Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’asthme est une maladie des bronches qui affecte environ 300 millions de personnes mondialement. L’asthme sévère représente 10% de cette population et certains de ces asthmatiques ont des symptômes incontrôlés et une éosinophilie pulmonaire persistante malgré la prise quotidienne de fortes doses de corticostéroïdes. Un nombre élevé d’éosinophiles dans les voies aériennes est associé avec des symptômes incontrôlés, des exacerbations fréquentes et la sévérité de l’asthme. L’identification des facteurs responsables de cette éosinophilie est donc primordiale. Par conséquent, le but général de ma thèse était de comprendre les mécanismes impliqués dans le recrutement des éosinophiles dans l’asthme et sa sévérité. Le recrutement des éosinophiles du sang vers la lumière bronchique nécessite, entre autres, la participation de chimioattractants, de l’interleukine-5 et de molécules d’adhésion. Les éotaxines, CCL11, CCL24 et CCL26, sont des chimioattractants puissants et sélectifs pour l’éosinophile puisqu’elles se lient principalement sur le récepteur CCR3 présent sur l’éosinophile. Notre premier objectif était de comparer l’effet des différentes éotaxines sur la migration des éosinophiles d’asthmatiques et de sujets sains. Par la suite, nous avons focalisé nos études sur l’importance de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité. Étant donné que la CCL26 n’est pas exprimée chez les rongeurs, les études portant sur la CCL26 sont limitées comparativement à celles sur la CCL11 et la CCL24. À cet égard, notre deuxième objectif était d’évaluer le rôle de la CCL26 dans l’asthme et sa sévérité et de caractériser l’effet de l’IL-13 sur la production de la CCL26 par les cellules épithéliales bronchiques de sujets sains, asthmatiques légers et asthmatiques sévères éosinophiliques. Ensuite, le troisième objectif était d’investiguer les mécanismes impliqués dans la production de la CCL26 induite par l’IL-13 chez les cellules épithéliales bronchiques. Le quatrième objectif a permis d’évaluer l’importance de l’IL-5 dans le recrutement des éosinophiles, en étudiant l’effet de l’IL-5 sur la migration des éosinophiles induite par des médiateurs lipidiques, tels que l’acide 5-oxo-éicosatétraénoïque, la prostaglandine D2 et le 2- arachidonoyl-glycérol. Finalement, pour le cinquième objectif, nous avons évalué l’importance de la périostine, une protéine impliquée dans l’adhésion des éosinophiles, dans l’éosinophilie bronchique dans l’asthme. Pour conclure, les résultats obtenus dans cette thèse favoriseront l’identification de possibles cibles thérapeutiques pour diminuer l’éosinophilie pulmonaire persistante observée chez les asthmatiques sévères.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La fusion entre des cellules de rate de souris immunisées avec des suspensions de tumeurs primaires mammaires humaines et des cellules d'une lignée de myélome de souris a permis d’obtenir des anticorps monoclonaux reconnaissant les cellules épithéliales. De cette banque d'anticorps, trois réagissent contre des filaments cytoplasmiques. La caractérisation de ces anticorps monoclonaux a été faite à l'aide de techniques d'immunohistochimie, immunofluorescence et immunoperoxydase, en utilisant différentes lignées cellulaires humaines et différents tissus épithéliaux et non-épithéliaux humains, afin de connaître la spécificité des anticorps. Le poids moléculaire relatif des protéines reconnues par les anticorps a été déterminé par immunodétection de type western après transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose. Les résultats présentés dans ce mémoire concernent uniquement la caractérisation d'un anticorps monoclonal, 1B6, qui reconnaît spécifiquement plusieurs cytokératines. Par sa spécificité, cet anticorps est un marqueur des cytokératines, donc des cellules d'origine épithéliale normales et tumorales. Il représente ainsi un outil utile et unique à notre connaissance pour le diagnostic, en pathologie, de métastases d'origine épithéliale. Au niveau de la recherche fondamentale, il constitue un outil intéressant pour l'étude, entre autres de la différenciation cellulaire épithéliale et du rôle des cytokératines. / Montréal Trigonix inc. 2018

Introduction. La distribution asymétrique des composantes cellulaires au sein des cellules épithéliales résulte en une polarité apico-basale, laquelle divise la cellule en un domaine apical, un domaine latéral et un domaine basal. Cette polarité est essentielle à la physiologie des tissus épithéliaux et à l’homéostasie des organes. D’ailleurs, la perte de polarité épithéliale favorise la progression tumorale. Crumbs est une protéine de la polarité limitant la progression tumorale. Chez la drosophile, la protéine Yurt, associée au cortex cellulaire, inhibe Crumbs. De plus, les orthologues humains de Yurt – EPB41L5 et EPB41L4B – sont surexprimés dans plusieurs cancers. Leur surexpression amplifie la formation de métastases et est donc associée à un mauvais pronostic. Ces protéines seraient de bonnes cibles thérapeutiques, mais leurs modes de régulation sont peu connus. Nous émettons l’hypothèse que la localisation subcellulaire est importante pour la régulation de Yurt et ses orthologues. Ce projet vise à 1) définir les domaines de Yurt lui permettant de lier le cortex cellulaire et 2) déterminer les mécanismes régissant cette localisation. Méthodologie et résultats. Nous avons procédé à une analyse structure-fonction couplée à des immunofluorescences pour identifier les domaines protéiques responsables de la localisation corticale de Yurt. Diverses troncations et délétions au sein de la protéine nous ont permis d’identifier un motif basique et hydrophobe et un domaine Pleckstrin Homology-like au sein du domaine FERM permettant de cibler Yurt au cortex. Cette association se fait par des interactions électrostatiques avec des lipides membranaires. Conclusion. Nous avons mis en lumière de nouveaux mécanismes régulant la protéine Yurt. Ces connaissances pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques en oncologie ciblant les orthologues humains de Yurt. / Introduction. Epithelial polarity is characterized by the asymmetrical distribution of cellular components in epithelial cells, which divides the cell into an apical domain, a lateral domain, and a basal domain. This polarity is essential for proper tissue function and the homeostasis of organs. Indeed, loss of epithelial polarity contributes to cancer progression. Crumbs is a polarity protein that limits tumour progression. In Drosophila, the protein Yurt, which associates to the cell cortex, limits the activity of Crumbs. Moreover, the human orthologs of Yurt – EPB41L5 and EPB41L4B – are overexpressed in many cancers. This overexpression increases metastasis formation and is thus associated with a poor prognosis. These proteins represent potential targets in the treatment of cancer, but little is known about their modes of regulation. We hypothesize that subcellular localization is important for the regulation of Yurt and its human orthologs. The aims of this project are to 1) define which domains of Yurt target it to the cell cortex and 2) determine the mechanisms responsible for this localization. Methodology and results. We performed a structure-function analysis coupled to immunofluorescence to identify the protein domains responsible for the cortical localization of Yurt. Many truncations and deletions were tested and allowed the identification of one basic and hydrophobic motif along with a Pleckstrin Homology-like domain within the FERM domain that are essential for Yurt’s cortical localization. This localization is mediated by electrostatic interactions with membrane lipids. Conclusion. We have successfully identified novel mechanisms regulating Yurt localization. These findings could contribute to the development of new therapeutics in oncology that target the human orthologs of Yurt.

Le régulateur transcriptionnel Cux1 est impliqué dans le processus de migration des cellules cancéreuses. Dans un modèle d’inflammation intestinale de type colite expérimentale, l’absence de Cux1 entraîne une perte de la restitution de l'épithélium intestinal. Ceci nous a amenés à poser l’hypothèse que Cux1 serait fonctionnellement impliqué dans le processus de migration cellulaire lors de la régénération épithéliale en contexte de maladies inflammatoires intestinales. En utilisant des conditions de culture limitant la prolifération, une diminution de la réponse migratoire des cellules épithéliales a été observée en absence de Cux1. Cette diminution de migration a été accompagnée d’une perte du remaniement du cytosquelette d'actine et d’une diminution du nombre de lamellipodes formés au front de migration. En vérifiant l’activité des voies classiques de migration RhoA et Rac1, une modulation des modifications post-traductionnelles sur chacune des protéines terminales de ces voies a été observée. Une augmentation du niveau de phosphorylation inhibitrice sur sérine 3 de la cofiline et une diminution de la phosphorylation activatrice sur la protéine ribosomale S6 ont été observées en absence de Cux1. Toutefois, ces protéines ne sont pas des cibles transcriptionnelles du régulateur Cux1. Une analyse par micropuce a permis d’identifier de nouveaux substrats de Cux1 pertinents au processus de restitution épithéliale. Ainsi, les gènes FgfR2, Shc4 et Vav2 ont été découverts pour être impliqués autant au niveau cellulaire que physiologique en contexte inflammatoire. De plus, Cux1 semble en mesure de cibler directement ces trois promoteurs. Un essai de récupération du phénotype en inhibant la voie RhoA a permis d'observer un rétablissement partiel de la réponse migratoire des cellules n’exprimant pas Cux1, suggérant que Vav2 et la voie Rac1 auraient une importance dans cette restitution épithéliale intestinale. Des modulations de gènes impliqués dans la restitution ont été observées par séquençage des ARNs chez des souris mutantes pour Cux1.

La sécheresse oculaire est une maladie multifactorielle invalidante affectant la qualité de vie des patients. Elle constitue un réel problème de santé publique du fait sa prévalence élevée chez les personnes âgées. Les étiologies et les facteurs de risque nombreux de cette pathologie déclenchent une succession de conséquences créant un cercle vicieux autoentretenu où l’instabilité du film lacrymal et l’hyperosmolarité jouent un rôle central. L’intégrité de la surface oculaire est un élément déterminant qui influence l’impact de l’hyperosmolarité directement au niveau des cellules épithéliales conjonctivales. Le chlorure de benzalkonium (BAK), principal conservateur des collyres, altère l’intégrité du film lacrymal provoquant une sécheresse oculaire chez les patients. Le but de notre travail était au travers de la mise au point d’un modèle de sécheresse oculaire in vitro, de comprendre la part respective et combinée des effets du xénobiotique et de la composante physiopathologique sur le comportement des cellules conjonctivales. L’hyperosmolarité et le BAK entrainent tous les deux, et à des niveaux d’intensité différents, des réponses cytotoxiques avec induction de stress oxydant, de conditions pro-inflammatoires (chimiokine CCL2, expression de HLA DR) et d’apoptose sur les cellules conjonctivales. L’adjonction de BAK à ces conditions potentialise les effets délétères déjà mis en évidence avec l’hyperosmolarité seule. Ce travail montre pour la première fois au niveau de la surface oculaire les effets potentialisateurs d’un toxique en conditions physiopathologiques. Ce modèle hyperosmolaire de sécheresse oculaire représente un nouvel outil pour analyser la toxicité de facteurs de risque environnementaux ou iatrogènes de manière fiable et reproductible. / Dry eye is a multifactorial disease affecting patients’ quality of life and currently constitutes a public health problem because of its high prevalence in elderly people. The etiologies and risk factors of this disease induce a series of consequences creating a self-perpetuating vicious cycle where tear film instability and hyperosmolarity play a central role. The integrity of the ocular surface is a determining factor that influences the impact of hyperosmolarity directly at the level of conjunctival epithelial cells. Benzalkonium chloride (BAK), the mainly used eye drop preservative, alters tear film integrity and may induce or favor dry eye. The purpose of this study was, besides developing an in vitro dry eye model, to describe the respective and combined effects of the xenobiotics and the pathophysiological component on the conjunctival cell behavior. Hyperosmolarity and BAK, although at different intensity levels, both induce cytotoxic responses with oxidative stress, proinflammatory responses (CCL2 chemokine, expression of HLA-DR) and apoptosis in conjunctival cells. The addition of BAK to these hyperosmolar conditions potentiates the deleterious effects already identified with hyperosmolarity alone. This work reports for the first time the potentiating effects of a toxic in pathophysiological conditions. This hyperosmolar dry eye model offers a new reliable and reproducible tool to investigate the environmental and iatrogenic toxicity on ocular cells in vitro.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Par son rôle dans la production du lait, la glande mammaire est un organe qui possède un métabolisme très actif. Grâce à l'accumulation des connaissances aussi bien dans le sein que dans d'autres organes, les voies métaboliques qui permettent la synthèse et la distribution du lait sont aujourd'hui plutôt bien connues. Cependant, les mécanismes qui permettent la coordination de toutes ces voies pour produire, aux bonnes concentrations, les différents constituants du lait sont pour le moment encore peu compris. Le récepteur aux estrogènes α (ERα) est un facteur de transcription connu pour jouer un rôle de régulateur du métabolisme dans plusieurs organes du corps, comme le foie ou le système nerveux central. Dans la glande mammaire, il est surtout considéré pour son rôle sur le développement de l'organe au cours de la vie. **Notre hypothèse était que ce récepteur pouvait, également, jouer un rôle de régulateur du métabolisme dans la glande mammaire, comme c'est le cas dans d'autres organes.** Les cellules épithéliales mammaires sont les cellules qui supportent la plupart des réactions métaboliques pour permettre la production du lait. Elles ont donc été choisies comme modèles d'étude pour répondre à la problématique. La majorité des lignées existantes sont des lignées immortalisées non tumorales éloignées du tissu épithélial d'origine et elles n'expriment pas un ERα fonctionnel. En effet, ces lignées ont pour la plupart perdu l'expression de ce récepteur et ne sont donc pas de bon modèle pour notre question de recherche. Notre **premier objectif** a donc été de concevoir un modèle de culture primaire de cellules épithéliales mammaires et la souris a été choisie comme animal d'étude. Le **premier chapitre** présentera donc la conception et la caractérisation du modèle d'étude ainsi que les expériences de métabolomiques de pointe qui ont été effectuées. Nous avons développé des organoïdes de cellules épithéliales mammaires capables d'exprimer un ERα fonctionnel. Notre **deuxième objectif** pour ce chapitre était de voir si ERα avait un effet sur le métabolisme des cellules épithéliales mammaires. Nous avons ainsi pu mettre de l'avant qu'un traitement à l'estradiol des cellules épithéliales mammaires induisait des changements dans les concentrations de métabolites impliqués dans la glycolyse, le cycle de Krebs et le cycle de l'urée. La glande mammaire est également un organe extrêmement sensible aux hormones, ce qui en fait un modèle très étudié dans le contexte des perturbateurs endocriniens. Ces derniers sont des molécules, principalement produites par l'humain, qui sont capables d'interagir avec les signalisations hormonales dans le corps, dont ERα. Dans le **deuxième chapitre**, nous avons sélectionné plusieurs perturbateurs endocriniens : le BPA, le BPS, le Tritan® et le glyphosate. Après avoir démontré que ERα avait un impact sur la régulation du métabolisme de la glande mammaire, notre **objectif** ici a donc été d'étudier les effets de ces molécules sur le métabolisme des cellules épithéliales aussi bien en deux qu'en trois dimensions. Nous avons mis au point la technique de l'analyse de flux extracellulaires pour le modèle en trois-dimensions. Cela nous a permis de démontrer que ces perturbateurs endocriniens étaient capables de moduler le métabolisme des cellules épithéliales mammaires. Notre étude a également mis de l'avant l'impact de la conformation cellulaire et du statut paritaire sur la réponse métabolique induite par les perturbateurs endocriniens dans ces cellules. Pour finir, dans le **troisième chapitre**, nous avons analysé le transcriptome induit par le traitement à l'estradiol dans nos organoïdes. Notre **objectif** était cette fois de découvrir quelles voies de signalisation étaient impliquées dans la réponse métabolique induite par le traitement à l'estradiol dans les cellules épithéliales mammaires. Nous avons ainsi identifié la voie de signalisation de mTOR et avons entrepris de caractériser les effets de son inhibition dans notre modèle. Nous avons remarqué que l'inhibition de la signalisation de mTOR avait des effets sur la morphologie de nos organoïdes et que ces effets variaient suivant le moment d'administration du traitement. En combinant des analyses de transcriptomique et de protéomique, nous avons identifié le facteur de transcription MYB comme jouant un rôle dans la réponse des organoïdes à l'inhibition de la signalisation de mTOR. Notre étude a ainsi mis de l'avant le fait que l'axe ERα/mTOR/MYB contrôle l'organogenèse de l'épithélium mammaire. En conclusion, l'ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre l'impact qu'a ERα sur le métabolisme de cette glande dans un contexte physiologique, mais également de comprendre l'impact des perturbateurs endocriniens sur ses fonctions. / Because of its role in milk production, the mammary gland is an organ with a very active metabolism. Thanks to the accumulation of knowledge in the breast and other organs, the metabolic pathways enabling milk synthesis and distribution are now well known. However, the mechanisms that will allow all these pathways to be coordinated to produce the various milk constituents at the right concentrations are still poorly understood. The estrogen receptor α (ERα) is a transcription factor known to regulate metabolism in several organs of the body, including the liver and the central nervous system. In the mammary gland, it is best acknowledged for its role in organ development during life. **Our hypothesis was, therefore, that this receptor could also play a role in regulating metabolism in the mammary gland, as it does in other organs.** Mammary epithelial cells are the cells that support most of the metabolic reactions required for milk production. They were therefore chosen as the study model to answer our hypothesis. However, to our knowledge, there are no immortalized non-tumoral cell lines expressing a functional ERα. Indeed, due to numerous passages, these cell lines have lost the expression of this receptor and are not a good model for our research question. Our **first objective** was, therefore, to design a primary mammary epithelial cell culture model, and the mouse was chosen as the study animal. The **first chapter** will present the design and characterization of the study model, as well as the state-of-the-art metabolomics experiments that were done. We developed mammary epithelial cell organoids capable of expressing a functional ERα. Our **second objective** for this chapter was to see whether ERα affected mammary epithelial cell metabolism. Thus, we were able to demonstrate that estradiol treatment of mammary epithelial cells induced changes in the concentrations of metabolites involved in glycolysis, the Krebs cycle and the urea cycle. The mammary gland is also an organ that is extremely sensitive to hormones, making it a highly studied model in the context of endocrine-disrupting chemicals. These are molecules, mainly produced by humans, which can interact with hormonal signalling in the body. In the **second chapter**, we selected several endocrine-disrupting chemicals: BPA, BPS, Tritan® and glyphosate. Having demonstrated that ERα has an impact on the regulation of mammary gland metabolism, **our aim** here was to study the effects of these molecules on epithelial cell metabolism in both two and three dimensions. We developed the technique of extracellular flow analysis for three-dimensional models, enabling us to demonstrate that these molecules were capable of modulating mammary epithelial cell metabolism. Our study also highlighted the impact of cell conformation and parity status on the metabolic response to endocrine-disrupting chemicals in these cells. Finally, in the **third chapter,** we analyzed the transcriptome induced by estradiol treatment in our organoids. **Our aim** this time was to discover which signalling pathways were involved in the metabolic response induced by estradiol treatment in mammary epithelial cells. We identified the mTOR signalling pathway and characterized the effects of its inhibition in our model. We found that inhibition of mTOR signaling had effects on the morphology of our organoids and that these effects varied according to the time of treatment. Combining transcriptomic and proteomic analyses, we identified the MYB transcription factor as playing a role in organoid response to inhibition of mTOR signaling. Our study thus put forward that the ERα/mTOR/MYB axis controls mammary epithelial organogenesis. In conclusion, all this work provides a better understanding of the impact of ERα on the metabolism of this gland in a physiological context, but also of the impact of endocrine disruptors on its functions.