Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019. / Les fonctions des cellules épithéliales reposent sur la distribution asymétrique de différents constituants cellulaires, organisation structurale nommée polarité épithéliale. Plus de 80% des cancers sont d’origine épithéliale, et l’altération de la polarité cellulaire contribue à la progression du cancer. L’élucidation des mécanismes moléculaires contrôlant la polarité épithéliale est donc primordiale. La protéine Yurt permet de maintenir l’intégrité de la membrane latérale et de limiter la croissance de la membrane apicale dans les épithéliums polarisés. Les orthologues humains de Yurt, EHM2 et EPB41L5, sont surexprimés dans des cellules cancéreuses hautement métastatiques et sont associés à un mauvais pronostic. EPB41L5 est aussi impliquée dans la transition épithélio-mésenchymateuse et dans la formation des métastases. Le développement d’inhibiteurs de EHM2 et EPB41L5 pourrait donc contrer la progression tumorale. L’objectif général de mon doctorat était de mieux comprendre les modes de régulation de ces protéines, ce qui est un préalable essentiel pour la mise en place de stratégies thérapeutiques dans le contexte du cancer. Durant la polarisation des cellules épithéliales, Yurt est confinée à la membrane latérale et assure l’intégrité de ce domaine membranaire en réprimant la machinerie apicale. Aux stades tardifs de l’embryogenèse, le recrutement apical de Yurt permet de restreindre la taille de la membrane apicale. Néanmoins, les mécanismes moléculaires soutenant la dynamique spatiotemporelle de Yurt, et les mécanismes précis par lesquels Yurt inhibe la machinerie apicale étaient non définis. Au cours de mon doctorat, nous avons montré que la kinase apicale aPKC phosphoryle Yurt pour empêcher sa localisation apicale prématurée. Une version non phosphorylable de Yurt démantèle le domaine apical, indiquant que l’exclusion apicale de Yurt dépendante de aPKC est cruciale pour la polarité épithéliale. En retour, Yurt antagonise les fonctions de aPKC pour prévenir l’apicalisation de la membrane plasmique. La capacité de Yurt à lier et restreindre les fonctions de aPKC est centrale pour son rôle dans la polarité épithéliale. En effet, déléter le site de liaison à aPKC neutralise l’activité de Yurt. Ainsi, Yurt et aPKC sont impliquées dans une relation antagoniste bidirectionnelle qui contribue à la ségrégation des domaines membranaires, ce qui soutient l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. iv Ensuite, pour comprendre plus en profondeur comment est modulée l’activité de Yurt, nous avons investigué les propriétés biochimiques de Yurt et de ses orthologues. Ces protéines appartiennent à la famille des protéines à domaine « Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin » (FERM). Elles possèdent également un domaine adjacent à FERM (FA pour « FERM-adjacent »), définissant un sous-groupe de la famille FERM. Certaines protéines de cette famille ont la capacité de former des homo-oligomères, ce qui module leurs fonctions. Nos résultats indiquent que Yurt et EPB41L5 sont également capables de s’homo-oligomériser. Nous avons démontré que l’unité FERM-FA définit une interface oligomérique. De plus, nous avons montré que la phénylalanine 281 (F281) et le tryptophane 283 (W283) sont particulièrement importants pour l’interaction homotypique de Yurt. En effet, la substitution de ces résidus en arginine (R) abolit l’interaction homotypique de Yurt in vitro. Nous avons alors généré une lignée de drosophile exprimant YurtF281R, W283R à partir du locus endogène yurt grâce à la technique CRISPR/Cas9. Les embryons exprimant YurtF281R, W283R sont phénotypiquement similaires aux embryons complètement dépourvus de Yurt, suggérant fortement que la multimérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Nous avons également démontré que la kinase aPKC déstabilise l’oligomère de Yurt conduisant à une répression de ses fonctions. Ceci révèle un mécanisme par lequel cette kinase supporte la formation du domaine apical. En résumé, mes travaux de doctorat ont permis de décrypter le mécanisme d’exclusion apicale de Yurt par la kinase aPKC dans les cellules épithéliales immatures. Nous avons également mis en évidence une relation antagoniste bidirectionnelle entre Yurt et aPKC. Ceci contribue à maintenir la bonne ségrégation des domaines membranaires, et ainsi soutenir l’architecture fonctionnelle des tissus épithéliaux. De plus, nous avons démontré que l’oligomérisation de Yurt est cruciale pour ses fonctions in vivo. Cette propriété biochimique est conservée chez son orthologue humain EPB41L5. Ceci offre donc une opportunité unique dans la lutte contre le cancer. En effet, des composés interférant avec cette oligomérisation pourraient limiter l’activité de EPB41L5, et ainsi combattre la progression tumorale. / The polarized architecture of epithelial cells along the apical-basal axis is crucial for epithelial tissue morphogenesis, physiology and homeostasis. Over 80% of cancers are of epithelial origin, and the alteration of cell polarity contributes to cancer progression. Elucidating the molecular mechanisms controlling epithelial polarity is therefore essential. The protein Yurt stabilizes the lateral membrane and limits apical membrane growth in polarized epithelia. The human Yurt orthologs EHM2 and EPB41L5 are overexpressed in many cancers. This correlates with poor outcome for patients. EPB41L5 also supports epithelial-mesenchymal transition and metastasis. Elaborating strategies limiting EHM2 and EPB41L5 activity is of special interest in oncology. The general objective of my PhD was to decipher the regulation of these proteins to pave the way for new therapeutic strategies for the treatment of cancer. During organogenesis, Yurt is confined to the lateral membrane and supports the stability of this membrane domain by repressing the apical machinery. At later stages of embryogenesis, the apical recruitment of Yurt establishes a local negative regulatory feedback loop that restricts the size of the apical membrane. However, the molecular basis sustaining the spatiotemporal dynamics of Yurt, and the precise mechanisms by which Yurt inhibits apical promoting factors were undefined. During the first part of my Ph.D., we demonstrated that aPKC phosphorylates Yurt to prevent its premature apical localization. A non-phosphorylatable version of Yurt dominantly dismantles the apical domain, showing that its aPKC-mediated exclusion is crucial for epithelial cell polarity. In return, Yurt counteracts aPKC functions to prevent apicalization of the plasma membrane. The ability of Yurt to bind and restrain aPKC signaling is central for its role in polarity, as removal of the aPKC binding site neutralizes Yurt activity. Thus, Yurt and aPKC are involved in a reciprocal antagonistic regulatory loop that contributes to the segregation of discrete and mutually exclusive membrane domains, thereby sustaining the functional architecture of epithelial tissues. To further define how Yurt activity is modulated, we investigated the biochemical properties of Yurt and its orthologs. Yurt and EPB41L5 belong to the Four-point-one, Ezrin, Radixin, Moesin (FERM) domain protein family. These proteins also contain a FERM-adjacent (FA) domain which defines a subfamily of FERM proteins. Some proteins of this superfamily have the ability to multimerize. Our results indicate that both Yurt and EPB41L5 oligomerize. Our data also establish that the FERM-FA unit forms an oligomeric interface, and that multimerization of Yurt is crucial for its function in epithelial cell polarity regulation. Finally, we demonstrated that aPKC destabilizes the Yurt oligomer to repress its functions, thereby revealing a mechanism through which this kinase supports apical domain formation. In summary, my Ph.D. work has deciphered the mechanism sustaining the apical exclusion of Yurt by aPKC in immature epithelial cells. We have also demonstrated a reciprocal antagonistic regulatory loop between Yurt and aPKC. This contributes to maintaining the proper segregation of membrane domains, and thus supporting the functional architecture of epithelial tissues. In addition, we have demonstrated that Yurt oligomerization is crucial for its in vivo functions. This biochemical property is conserved in its human ortholog EPB41L5. This offers a unique opportunity in the fight against cancer. Indeed, compounds interfering with this oligomerization could limit the activity of EPB41L5, and thus counteract tumor progression.

Titre de l'écran-titre (visionné le 1er mai 2023) / Introduction. La transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) est associée à la perte de polarité épithéliale et à l'acquisition d'une invasion accrue. La polarité épithéliale divise les cellules épithéliales en domaines apical, latéral et basal, et elle est importante pour le bon fonctionnement des tissus. La protéine Drosophila Yurt (Yrt), localisée corticalement, oligomérise via ses domaines FERM et FERM-FA et est importante dans la régulation de la polarité épithéliale. Ses orthologues humains, EPB41L5 et EPB41L4B, sont surexprimés dans plusieurs cancers épithéliaux. De plus, leur surexpression favorise la formation de métastases et est associée à un mauvais pronostic. Ainsi, ces protéines seraient des cibles importantes pour limiter les métastases. Cependant, la régulation de Yrt n'est pas encore complètement élucidée. Nous avons émis l'hypothèse que la localisation subcellulaire est cruciale pour la fonction de Yrt et de ses orthologues humains. Le but de cette étude était d'élucider les domaines structuraux de Yrt lui permettant de s'associer au cortex cellulaire et les mécanismes régulant cette localisation. Méthodologie. Une analyse structure-fonction couplée à l'immunofluorescence a été réalisée pour identifier les domaines responsables de la localisation corticale de Yrt in vivo. De plus, la quantification du signal cortical et cytoplasmique des différentes constructions Yrt a été effectuée. L'impact fonctionnel a été analysé à partir de cuticules embryonnaires. Résultats. Nous avons découvert que le motif basique et hydrophobe (BH) dans les lobes F1 et F3 du domaine FERM de Yrt influence son ciblage cortical. Les motifs BH contiennent des résidus chargés positivement qui interagissent avec les phospholipides membranaires chargés négativement par le biais d'interactions électrostatiques. De plus, nous avons constaté que lorsque Yrt est mal localisé au cortex cellulaire, sa fonction est affectée. Conclusion. Nos résultats mettent en évidence le rôle important du ciblage de la membrane électrostatique du Yrt. Ces connaissances pourraient ainsi contribuer au développement de stratégies thérapeutiques innovantes contre les orthologues humains Yrt dans la tumorigenèse. / Introduction. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is associated with the loss of epithelial polarity and the acquisition of enhanced invasion. Epithelial polarity divides epithelial cells into apical, lateral, and basal domains, and it is important for proper tissue function. The cortically localized Drosophila Yurt (Yrt) protein oligomerizes via its FERM and FERM-FA domains in regulating epithelial polarity. Its human orthologs, EPB41L5 and EPB41L4B, are over expressed in several epithelial cancers. Furthermore, their overexpression promotes metastasis leading to overall poor survival and prognosis. Thus, these proteins would be significant targets in limiting metastasis. However, the exact mode of Yrt regulation is yet to be fully elucidated. We hypothesized that subcellular localization is crucial for Yrt regulation and its human orthologs. Thus, we elucidated the domains and subdomains of Yrt allowing it to target the cell cortex and the mechanisms regulating this localization. Methods. A structure-function analysis was performed coupled with immunofluorescence to identify the domains responsible for the cortical localization of Yrt in vivo. Also, we quantified the signal intensity at the cortical and cytoplasmic region for the various Yrt constructs tested. We further analyzed the functional impact using embryonic cuticle. Results. We discovered that the basic and hydrophobic motifs within the F1 and F3 lobes of the FERM domain influences Yrt cortical targeting. These motifs contain positively charged residues that interact with negatively charged membrane phospholipids through electrostatic interactions. Moreover, we found that when Yrt is mislocalized from the cell cortex, its function is impacted. Conclusion. Our findings highlight the important roles of electrostatics and oligomerization in the cortical targeting of the Yrt. This knowledge could thus contribute to the development of innovative therapeutic strategies against Yrt human orthologs in tumorigenesis.

Les tissus épithéliaux recouvrent les surfaces et les cavités du corps et fonctionnent comme des barrières sélectives capables d'échanges entre les différents compartiments de l'organisme. La fonctionnalité de ces tissus repose notamment sur la mise en place et le maintien d'une asymétrie structurale des cellules épithéliales, aussi appelée « polarité épithéliale ». La modulation des mécanismes orchestrant l'asymétrie membranaire est centrale dans la formation et le maintien de l'architecture des tissus épithéliaux. Ainsi, des défauts de polarité épithéliale provoquent des anomalies morphologiques et fonctionnelles des tissus épithéliaux, qui peuvent contribuer au cancer chez l'Homme. C'est pourquoi, la compréhension des processus liés à la polarité épithéliale constitue des objectifs cruciaux dans la biologie des épithéliums et dans la santé humaine, pour assurer le développement de nouvelles thérapies liées au rétablissement des fonctions soutenues par une asymétrie membranaire. Les mécanismes de polarité épithéliale et leurs fonctions signalétiques dans la morphogenèse des tissus épithéliaux jouent un rôle central dans ma thèse et font l'objet de mon introduction. Mon projet de doctorat a consisté à caractériser la fonction et la régulation de Crumbs, un acteur clé dans la mise en place du domaine apical, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et dans la morphogenèse des tissus épithéliaux. C'est pourquoi, l'étude de la régulation de la fonction de Crb au sein de la cellule épithéliale revêt un rôle capital dans la compréhension de la biologie des épithéliums. Dans ce cadre, nous avons d'abord permis d'approfondir les modalités d'une éventuelle fonction du domaine extracellulaire de CRB3A. De plus, nous montrons que la GTPase Rac1 permet de contrôler Crumbs dans un contexte tridimensionnel. Ainsi, nous proposons un modèle fonctionnel de Crumbs, soutenu par des approches in vitro et in vivo, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et la morphogenèse des tissus tridimensionnels.

Objectif: Crumbs3 (CRB3) est essentielle pour la polarité épithéliale et la formation des jonctions serrées. Deux isoformes de CRB3 ont été identifiés, soit CRB3A et CRB3B. Les fonctions et la localisation de ces protéines demeurent méconnues. Notre objectif était d'étudier la localisation de ces protéines dans différentes lignées épithéliales et leur fonction par identification de partenaires d'interaction. Méthodes: Nous avons produit un gène de fusion HIS-CRB3A qui a été exprimé dans des cellules d'insectes, puis le produit de ce gène a été purifié à l'aide de billes magnétiques. La protéine HIS-CRB3 isolée a servie d'appât pour isoler des partenaires d'interaction par spectrométrie de masse à partir d'un homogénat de cellules épithéliales humaines (Caco-2). Résultats : L'analyse en spectrométrie de masse a révélé que plusieurs importines et exportines interagissent avec CRB3, suggérant que CRB3 puisse se localiser au niveau du noyau. En accord avec cette hypothèse, l'analyse de la séquence de CRB3 montre un NLS et un NES potentiels. De plus, par immunofluorescence et fractionnement cellulaire, nous avons montré que CRB3B se situe au niveau du noyau. Par contre, la localisation de CRB3A est restreinte à la membrane plasmique. Conclusion : Nous avons identifié des partenaires d'interaction de CRB3 qui laisse présager des fonctions insoupçonnées pour cette protéine.

La polarité apico-basale des cellules épithéliales est indispensable au maintien de l’intégrité des tissus et sa dérégulation contribue à la progression tumorale. L’interaction antagoniste des protéines basolatérales Lethal giant larvae (Lgl) et Yurt (Yrt) avec les composants apicaux Crumbs (Crb) et la protéine kinase C atypique (aPKC) permet de définir le domaine apical et latéral. Crb et aPKC sont cruciales à la croissance du domaine apical. Les domaines apical et latéral sont délimités par les jonctions adhérentes (JA), une structure impliquée dans la cohésion cellulaire et la polarité. La protéine Girdin est essentielle à la morphogenèse des tissus épithéliaux chez Drosophila melanogaster et régule la stabilité des JA. Notre objectif est de déterminer si Girdin joue un rôle dans la polarité épithéliale et, si oui, via quels mécanismes. Nous avons montré que la diminution du niveau de Girdin, mais pas celle de composantes majeures des JA, amplifie l’apicalisation des cellules épithéliales dans les mutants zygotiques lgl ou yrt. L’activité résiduelle de Lgl et Yrt est donc réprimée suite à la réduction du niveau de girdin, possiblement suite à une sur-activation de leur répresseur aPKC. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’activité de girdin restaure partiellement l’intégrité épithéliale des embryons déplétés en aPKC ou mutants hypomorphes crb, un substrat apical d’aPKC, ce qui suggère que Girdin réprime l’activité d’aPKC et de Crb. Nous avons constaté que l’absence de Girdin entraîne une augmentation du niveau de phosphorylation de Yrt et Lgl, deux substrats basolatéraux d’aPKC. Girdin pourrait donc, tout en régulant les JA, moduler l’activité d’aPKC en s’y liant directement ou en s’associant à Yrt ou Lgl, deux protéines qui répriment aPKC et Crb. Nos résultats indiquent que Girdin agit comme régulateur négatif d’aPKC. Ceci place Girdin au coeur de la régulation de la polarité épithéliale, la morphogenèse tissulaire et la progression tumorale. / Apical-basal polarization of epithelial cells is indispensable for maintaining tissue integrity, and its deregulation contributes to tumor progression. The antagonistic interactions between the basolateral proteins Lethal giant larvae (Lgl) and Yurt (Yrt) and the apical components Crumbs (Crb) and the atypical protein kinase C (aPKC) define apical and basolateral domains. Crb and aPKC are essential for apical membrane growth. The apical and lateral domains are segregated by adherens junctions (AJ), a structure involved in cell-cell cohesion and polarity. The protein Girdin is essential for epithelial tissues morphogenesis in Drosophila melanogaster and mediates AJ stabilization. Our objective is to determine if Girdin has a role in regulating epithelial polarity. We have shown that reducing Girdin levels, but not the levels of other major AJ components, exacerbates the apicalization of epithelial cells in lgl or yrt zygotic mutants. Residual activity of Lgl and Yrt is thus repressed when girdin dosage is reduced, probably due to an over-activation of their repressor aPKC. Moreover, we observed that a reduction of girdin activity partially rescues the epithelial integrity of aPKC-depleted or hypomorphic crb mutant embryos, Crb being an apical substrate of aPKC. This suggests that Girdin represses aPKC and Crb activity. We noticed that the absence of Girdin leads to an increase of the basolateral aPKC substrates Yrt and Lgl phosphorylation levels. Therefore, in parallel to regulating the AJ complex, Girdin may modulate aPKC activity by either interacting directly with the kinase or by associating to Yrt or Lgl, two repressors of aPKC and Crb. Our results indicate that Girdin acts as a negative regulator of aPKC. This places Girdin as a hub in epithelial polarity regulation, tissue morphogenesis and tumor progression.

La polarisation apico-basale des cellules épithéliales est cruciale pour le maintien de l'intégrité des tissus épithéliaux et sa perte contribue à la progression tumorale. Les protéines établissant cette polarité sont divisées en modules apicaux et basolatéraux qui s'excluent mutuellement de leur domaine respectif. La zonula adherens (ZA) forme l'interface entre ces deux domaines. La ZA joue aussi un rôle clé dans la cohésion intercellulaire et la morphogenèse épithéliale. Elle est composée de protéines d'adhésion, d'une ceinture d'actomyosine et de protéines de polarité. L'homéostasie épithéliale est déterminée par une fine collaboration entre les protéines de polarité et celles de la ZA. Le but de mon doctorat a été d'étudier ce lien existant entre les protéines de polarité et celles composant la ZA. Pour cela, au laboratoire nous utilisons un outil in vivo avantageux se nommant Drosophila melanogaster ainsi que des modèles de cellules épithéliales humaines cultivées en 2 ou 3 dimensions. Dans un premier temps, mes travaux de thèse se sont concentrés sur les protéines Girdin. Girdin chez la drosophile et GIRDIN, son orthologue humain, sont des protéines d'échafaudage qui sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont celui qui nous a principalement intéressé au cours de mon doctorat : l'adhésion intercellulaire. Au laboratoire, Dre Élise Houssin a montré que Girdin renforçait l'ancrage des protéines d'adhésion à la ceinture d'actomyosine constituant la ZA (Houssin et al., 2015), une fonction conservée chez son orthologue humain (Wang et al., 2018a). De plus, GIRDIN interagit physiquement avec des protéines de polarité, telles que Par3 et aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015). Nous avons donc émis l'hypothèse que les protéines Girdin jouaient un rôle dans le maintien de la polarité épithéliale. Pour y répondre, nous avons réalisé des interactions génétiques entre girdin et différents gènes de polarité. L'interprétation de l'ensemble de nos résultats indique que Girdin et son orthologue soutiennent les déterminants latéraux de polarité en réprimant l'activité de la kinase apicale aPKC. De plus, nous avons mis en lumière que la sous-expression de GIRDIN est associée à la dissémination de cellules issues de sphères tumorales, un phénomène également observé in vivo pour son orthologue de drosophile (Houssin et al., 2015). La perte de la polarité épithéliale ainsi que la dissémination cellulaire observées dans les sphères tumorales sous-exprimant GIRDIN indiquent qu'elle pourrait contrer la progression tumorale en maintenant la polarité épithéliale et la cohésion cellulaire. Nos observations ont été appuyées par l'analyse de tissus tumoraux de patients qui a établi un lien entre l'altération de l'expression de GIRDIN et une faible espérance de survie de ces patients dans deux sous-types de cancer du sein et du poumon. Dans un deuxième temps, les travaux présentés dans cette thèse ont également contribué à une meilleure compréhension du rôle de la protéine Yurt (Yrt) dans le maintien de l'architecture épithéliale (chapitre 2 et 3). Tout d'abord, nous avons mis en lumière le rôle de cette protéine de polarité dans l'induction de la tension épithéliale. La caractérisation de cette fonction nous a permis d'explorer les régulateurs et effecteurs de Yrt. Ainsi, nous avons constaté que Yrt est recrutée au domaine apical par la protéine apicale Crumbs pour promouvoir la tension épithéliale. De plus, la kinase aPKC et le module Pak1-PP2A ont des effets antagonistes sur son activité. aPKC phosphoryle Yrt pour l'inhiber alors que l'axe Pak1-PP2A la déphosphoryle afin d'induire son activité. J'ai également étudié le rôle d'un partenaire physique de Yrt, la NAD synthetase (Nadsyn) qui m'a conduit à explorer une nouvelle voie de signalisation effectrice de Yrt. En effet, nous avons constaté que Yrt pourrait recruter la Nadsyn aux membranes plasmiques pour produire localement du NAD⁺, le co-substrat de la famille des sirtuines, activant ces déacétylases. Cette activation locale permettrait de désacétyler des protéines clés de la contraction cellulaire et/ou de la polarité épithéliale afin de réguler l'architecture épithéliale. Ces deux études dévoilent les modes de régulation et d'action de la protéine Yrt chez la drosophile. Ses deux orthologues étant fortement surexprimés dans de nombreux cancers agressifs, il sera pertinent de valider la conservation de ces mécanismes chez l'humain, afin de déceler de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'homéostasie épithéliale. La perte de l'architecture épithéliale étant étroitement liée à la progression tumorale, ses travaux ouvrent la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Epithelia form the basis of animal tissue architecture, establishing a barrier against diffusion and providing mechanical structure by their apico-basal asymmetry and adhesive properties. This apico-basal polarity is regulated through various polarity protein complexes characterized by a mutual antagonism between apical and basolateral complexes. Cells adhere to each other with the major cohesive and contractile adhesion of epithelial cells, the zonula adherens (ZA). The ZA machinery contains a strong cohesive complex linked to an actomyosin belt, and forms the interface between the apical and basolateral domains. This actomyosin belt is the main modulator of the epithelial tension. Apico-basal proteins collaborate with the ZA machinery to control tissue architecture homeostasis. Loss of epithelial architecture, such as apico-basal polarity loss or cell-cell cohesion loss, is a hallmark of tumoral progression. My PhD work was aimed at deciphering the molecular mechanisms controlling epithelial polarity and ZA homeostasis using the sophisticated in vivo model Drosophila melanogaster. First, we investigated the role of the scaffold Girdin proteins in epithelial architecture. Previously in the laboratory, the drosophila Girdin protein has been shown to localize at and to reinforce the ZA cohesion (Houssin et al., 2015), a function shared by its human ortholog GIRDIN (Wang et al., 2018a). Furthermore, GIRDIN has been shown to physically interact with polarity proteins such as Par3 and aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015), but its role in cell polarity remained unclear. Using genetic interactions combined with biochemistry technics we demonstrated that Girdin proteins support basolateral determinants by negatively regulating the apical kinase aPKC. In addition, we observed cell detachment and dissemination from GIRDIN knockdown cysts, a phenomenon also reported in girdin null embryos (Houssin et al., 2015). Thus, GIRDIN is required for the cohesion of multicellular epithelial structures that is crucial to prevent various pathological conditions such as cancer progression (Halaoui & McCaffrey, 2015). Indeed, we found a correlation between a low expression of GIRDIN mRNA and a decreased survival in more aggressive breast cancer subtypes and lung adenocarcinoma. The second and third result chapters show that the Drosophila polarity protein Yrt plays a role in epithelial tension and explore the upstream activators and downstream effectors pathways of Yrt. Yrt was previously shown to limit the ability of Crumbs to promote apical membrane growth, thereby defining proper apical/lateral membrane ratio in epithelial cells (Laprise et al., 2006; Laprise et al., 2009). Our results show that Yrt, by interacting with Crumbs, also induces epithelial tension by organizing the apical localization of the non-muscle myosin II, which is needed during embryogenesis. Mechanistically, the apical kinase aPKC phosphorylates Yurt, thereby dislodging Yrt from the apical domain and releasing apical tension. In contrast, the Pak1- PP2A module promotes Yrt dephosphorylation, leading to its apical localization and function. We then investigated how Yrt could reorganize the cytoskeleton to induce epithelial tension. We performed a genetic screen on the Yrt physical interactome. We identified the NAD synthetase (Nadsyn), an enzyme responsible for the de novo NAD⁺ synthesis, as a strong interactor of Yrt. We observed that Yrt recruits Nadsyn to the plasma membrane and that apical constriction induced by Yrt is Nadsyn- and NAD⁺-dependent. Based on these novel findings, we proposed that Yrt may recruit Nadsyn to locally produce a NAD⁺ pool that activates the deacetylases Sirtuin1 or 2, thereby deacetylating proteins involved in cell contractility and cell polarity. This model remains to be clarified by further work. Since Yrt's human orthologs are overexpressed in many epitheliaderived tumors and are associated with a poor survival outcome, deciphering whether the signaling pathways uncovered in our work are preserved in humans could help uncovering novel therapeutic approaches. In conclusion, my PhD work dissected the role of new proteins and pathways involved in the maintenance of epithelial cell architecture. Since the maintenance of an epithelial structure counteracts tumor progression, it also highlights new therapeutic possibilities.

La polarisation apico-basale des cellules épithéliales est cruciale pour le maintien de l'intégrité des tissus épithéliaux et sa perte contribue à la progression tumorale. Les protéines établissant cette polarité sont divisées en modules apicaux et basolatéraux qui s'excluent mutuellement de leur domaine respectif. La zonula adherens (ZA) forme l'interface entre ces deux domaines. La ZA joue aussi un rôle clé dans la cohésion intercellulaire et la morphogenèse épithéliale. Elle est composée de protéines d'adhésion, d'une ceinture d'actomyosine et de protéines de polarité. L'homéostasie épithéliale est déterminée par une fine collaboration entre les protéines de polarité et celles de la ZA. Le but de mon doctorat a été d'étudier ce lien existant entre les protéines de polarité et celles composant la ZA. Pour cela, au laboratoire nous utilisons un outil in vivo avantageux se nommant Drosophila melanogaster ainsi que des modèles de cellules épithéliales humaines cultivées en 2 ou 3 dimensions. Dans un premier temps, mes travaux de thèse se sont concentrés sur les protéines Girdin. Girdin chez la drosophile et GIRDIN, son orthologue humain, sont des protéines d'échafaudage qui sont impliquées dans de multiples processus cellulaires dont celui qui nous a principalement intéressé au cours de mon doctorat : l'adhésion intercellulaire. Au laboratoire, Dre Élise Houssin a montré que Girdin renforçait l'ancrage des protéines d'adhésion à la ceinture d'actomyosine constituant la ZA (Houssin et al., 2015), une fonction conservée chez son orthologue humain (Wang et al., 2018a). De plus, GIRDIN interagit physiquement avec des protéines de polarité, telles que Par3 et aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015). Nous avons donc émis l'hypothèse que les protéines Girdin jouaient un rôle dans le maintien de la polarité épithéliale. Pour y répondre, nous avons réalisé des interactions génétiques entre girdin et différents gènes de polarité. L'interprétation de l'ensemble de nos résultats indique que Girdin et son orthologue soutiennent les déterminants latéraux de polarité en réprimant l'activité de la kinase apicale aPKC. De plus, nous avons mis en lumière que la sous-expression de GIRDIN est associée à la dissémination de cellules issues de sphères tumorales, un phénomène également observé in vivo pour son orthologue de drosophile (Houssin et al., 2015). La perte de la polarité épithéliale ainsi que la dissémination cellulaire observées dans les sphères tumorales sous-exprimant GIRDIN indiquent qu'elle pourrait contrer la progression tumorale en maintenant la polarité épithéliale et la cohésion cellulaire. Nos observations ont été appuyées par l'analyse de tissus tumoraux de patients qui a établi un lien entre l'altération de l'expression de GIRDIN et une faible espérance de survie de ces patients dans deux sous-types de cancer du sein et du poumon. Dans un deuxième temps, les travaux présentés dans cette thèse ont également contribué à une meilleure compréhension du rôle de la protéine Yurt (Yrt) dans le maintien de l'architecture épithéliale (chapitre 2 et 3). Tout d'abord, nous avons mis en lumière le rôle de cette protéine de polarité dans l'induction de la tension épithéliale. La caractérisation de cette fonction nous a permis d'explorer les régulateurs et effecteurs de Yrt. Ainsi, nous avons constaté que Yrt est recrutée au domaine apical par la protéine apicale Crumbs pour promouvoir la tension épithéliale. De plus, la kinase aPKC et le module Pak1-PP2A ont des effets antagonistes sur son activité. aPKC phosphoryle Yrt pour l'inhiber alors que l'axe Pak1-PP2A la déphosphoryle afin d'induire son activité. J'ai également étudié le rôle d'un partenaire physique de Yrt, la NAD synthetase (Nadsyn) qui m'a conduit à explorer une nouvelle voie de signalisation effectrice de Yrt. En effet, nous avons constaté que Yrt pourrait recruter la Nadsyn aux membranes plasmiques pour produire localement du NAD⁺, le co-substrat de la famille des sirtuines, activant ces déacétylases. Cette activation locale permettrait de désacétyler des protéines clés de la contraction cellulaire et/ou de la polarité épithéliale afin de réguler l'architecture épithéliale. Ces deux études dévoilent les modes de régulation et d'action de la protéine Yrt chez la drosophile. Ses deux orthologues étant fortement surexprimés dans de nombreux cancers agressifs, il sera pertinent de valider la conservation de ces mécanismes chez l'humain, afin de déceler de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'homéostasie épithéliale. La perte de l'architecture épithéliale étant étroitement liée à la progression tumorale, ses travaux ouvrent la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / Epithelia form the basis of animal tissue architecture, establishing a barrier against diffusion and providing mechanical structure by their apico-basal asymmetry and adhesive properties. This apico-basal polarity is regulated through various polarity protein complexes characterized by a mutual antagonism between apical and basolateral complexes. Cells adhere to each other with the major cohesive and contractile adhesion of epithelial cells, the zonula adherens (ZA). The ZA machinery contains a strong cohesive complex linked to an actomyosin belt, and forms the interface between the apical and basolateral domains. This actomyosin belt is the main modulator of the epithelial tension. Apico-basal proteins collaborate with the ZA machinery to control tissue architecture homeostasis. Loss of epithelial architecture, such as apico-basal polarity loss or cell-cell cohesion loss, is a hallmark of tumoral progression. My PhD work was aimed at deciphering the molecular mechanisms controlling epithelial polarity and ZA homeostasis using the sophisticated in vivo model Drosophila melanogaster. First, we investigated the role of the scaffold Girdin proteins in epithelial architecture. Previously in the laboratory, the drosophila Girdin protein has been shown to localize at and to reinforce the ZA cohesion (Houssin et al., 2015), a function shared by its human ortholog GIRDIN (Wang et al., 2018a). Furthermore, GIRDIN has been shown to physically interact with polarity proteins such as Par3 and aPKC (Ohara et al., 2012; Sasaki et al., 2015), but its role in cell polarity remained unclear. Using genetic interactions combined with biochemistry technics we demonstrated that Girdin proteins support basolateral determinants by negatively regulating the apical kinase aPKC. In addition, we observed cell detachment and dissemination from GIRDIN knockdown cysts, a phenomenon also reported in girdin null embryos (Houssin et al., 2015). Thus, GIRDIN is required for the cohesion of multicellular epithelial structures that is crucial to prevent various pathological conditions such as cancer progression (Halaoui & McCaffrey, 2015). Indeed, we found a correlation between a low expression of GIRDIN mRNA and a decreased survival in more aggressive breast cancer subtypes and lung adenocarcinoma. The second and third result chapters show that the Drosophila polarity protein Yrt plays a role in epithelial tension and explore the upstream activators and downstream effectors pathways of Yrt. Yrt was previously shown to limit the ability of Crumbs to promote apical membrane growth, thereby defining proper apical/lateral membrane ratio in epithelial cells (Laprise et al., 2006; Laprise et al., 2009). Our results show that Yrt, by interacting with Crumbs, also induces epithelial tension by organizing the apical localization of the non-muscle myosin II, which is needed during embryogenesis. Mechanistically, the apical kinase aPKC phosphorylates Yurt, thereby dislodging Yrt from the apical domain and releasing apical tension. In contrast, the Pak1- PP2A module promotes Yrt dephosphorylation, leading to its apical localization and function. We then investigated how Yrt could reorganize the cytoskeleton to induce epithelial tension. We performed a genetic screen on the Yrt physical interactome. We identified the NAD synthetase (Nadsyn), an enzyme responsible for the de novo NAD⁺ synthesis, as a strong interactor of Yrt. We observed that Yrt recruits Nadsyn to the plasma membrane and that apical constriction induced by Yrt is Nadsyn- and NAD⁺-dependent. Based on these novel findings, we proposed that Yrt may recruit Nadsyn to locally produce a NAD⁺ pool that activates the deacetylases Sirtuin1 or 2, thereby deacetylating proteins involved in cell contractility and cell polarity. This model remains to be clarified by further work. Since Yrt's human orthologs are overexpressed in many epitheliaderived tumors and are associated with a poor survival outcome, deciphering whether the signaling pathways uncovered in our work are preserved in humans could help uncovering novel therapeutic approaches. In conclusion, my PhD work dissected the role of new proteins and pathways involved in the maintenance of epithelial cell architecture. Since the maintenance of an epithelial structure counteracts tumor progression, it also highlights new therapeutic possibilities.

Les épithéliums recouvrent l’ensemble des surfaces et des cavités internes du corps humain. Le fonctionnement des cellules épithéliales repose sur la répartition des constituants cellulaires au sein de compartiments distincts : un compartiment apical, un compartiment latéral, et un compartiment basal : c’est ce que l’on appelle la polarité apico-basale. Plus de 80 % des cancers proviennent d’un dérèglement des cellules épithéliales. De plus, la polarité épithéliale est perdue lors des stades avancés du cancer, suggérant qu’elle contribue activement à la progression tumorale. C’est pourquoi il apparaît crucial de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la polarité épithéliale. La polarité est assurée par un ensemble de protéines réparties au sein des différents compartiments et agissant sous forme de modules très dynamiques. Un de ces modules est articulé autour de la protéine CRB3, qui agit comme un déterminant apical essentiel des cellules épithéliales. L’expression de CRB3 est perdue dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses en culture, suggérant que CRB3 pourrait détenir des fonctions inhibitrices de certains processus liés à l’avancement tumoral. Cependant, l’impact fonctionnel de la perte de CRB3 dans ces lignées cancéreuses reste encore peu connu, tout comme les mécanismes signalétiques agissant en aval de CRB3. Les travaux présentés dans cette thèse mettent en lumière de nouvelles évidences concernant le rôle fonctionnel de la perte de CRB3 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses. Plus précisément, nous montrons que CRB3 détient un rôle signalétique important lui conférant une fonction à la fois dans la morphogenèse épithéliale, mais également dans le maintien de l’intégrité épithéliale. Dans un premier temps, nous montrons que la ré-expression de CRB3 dans des cellules cancéreuses d’origine épithéliale permet le rétablissement d’une morphologie de type épithéliale, en lien avec l’organisation d’un réseau circonférentiel d’acto-myosine. Nous identifions également le sentier signalétique activé en aval de CRB3 et menant à l’activation de la petite GTPase RhoA, nécessaire au remodelage de la morphologie et du réseau d’acto-myosine des cellules cancéreuses. Ce sentier semble notamment jouer un rôle important en aval de CRB3 pour limiter la migration cellulaire. Ensuite, nous montrons que CRB3 contrôle différents sentiers signalétiques, et notamment la voie ERK MAP Kinase, une voie de signalisation fortement dérégulée dans le cancer. Bien que le rôle fonctionnel de cette régulation soit encore inconnu, elle pourrait contribuer à limiter la progression tumorale en aval de CRB3. Enfin, nous montrons que la perte d’expression de Crb3 chez la souris induit une mortalité périnatale associée à des défauts de morphogenèse épithéliale, indiquant que Crb3 est requise pour la viabilité des souris et le développement des structures épithéliales. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes liant la perte de la polarité épithéliale à l’avancement du processus tumoral, et vise à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre le développement de cancers.

La polarité apico-basale des cellules épithéliales est essentielle aux fonctions des tissus épithéliaux. La protéine Yurt promeut l’identité de la membrane basolatérale et régule négativement l’activité de Crumbs par des mécanismes encore inconnus. Crumbs est un déterminant apical qui réprime la croissance tumorale et prévient la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Nous avons identifié la protéine CG5964 (ALBATROSS chez l’humain) comme un nouvel interacteur physique de Yurt. L’objectif de ma maîtrise est de réaliser l’analyse fonctionnelle de cette protéine (renommée Cérès chez la drosophile), par des méthodes biochimiques et génétiques (génération d’un allèle mutant et d’une lignée de surexpression). Nos résultats suggèrent que la protéine Cérès n’est pas impliquée dans la polarité épithéliale mais plutôt dans le maintien de l’équilibre énergétique. Mon projet apportera les données de base sur la protéine de drosophile Cérès qui n’avait jamais été caractérisée. La compréhension du rôle fonctionnel de l’interaction entre Cérès et Yurt pourrait révéler de nouvelles fonctions de Yurt. Dans l’optique d’utiliser Yurt comme cible thérapeutique pour lutter contre le cancer, il est important de connaître les différents processus biologiques dans lesquels Yurt est impliquée.

La plupart des fonctions des epitheliums simples, tel que le transport vectoriel, l'absorption et la sécrétion, sont possibles grâce à la polarité épithéliale. La polarité épithéliale est caractérisée par la distribution asymétrique des composants cellulaires selon un axe apico-basal. L'altération de la polarité épithéliale est observée dans la plupart des cancers d'origine épithéliale. Lors de la polarisation épithéliale, la protéine CRB3 joue un rôle prépondérant. En effet, en absence de CRB3, les cellules épithéliales possèdent une polarité défectueuse et les jonctions cellulaires sont altérées, tel qu'observé lors de la tumorigénèse. De plus, l'augmentation de la prolifération, de même qu'une meilleure survie cellulaire sont également observés lors de la tumorigénèse. Selon notre hypothèse, la perte de la protéine de polarité CRB3, qui permet le maintien du domaine apical, serait capable de favoriser la prolifération et la survie cellulaire. Dans le but de vérifier notre hypothèse, nous avons d'abord généré des lignées cellulaires exprimant myc-CRB3 et un mutant de deletion de myc-CRB3, myc-CRB3[delta]ERLI, et nous avons testé par xénogreffes la tumorigénicité de ces celles-ci. Les résultats obtenus ont montrés la capacité de CRB3 à restreindre la croissance tumorale. Le taux de prolifération a été testé in vitro et a montré que CRB3 est capable de moduler à la baisse le taux de prolifération cellulaire. Pour mieux comprendre comment CRB3 est capable de moduler la prolifération, les voie Wnt, MAPK-ERK1/2 et PI(3)K-AKT, toutes trois connues pour leur rôle dans la prolifération cellulaire, ont été étudiées. Dans un premier temps, l'implication de la voie Wnt a été vérifiée par essais luciférases dans un contexte de surexpression de la protéine CRB3. Les résultats ont montrés que CRB3 est incapable de réprimer la voie Wnt. Dans un deuxième temps, l'activité de la voie MAPK-ERK1/2 a été testée par le niveau de phosphorylation de ERK1/2. CRB3 n'a pas eu d'effet sur cette voie. Finalement, l'activité de la voie PI(3)K-AKT a été testée par le degré de phosphorylation de AKT. Les résultats obtenus à partir d'extraits de tumeurs montrent que l'expression de CRB3 atténue grandement le niveau de phosphorylation de AKT. De plus, l'expression de CRB3 a permis de diminuer le taux de prolifération cellulaire et de sensibiliser les cellules à l'apoptose, deux fonctions cellulaires contrôlées par la voie PI(3)K-AKT. La modulation de cette voie par CRB3 a été confirmée par les résultats obtenus dans des tests de prolifération en présence de LY294002, un inhibiteur de la PI(3)K. Cet inhibiteur a permis de ramener le taux de prolifération de CRB3[Delta]ERLI, la forme dominante négative de CRB3, au niveau de la prolifération des cellules n'exprimant pas myc-CRB3 ou myc-CRB3[delta]ERLI.Dans l'ensemble, les résultats obtenus montrent le rôle potentiel de CRB3 dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaires via la voie PI(3)K-AKT. Ceci amène une compréhension supplémentaire du rôle des régulateurs de la polarité épithéliale dans la suppression de cancers.