteurs de Yrt. Ainsi, nous avons constaté que Yrt est recrutée au domaine apical par la protéine apicale Crumbs pour promouvoir la tension épithéliale. De plus, la kinase aPKC et le module Pak1-PP2A ont des effets antagonistes sur son activité. aPKC phosphoryle Yrt pour l'inhiber alors que l'axe Pak1-PP2A la déphosphoryle afin d'induire son activité. J'ai également étudié le rôle d'un partenaire physique de Yrt, la NAD synthetase (Nadsyn) qui m'a conduit à explorer une nouvelle voie de signalisation effectrice de Yrt. En effet, nous avons constaté que Yrt pourrait recruter la Nadsyn aux membranes plasmiques pour produire localement du NAD⁺, le co-substrat de la famille des sirtuines, activant ces déacétylases. Cette activation locale permettrait de désacétyler des protéines clés de la contraction cellulaire et/ou de la polarité épithéliale afin de réguler l'architecture épithéliale. Ces deux études dévoilent les modes de régulation et d'action de la protéine Yrt chez la drosophile. Ses deux orthologues étant fortement surexprimés dans de nombreux cancers agressifs, il sera pertinent de valider la conservation de ces mécanismes chez l'humain, afin de déceler de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'homéostasie épithéliale. La perte de l'architecture épithéliale étant étroitement liée à la progression tumorale, ses travaux ouvrent la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Epithelia form the basis of animal tissue architecture, establishing a barrier against diffusion and providing mechanical structure by their apico-basal asymmetry and adhesive properties. This apico-basal polarity is regulated through various polarity protein complexes characterized by a mutual antagonism between apical and basolateral complexes. Cells adhere to each other with the major cohesive and contractile adhesion of epithelial cells, the zonula adherens (ZA). The ZA machinery contains a strong cohesive complex linked to an actomyosin belt, and forms the interface between the apical and basolateral domains. This actomyosin belt is the main modulator of the epithelial tension. Apico-basal proteins collaborate with the ZA machinery to control tissue architecture homeostasis. Loss of epithelial architecture, such as apico-basal polarity loss or cell-cell cohesion loss, is a hallmark of tumoral progression. My PhD work was aimed at deciphering the molecular mechanisms controlling epithelial polarity and ZA homeostasis using the sophisticated in vivo model Drosophila melanogaster. First, we investigated the role of the scaffold Girdin proteins in epithelial architecture. Previously in the laboratory, the drosophila Girdin protein has been shown to localize at and to reinforce the ZA cohesion (Houssin et al., 2015), a function shared by its human ortholog GIRDIN (Wang et al., 2018a). Furthermore, GIRDIN has been shown to physically interact with polarity proteins such as Par3 and aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015), but its role in cell polarity remained unclear. Using genetic interactions combined with biochemistry technics we demonstrated that Girdin proteins support basolateral determinants by negatively regulating the apical kinase aPKC. In addition, we observed cell detachment and dissemination from GIRDIN knockdown cysts, a phenomenon also reported in girdin null embryos (Houssin et al., 2015). Thus, GIRDIN is required for the cohesion of multicellular epithelial structures that is crucial to prevent various pathological conditions such as cancer progression (Halaoui & McCaffrey, 2015). Indeed, we found a correlation between a low expression of GIRDIN mRNA and a decreased survival in more aggressive breast cancer subtypes and lung adenocarcinoma. The second and third result chapters show that the Drosophila polarity protein Yrt plays a role in epithelial tension and explore the upstream activators and downstream effectors pathways of Yrt. Yrt was previously shown to limit the ability of Crumbs to promote apical membrane growth, thereby defining proper apical/lateral membrane ratio in epithelial cells (Laprise et al., 2006; Laprise et al., 2009). Our results show that Yrt, by interacting with Crumbs, also induces epithelial tension by organizing the apical localization of the non-muscle myosin II, which is needed during embryogenesis. Mechanistically, the apical kinase aPKC phosphorylates Yurt, thereby dislodging Yrt from the apical domain and releasing apical tension. In contrast, the Pak1- PP2A module promotes Yrt dephosphorylation, leading to its apical localization and function. We then investigated how Yrt could reorganize the cytoskeleton to induce epithelial tension. We performed a genetic screen on the Yrt physical interactome. We identified the NAD synthetase (Nadsyn), an enzyme responsible for the de novo NAD⁺ synthesis, as a strong interactor of Yrt. We observed that Yrt recruits Nadsyn to the plasma membrane and that apical constriction induced by Yrt is Nadsyn- and NAD⁺-dependent. Based on these novel findings, we proposed that Yrt may recruit Nadsyn to locally produce a NAD⁺ pool that activates the deacetylases Sirtuin1 or 2, thereby deacetylating proteins involved in cell contractility and cell polarity. This model remains to be clarified by further work. Since Yrt's human orthologs are overexpressed in many epitheliaderived tumors and are associated with a poor survival outcome, deciphering whether the signaling pathways uncovered in our work are preserved in humans could help uncovering novel therapeutic approaches. In conclusion, my PhD work dissected the role of new proteins and pathways involved in the maintenance of epithelial cell architecture. Since the maintenance of an epithelial structure counteracts tumor progression, it also highlights new therapeutic possibilities.

Contexte : La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (DECF) est une pathologie de l'endothélium cornéen (EC), la couche interne de la cornée. La protéine SLC4A11 est connue pour être mutée dans certaines formes de la DECF et la troisième boucle extracellulaire (EL3) de cette protéine est connue pour être en mesure de se lier à certaines protéines de la membrane basale de l'EC, la membrane de Descemet. Objectif : L'objectif de ce projet est d'analyser le rôle des intégrines et d'EL3 dans l'adhésion des cellules endothéliales cornéennes (CECs) à la membrane de Descemet. Méthode : Des CECs ont été mises en culture à partir de cornées natives. Leur profil d'expression d'intégrines a été étudié en exploitant la technique d'immunofluorescence indirecte. Des essais d'adhésion en présence d'anticorps anti-intégrines (a1 et a2b1; a3 et b1) ou d'un peptide bloquant (RGD) ont été réalisés sur des membranes de Descemet dévitalisées avec des CECs. Puisque l'expression de SLC4A11 est perdue en culture, les CECs ont dû être transfectées avec un plasmide d'EL3 avant les essais d'adhésion. L'efficacité de transfection a été déterminée par immunofluorescence. Des tests d'adhésions sur membrane de Descemet dévitalisées ont ensuite été réalisés avec les CECs. Résultats : Les CECs en culture primaire expriment les sous-unités d'intégrines a1, a2, a3, av, b1 et b5. L'utilisation d'anticorps spécifiques aux sous-unités d'intégrines a3 et b1 a résulté en une diminution de 58% de l'adhésion tandis que les essais avec a1 et a2b1 ainsi que le peptide RGD n'ont pas diminué leur adhésion à la membrane de Descemet. La transfection d'EL3 a permis son expression membranaire chez les CECs. La surexpression d'EL3 n'a pas augmenté l'adhésion des CECs à la membrane de Descemet. Conclusion : Les résultats suggèrent que les intégrines a3 et b1 sont importantes pour l'adhésion des CECs en culture primaire. En présence des intégrines, la boucle EL3 ne semble pas avoir un rôle majeur à jouer dans l'adhésion des CECs à la membrane de Descemet. Ces résultats remettent en question l'impact de mutations de la protéine SLC4A11 dans la perte d'adhésion des CECs à la membrane de Descemet. / Context: Fuchs endothelial corneal dystrophy is a corneal endothelium (CE) pathology, which can be caused by mutations of SLC4A11 proteins. The third extracellular loop (EL3) of SLC4A11 is already known to bind proteins present in the Descemet membrane (DM), which is the basal membrane of the CE. Objective: This project aims to analyze the role of integrins and EL3 in the adhesion of corneal endothelial cells (CECs) to the DM. Method: CECs were isolated from native corneas and cultured in vitro. Their integrin expression profile was determined using immunofluorescence staining. Adhesion assays using anti-integrin antibodies (a1 and a2b1; a3 and b1) or a blocking peptide (RGD) were done on decellularized DMs with CECs. Because of the loss of SLC4A11 expression in culture, EL3 was transfected in CECs before conducting adhesion assays. Efficiency of transfection was checked using immunostaining. Adhesion assays were done using transfected cells. Results: CECs in culture expressed the integrin subunits a1, a2, a3, av, b1 and b5. Blocking the adhesion of a3 and b1 subunits decreased adhesion of CECs by 58%. Blocking a1 subunits and a2b1integrin with antibodies or the RGD sequence did not change CEC adhesion to the DM. Transfection of EL3 increased its expression at the cell membrane. However, it did not change the adhesion of CECs to DM. Conclusion: Our results suggest that integrin subunits a3 and b1 are important for adhesion of CECs to the DM. In the presence of integrins, EL3 does not seem to play a major role in CECs adhesion to the DM. These results question the impact of mutations in the SLC4A11 protein in the loss of adhesion of CECs to the DM.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'activité mécanique des cellules générée par l'interaction entre la matrice extracellulaire (MEC) et le cytosquelette d'actine est essentielle pour la régulation de l'adhésion, de l'étalement et de la migration des cellules lors du développement normal ou tumoral. La stimulation mécanique des cellules découle majoritairement des forces externes appliquées par la MEC ou bien des forces internes générées par la contraction de l'actomyosine. Ces stimuli mécaniques convergent aux intégrines situées aux points focaux d'adhérence (FA) reliant la MEC à l'actine fibrillaire. La formation des FA requiert des molécules adaptatrices pour l'actine, telle que la vinculine, ainsi que des molécules de signalisation, comme la FAK (« focal adhesion kinase ») ou les PKC (« protein kinase C »). Les filaments intermédiaires (FI) de kératines 8/18 (K8/K18) sont exprimés dans l'ensemble de l'épithélium simple, mais constituent les seuls FI présents dans les hépatocytes et les hépatomes. Bien que plusieurs évidences suggèrent une participation des FI K8/K18 dans la régulation de l'activité mécanique des cellules, le mécanisme exact demeure énigmatique. Les travaux présentés dans cette thèse examinent les mécanismes impliqués dans la modulation de l'activité mécanique des cellules par les FI K8/K18. Par une approche s'appuyant sur l'utilisation d'une pince optique et de substrats de rigidité variable, les résultats montrent que les FI K8/K18 contribuent à la rigidité cellulaire et aux mécanismes mécanosenseurs, en raison d'une modulation de la signalisation RhoA-ROCK responsable de la dynamique de l'actine fibrillaire, plutôt que de leurs propriétés viscoélastiques. Par ailleurs, la PKCô est identifiée comme un médiateur de la modulation de l'étalement et de la migration associée aux FI K8/K18 chez les hépatomes, via une boucle de rétroaction positive affectant la FAK et l'intégrine aux FA. En fait, ces éléments corrèlent avec l'assemblage d'un complexe formé de RACK1 « Receptor of Activated C Kinase 1», pi-intégrine, plectine, PKC et c-Src. À noter que les mécanismes dépendant de RhoA et PKC sont mutuellement impliqués dans la modulation de la migration et de la rigidité des cellules associées aux FI K8/K18. Dans leur ensemble, les résultats démontrent une implication incontestable des FI K8/K18 dans la modulation de l'homéostasie mécanique des cellules de l'épithélium simple.

Cette thèse de doctorat porte sur l'étude des notions fondamentales de la vision, plus particulièrement de la compréhension de l'homéostasie et de la cicatrisation de la cornée. En fait, l'attention de ces travaux est accordée à la modulation de l'expression d'un récepteur important dans l'adhésion de l'épithélium cornéen : la sous-unité d'intégrine a6. Les intégrines sont des protéines transmembranaires, des composantes essentielles de l'adhésion entre cellules et la matrice extracellulaire. D'ailleurs, les intégrines sont impliquées dans la plupart des processus cellulaires et sont un élément clef de tout tissu, incluant le tissu oculaire. Les intégrines a6(31 et a6|34 sont toutes deux exprimées au niveau de l'épithélium cornéen, deux intégrines ayant comme ligand la laminine. Lors de la cicatrisation cornéenne, l'expression de la laminine ainsi que celle de la sous-unité a6 est favorisée. Cependant, le rôle des intégrines a6(31 et a6(34 ainsi que la modulation de l'expression du gène de la sous-unité a6 au niveau de l'épithélium cornéen demeuraient des éléments obscurs avant le début de ces travaux. L'objectif principal des travaux était donc d'identifier les facteurs importants dans la modulation du promoteur du gène de la sous-unité d'intégrine a6 dans la réponse des cellules épithéliales de l'épithélium cornéen lors de la cicatrisation cornéenne. Ces travaux ont permis de démontrer l'importance des facteurs Spl, Sp3 et NFI dans la régulation de la transcription du gène a6 dans l'homéostasie, ainsi qu'à des étapes précises du processus de la cicatrisation cornéenne. De plus, l'effet global de la laminine dans la réponse des cellules épithéliales de la cornée suite à l'activation des intégrines a6(31 et a6(34 est mieux défini. / This doctoral thesis is a study based on the fundamental notions of vision, more particularly the comprehension of corneal homeostasis and wound healing. It pays a particular attention to the modulation of expression of a gene that encodes a membrane-bound receptor subunit, the a6 subunit from the a6|31 and a6(34 integrins, important for adhesion of the corneal epithelium to the basement membrane. These integrins constitute essential components of cell-to-cell and cell-extracellular matrix adhesions. These trans-membrane receptors are involved in most cellular processes and represent key elements in ail tissues, including ocular tissues. Expression of both the a6|31 and a6(34 integrins, whose respective ligand is laminin, has been reported in the corneal epithelium. Recently, expression of the a6 subunit has been shown to be coordinated with the massive secretion of laminin that occurs 24 hours following damage to the corneal epithelium. However, the precise function played by laminin on the modulation of expression of the a6 subunit gene had never been explored before the present study. The a6 gene promoter is deprived of a TATA binding cassette. On the other hand, it possesses a high content in guanine and cytosine residue (GC-rich promoter), a condition required in order to ensure proper regulation of a6 gene transcription. This study demonstrates the importance of the transcription factors Spl, Sp3 and NFI in the transcription regulation of the a6 gene during corneal wound healing. In addition, the global influence of laminin in the response of the corneal epithelial cells following activation of the a6|31 and a6(34 integrins is further explored. In conclusion, the results presented in this work shed light at least in part on the extreme complexity of the gene regulation network that takes place at the corneal epithelium during wound healing