Le facteur de croissance neurotrophique NGF (Nerve Growth Factor) est un facteur mitogène et de survie pour les cellules de cancer du sein alors qu’il est sans effet sur la croissance des cellules épithéliales mammaires normales. Ce facteur de croissance agit sur ses cellules cibles par l’intermédiaire de deux récepteurs : TrkA, qui est un récepteur tyrosine kinase, et p75NTR, dépourvu d’activité catalytique intrinsèque. Le NGF stimule la survie des cellules cancéreuses mammaires via p75NTR en activant le facteur de transcription NF-ĸB. Au cours de mes travaux de thèse, je me suis tout d’abord appliqué à décrire les modifications du protéome induites par une surexpression de ce récepteur p75NTR. Pour cela, nous avons établi une lignée cellulaire MCF-7 surexprimant stablement le récepteur p75NTR. Par la suite, une étude par électrophorèse bidimensionnelle suivie par une analyse par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF/TOF a été réalisée en comparant des cellules non stressées à des cellules induites en apoptose grâce à l’apoptogène TRAIL (TNF-related-apoptosis-inducing-ligand). Au cours de cette étude, nous avons pu mettre en évidence un certain nombre de protéines régulées par la présence de p75NTR en condition d’apoptose comme les cytokératines 8, 18 et 19, la protéine chaperonne HSP27 ou bien encore la protéine ribosomale RPLP0. Ces résultats suggèrent l’importance d’une réorganisation de ces protéines afin que p75NTR puisse effectuer son effet de survie. L’autre partie de mes travaux a consisté en une étude spécifique des partenaires de signalisation de p75NTR. Pour ce faire, nous avons décidé d’appliquer la stratégie TAP-Tag (Tandem Affinity Purification-Tag), une approche de protéomique fonctionnelle, au récepteur membranaire p75NTR. Une analyse différentielle de plusieurs conditions de culture par spectrométrie de masse de type nanoLC-MS/MS a abouti à l’obtention d’une liste de partenaires potentiels de signalisation de p75NTR dans un contexte de survie cellulaire. Cependant, l’implication fonctionnelle de ces protéines doit être confirmée. L’ensemble de ces travaux a permis d’ouvrir de nouvelles pistes de recherche pour comprendre à la fois les mécanismes cellulaires mis en œuvre lors de la survie des cellules cancéreuses mammaires, mais aussi les partenaires potentiels de signalisation du récepteur p75NTR. / The growth factor NGF (nerve growth factor) is a mitogenic and survival factor for breast cancer cells but has no effect on normal epithelial mammary cell growth. This growth factor acts on breast cancer cells via two receptors : TrkA, a tyrosine kinase receptor, and p75NTR, which has no catalytic activity. NGF promotes breast cancer cells survival via p75NTR by activation of the transcriptional factor NF-κB. In the first time of my thesis work, I have described the proteome modification induced by an overexpression of p75NTR in apoptotic stress-induced breast cancer cells. We established a p75NTR overexpressing MCF-7 cell line. Thus, we investigated, by two dimensional electrophoresis followed by MALDI-TOF/TOF based mass spectrometry analysis, the proteome modification induced by the pro-apoptotic agent TRAIL (TNF-related-apoptosis-inducing-ligand). We describe some proteins regulated by p75NTR in an apoptosis condition like cytokeratin 8, 18 and 19, the HSP27 and the ribosomal protein RPLP0. These results show that the rearrangement of those proteins is associated to the survival effect of p75NTR in breast cancer cells. In a second part, we tried to identify the specific proteins partners of p75NTR for its survival pathway. For that, we applied the TAP-tag (tandem affinity purification tag) strategy, a functional proteomic approach, to the p75NTR receptor. A differential analysis by nanoLC-MS/MS mass spectrometry was conducted and we obtained a list of potentials proteins partners of the p75NTR activated survival pathway. The functional involvement of these proteins should be confirmed. Together, our work provides new data on the cellular mechanisms involved in the survival of breast cancer cells and also on the proteins partners implicated in p75NTR signaling.

Les granules de stress (GS) sont des sites de régulation de la traduction qui permettent aux cellules cancéreuses de survivre au stress. Elles apparaissent sous différentes conditions de stress et disparaissent une fois remises de celles-ci. Elles se forment selon deux voies, l’une dépendante de la phosphorylation du facteur eIF2α et l’autre indépendante. Les mécanismes d’assemblage des GS par cette dernière voie restent méconnus. Afin de définir ces mécanismes, l’objectif principal de ma maîtrise était de caractériser les étapes critiques de la formation de GS. En utilisant des approches pharmacologiques et d’interférence à l’ARN, nous démontrons que l’inactivation de plusieurs facteurs d’initiation de la traduction provoque la formation de GS indépendamment de la phosphorylation d’eIF2α. Par contre, l’inactivation du facteur eIF4E, ainsi que ceux permettant l’association du 60S à l’ARNm, n’induit pas de GS. De nouvelles stratégies anti-cancer inhibant la traduction et bloquant la formation de GS serait alors possible.

Le réflexe naturel d’une cellule eucaryote, soumise à un stress (ex : radiations, drogues anti-cancers…), est d’activer des mécanismes de défense afin de s’adapter aux conditions extrêmes imposées, leur permettant de survivre. Un des mécanismes activé en condition de stress est l’inhibition de l’initiation de la traduction menant à la formation de granules de stress (GS). Les GS sont des corps cytoplasmiques dynamiques renfermant des facteurs d’initiation de la traduction, des ARNms, des protéines de liaison à l’ARN ainsi que des molécules de signalisation impliquées dans les voies de mort cellulaire. La formation des GS fut identifiée comme un évènement clé inactivant les voies de mort cellulaire, constituant donc un mécanisme majeur de survie, qui dans le cas du cancer peut engendrer une chimiorésistance. Nous avons précédemment conduit un criblage des facteurs d’initiations de la traduction impliqués dans la formation des GS. Ces travaux (Mazroui et al, 2006 ; Mokas et al, 2009) ont permis d’identifier plusieurs facteurs dont l’inactivation induit la formation des GS. Par contre, l’inactivation du facteur eIF4E, qui est responsable de la reconnaissance des ARNms lors de l’initiation de la traduction, n’induit pas la formation des GS. Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence un nouveau rôle du facteur d’initiation de la traduction eIF4E ainsi que son partenaire eIF4GI dans la formation des GS induites par le traitement chimiothérapeutique Bortezomib. Ce rôle est stimulé par la voie oncogénique mTORC1, qui est la voie de signalisation responsable de l’interaction eIF4E-eIF4GI. De plus, notre étude a démontré que l’inhibition spécifique d’eIF4E, d’eIF4GI ou l’inactivation de mTORC1 empêche l’activation des voies anti-apoptotiques associées au GS, sensibilisant ainsi les cellules cancéreuses aux traitements chimiothérapeutiques. Néanmoins, la formation des GS n’est pas restreinte au Bortezomib. En effet, notre criblage des drogues chimiothérapeutiques a identifié le Sorafenib (Nevaxar®) et le Lapatinib (Tykerb/Tyverb®) comme deux puissants inducteurs des GS au sein des cellules cancéreuses. En conclusion, ces travaux ont mis en lumière un nouveau mécanisme de formation des GS ainsi que deux potentiels inducteurs d’assemblage de ces granules. / The natural reflex of a eukaryotic cell under stress (e.g.: radiation, anti-cancer drugs, thermal or oxidative stress) is to activate defense mechanisms to adapt to extreme conditions imposed, allowing them to survive. One mechanism activated under stress conditions is the inhibition of translation initiation leading to the formation of stress granules (SG). SG are dynamic cytoplasmic body containing translation initiation factors, mRNAs, RNA binding proteins and signaling molecules involved in cell death pathways. SG formation was identified as a key event inactivating cell death pathways, thus establishing a major survival mechanism, which in the case of cancer can lead to drug resistance. We previously conducted a screening of the translation initiation factors involved in the SG formation. These works (Mazroui et al, 2006; Mochas et al, 2009) have identified several factors that inactivation induces the formation of GS. For cons, the inactivation of factor eIF4E, which is responsible for the recognition of mRNAs during translation initiation, does not induce the formation of SG. My thesis has highlighted a new role for the translation initiation factors eIF4E and its partner eIF4GI in the SG formation induced by chemotherapeutic drug Bortezomib. This role is stimulated by oncogenic mTORC1 pathway, which is the key regulator of the eIF4E-eIF4GI interaction. In addition, our study demonstrated that specific inhibition of eIF4E, eIF4GI or the inactivation of mTORC1 prevents anti-apoptotic pathways associated with SG and sensitizing cancer cells to chemotherapeutic treatments. The SG formation is not restricted to Bortezomib. Indeed, our screening of chemotherapeutic drugs has identified Sorafenib (Nevaxar ®) and Lapatinib (Tykerb / Tyverb ®) as two potent inducers of SG in cancer cells. Our results indicate that the mechanism of action of these two drugs appears to be similar to Bortezomib and they induce the formation of SG by inhibiting translation initiation. In addition, the formation of SG induced by Sorafenib or Lapatinib also seems to depend on the eIF4E-eIF4GI complex formation. Therefore, my work provides a general role of eIF4E-eIF4GI interaction in the assembly of SG and the cancer cells resistance to chemotherapy.

Avec une incidence de 23 300 nouveaux cas en 2020 (ce qui représente 20% de tous les nouveaux cas de cancer chez l'homme) et de 4200 décès (10% de tous les décès par cancer chez l'homme), le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez l'homme au Canada. Il s'agit d'un cancer hormono-dépendant, traité depuis plus de 70 ans par thérapie anti-androgénique. Le succès des nouvelles immunothérapies basées sur la réactivation des lymphocytes T dans certaines pathologies cancéreuses (vessie, poumon, peau, etc.) et leur échec retentissant dans d'autres (incluant le cancer de la prostate) poussent la communauté scientifique à explorer l'impact de la composante innée du système immunitaire dans la réponse aux immunothérapies. Les tumeurs évoluent en tant qu'écosystèmes complexes, constitués entre autres de cellules tumorales, stromales et de cellules immunitaires. Longtemps considéré comme une tumeur « froide »,caractérisée par une faible infiltration immunitaire et comme cancer peu immunogènique, une population de cellules d'origine myéloïdes, les macrophages, sont depuis quelques années reconnus pour leur rôle majeur dans cet écosystème. Dans un premier temps ils seraient impliqués dans une séquence inflammatoire qui favoriserait le développement de la tumeur, puis, une fois la tumeur installée, les macrophages associés aux tumeurs (Tumor-associated macrophages – TAM) grâce à leur très grande plasticité, favoriseraient un environnement immunosuppresseur, l'angiogenèse, l'invasion de cellules tumorales et la formation de niche pré-métastatiques tout en supprimant la réponse des lymphocytes T cytotoxiques. On parle alors de rééducation du système immunitaire par la tumeur. De plus, de solides évidences ont montré l'implication des macrophages dans la résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie dans le cancer de la prostate Basé sur ces observations, nous avons, dans un premier temps, étudié la rééducation de macrophages, au départ à vocation anti-tumorale, en TAM dans le microenvironnement du cancer de la prostate. Nous avons ainsi pu montrer par que les TAM qui apportent le plus d'information sur la progression de la maladie semblent localisés en dehors de la tumeur, dans le tissu adjacent d'apparence normale. Nous avons ainsi pu mettre en place un nouveau système de culture ex vivo de biopsies de patients et trouvé que des TAM avec un phénotypemixte M1 (CCR7+) /M2 (CD163+) étaient présents en grande quantité dans les cancers de prostate agressifs. Nous avons finalement recréé artificiellement dans un modèle de co-culture une façon innovante d'obtenir des macrophages avec le même phénotype et observé qu'indépendamment de leur phénotype de polarisation de base (M1 ou M2), les cellules de cancer de la prostate changeaient ces macrophages pour leur donner une fonction identique tout en les empêchant d'être rééduqués en macrophage M1. Le séquençage des différents macrophages subvertis nous a permis de déterminer que la ré-éducation des macrophages M2 vers un M1 en présence de cellules cancéreuses était accompagnée d'un changement dans le réseau de chimiokines transcrites vers un profil de chimiokines qui favorisent le recrutement de neutrophiles et le remodelage tissulaire et osseux. ans un second temps, nous avons utilisé les informations sur la localisation spatiale des TAM pour inclure plus de tissu adjacent d'apparence normale dans notre système de culture ex vivo. Nous avons alors évalué l'impact d'un traitement actuellement utilisé en clinique, l'enzalutamide, sur la composante immune du microenvironnement tumoral, plus précisément sur les macrophages. Nous avons pu déterminer que l'observation seule de marqueurs à la surface des macrophages via une dichotomie positive/négative ne permettait pas de visualiser de changements. À l'inverse, l'utilisation de sous-populations basées sur la forte/faible expression de marqueurs (CD163, CCR7, CD206) nous permettait d'observer un changement dans la composition du type de macrophages associé à une augmentation de points de contrôle immunologique à leur surface (PD-L1, PD-L2 et B7-H3). Une forte proportion de macrophages PD-L1+ était associée à un plus faible volume tumoral et un ratio neutrophiles/lymphocytes plus élevé tandis qu'une forte proportion de macrophages B7-H3+ était associée avec la présence de carcinome intracanalaire de la prostate, une forme agressive du cancer de la prostate. Ce projet nous a aussi permis de mettre en exergue l'importance de l'utilisation de la cytométrie de flux multiparamétrique comme technique de phénotypage de ces macrophages dans des échantillons biologiques mais surtout l'utilité de cibler à l'aide du multimarquage des sous-populations définies par l'expression de biomarqueurs spécifiques afin de mieux caractériser cette composante importante du microenvironement tumoral prostatique. Enfin, ce travail permet de mieux comprendre la plasticité des macrophages dans un contexte de cancer de prostate agressif ainsi que l'ontogénie des macrophages pro-tumoraux recrutés ou subvertis. Il permet d'amener une approche nouvelle sur l'obtention de macrophages pro-tumoraux et leur utilisation comme modèle pour mimer in vitro les TAM. / With an incidence of 23,300 new cases in 2020 (representing 20% of all new cancer cases in humans) and of4,200 deaths (10% of all cancer deaths in humans), prostate cancer is the non-cutaneous cancer most frequently diagnosed in men in Canada. It is a hormone-dependent cancer, treated for over 70 years with anti-androgen therapy. The success of new immunotherapies based on the reactivation of T lymphocytes in certain cancers(bladder, lung, skin, etc.) and their failure of checkpoint immunotherapy in prostate cancers and others have prompted further exploration of the impact of the innate component of the immune system in the response to immunotherapies. Tumors evolve as a complex ecosystem, mainly made up of tumor cells, stromal cells, andimmune cells. Long considered as a "cold" tumor characterized by low immune cell infiltration and poorlyimmunogenic, the role of innate immune cells such as macrophages within the prostate tumor ecosystem remainto be fully defined. Initially, macrophages may be involved in an inflammatory sequence which promotes tumor development. Later, tumor-associated macrophages (TAMs) due to their very high plasticity, may play a role inpromoting an immunosuppressive environment, angiogenesis, tumor cell invasion and pre-metastatic niche formation while suppressing the response of cytotoxic T cells. These activities mediated by TAMS which are effectively re-educated o by the tumor. This is consistent with the association of macrophages and resistance to chemotherapy and radiotherapy in prostate cancer. Based on these observations, first, we studied the re-education of macrophages, particularly thoses which first present with an anti-tumor phenotype within the prostate cancer microenvironment. We show that the TAMs,which coincide most strongly with clinical outcomes are in fact located peripherally to the tumor in the adjacent normal tissue. We developed a novel system for ex vivo culture of patient biopsies and observed in aggressive prostate cancers that TAMs with a mixed M1 (CCR7+) / M2 (CD163+) phenotype were present in larger quantities. We modeled in a co-culture system an innovative way to obtain TAMs with this same phenotype and observed that regardless of their starting polarization phenotype (M1 or M2), prostate cancer cells changed these macrophages to give them an identical function while preventing them from being re-educated as M1macrophage. The sequencing of the different subverted macrophages allowed us to determine that the reeducation of M2 macrophages to M1 in the presence of cancer cells was accompanied by a change in the chemokine network transcribed towards a profile of chemokines that promote the recruitment of neutrophils and tissue and bone remodeling. Second, we used the information on the spatial location of the TAMs to include more adjacent, apparently normaltissue in our ex vivo culture system. We then evaluated the impact of a treatment currently used in the clinic,enzalutamide, on the immune composition of the tumor microenvironment, more specifically on TAMs We were able to determine that the observation of markers on the surface of macrophages alone via a dichotomous classification did not permit identification of any induced changes. However, with macrophage subpopulations based on the high/low expression of markers (CD163, CCR7, CD206), we observed a change in the compositionof the type of macrophages associated with an increase in immune checkpoints on their surface (PD-L1, PD-L2and B7-H3). A high proportion of PD-L1+ macrophages was associated with a lower tumor volume and a highneutrophil to lymphocyte ratio with a high proportion of B7-H3+ macrophages was associated with the presenceof intracanal carcinoma of the prostate, an aggressive form of prostate cancer. This project allowed us to highlight the importance of the use of multiparametric flow cytometry as a technique of phenotyping on these macrophages in biological samples but above all the usefulness of targeting, using multiple markers, subpopulations defined by expression of specific biomarkers in order to better characterizethis important component of the tumor microenvironment. Finally, this work allows us to better understand the plasticity of macrophages in a context of aggressive PCa as well as the ontogeny of recruited or subverted protumoral macrophages. It provides a new approach to obtain human pro-tumoral macrophages and an in vitromodel which mimics TAMs.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus commun chez les hommes de plus de 50 ans, représentant20% de l’incidence de tous les cancers en 2021. Après l’approche initiale par chirurgie, environ 30% des patients ont une récurrence et suivent une thérapie de déprivation androgénique, qui mène éventuellement à l'atteinte d'un état de résistance à la castration pour lequel aucun traitement curatif n’existe. De récentes études ont montré un intérêt pour l’activation de la AMP-activated kinase (AMPK) comme traitement pour les CaP résistants à la castration. Cette stratégie repose sur la capacité de la AMPK à inactiver la mechanistic target of rapamycin (mTOR), une protéine impliquée dans une voie de signalisation associée à la prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement au dogme établi, nos résultats indiquent que la AMPK n’inhibe pas mTOR dans différents modèles cellulaires de CaP, suggérant que ses fonctions y seraient différentes. En effet, l'activation de la AMPK par le A-769662 a démontré que son activité est nécessaire pour le maintien des fonctions mitochondriales en réponse aux androgènes. Pour étudier plus en profondeur les fonctions de la AMPK, nous avons développé un modèle n’exprimant pas les sous-unités catalytiques de la AMPK, à partir de cellules de CaP 22Rv1. Ce modèle a confirmé que l’activité de la AMPK est essentielle pour maintenir la production d’ATP maximale via la respiration mitochondriale dans les cellules de CaP. En fait, des essais de flux extracellulaire sont montré que le knockout de l’activité de la AMPK nuit à la respiration mitochondriale, à l’intégrité des mitochondries, à la flexibilité métabolique ainsi qu’à la prolifération cellulaire. Ces découvertes mettent de l'avant des fonctions oncogéniques associées à la AMPK et indiquent que l’inhibition des fonctions de la AMPK serait requise, plutôt que son activation, pour le traitement du CaP.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les cellules tumorales malignes accumulent des altérations génétiques qui favorisent une plasticité nucléaire accrue et l'invasion tumorale. La réorganisation des réseaux d'actomyosine cause une augmentation des forces mécaniques qui sont transmises à l'enveloppe nucléaire par des connexions physiques. Ces connexions physiques permettent aux cellules d'ajuster la réponse nucléaire aux stress du microenvironnement tumoral, incluant les carences d'espace et de nutriments, et d'induire une réponse cellulaire adaptative pour échapper à ces contraintes. En outre, ces forces mécaniques causent souvent des ruptures de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorales. Ces ruptures nucléaires pourraient favoriser les déformations nucléaires requises durant la migration cellulaire à travers les espaces serrés de la matrice extracellulaire. Remarquablement, les cellules tumorales survivent à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire grâce à des mécanismes de réparation efficaces. Cependant, les ruptures nucléaires répétées causent une accumulation de dommages à l'ADN et pourraient contribuer à l'acquisition d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, élucider les mécanismes moléculaires régulant les processus de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire pourrait identifier des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrecarrer l'invasion tumorale. La protéine adénovirale E4orf4 induit une activité toxique sélective chez les cellules tumorales. Cependant, les bases moléculaires de l'action sélective d'E4orf4 demeurent méconnues. Il a été démontré qu'E4orf4 réorganise le réseau d'actomyosine à proximité du noyau et provoque des déformations nucléaires dramatiques. Nous avons émis l'hypothèse que la protéine adénovirale E4orf4 exerce une activité toxique sélective dans les cellules tumorigéniques en perturbant la forme et la dynamique nucléaire, notamment via sa capacité à déréguler l'organisation du cytosquelette d'actine. L'objectif général de ces travaux de thèse est d'étudier la contribution des changements de forme et de dynamique nucléaire dans l'activité toxique d'E4orf4 et les mécanismes impliqués. La prémisse est que les cibles cellulaires d'E4orf4 réguleraient le remodelage de l'enveloppe nucléaire par les forces mécaniques et la plasticité nucléaire. Afin d'adresser cette hypothèse, les effets d'E4orf4 sur le réseau périnucléaire d'actine et sur l'organisation de l'enveloppe nucléaire, de même que les effecteurs cellulaires impliqués, ont été étudiés dans une variété de lignées cellulaires tumorigéniques et non-tumorigéniques. Les travaux présentés au Chapitre 1 indiquent qu'E4orf4 perturbe l'organisation de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorigéniques seulement, d'une manière qui dépend du recrutement de fibres contractiles à l'enveloppe nucléaire. Ce processus requiert son association avec la protéine de polarité Par3 et la transmission des forces mécaniques à l'enveloppe nucléaire par le complexe LINC. Remarquablement, cette activité toxique sélective d'E4orf4 est associée à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire provoquant une perte de l'intégrité nucléaire chez une proportion significative de cellules. De plus, les travaux présentés au Chapitre 2 identifient le régulateur épigénétique Ash2L comme substrat de la tyrosine kinase oncogénique Src dont la signalisation est perturbée par E4orf4 qui modifie la réponse nucléaire au stress mécanique. Des analyses moléculaires, biochimiques et fonctionnelles ont révélé que la phosphorylation d'Ash2L par Src est dérégulée par E4orf4 et qu'elle augmente la résistance du noyau aux ruptures de l'enveloppe nucléaire induites soit par E4orf4 ou par un affaiblissement de la lamina nucléaire. De plus, Ash2L régule également les ruptures nucléaires causées par les contraintes physiques appliquées lors de la migration cellulaire sous confinement. Ensemble, ces travaux ont permis d'identifier deux nouvelles cibles cellulaires d'E4orf4, Par3 et Ash2L, qui régulent son action toxique sélective, laquelle est caractérisée par l'induction de ruptures nucléaires répétées. En outre, nos travaux suggèrent que les cibles d'E4orf4 sont des régulateurs authentiques des ruptures nucléaires par le stress mécanique. Ces travaux établissent E4orf4 comme un nouveau paradigme pour étudier les mécanismes qui contrôlent les évènements de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire et la plasticité nucléaire qui ont un effet sur les propriétés métastatiques des cellules tumorales. / Malignant tumor cells accumulate genetic alterations that increase nuclear plasticity and tumor invasion. Reorganization of actomyosin networks increases cellular contractility and mechanical forces that are transmit to the nuclear envelope through physical connections. These physical connections enable the cells to adjust their nuclear response to microenvironmental stress, including space and nutrient deficiencies, and to induce an adaptive cellular response to escape these stresses. In addition, these mechanical forces often cause ruptures of the nuclear envelope in tumor cells. Notably, nuclear ruptures are thought to facilitate the nuclear deformations required during cell migration through the tight spaces of the extracellular matrix. Remarkably, tumor cells can survive repeated nuclear ruptures using efficient nuclear envelope repair mechanisms. However, repeated nuclear ruptures cause DNA damage accumulation and could contribute to a more invasive tumor cell phenotype. Thus, understanding the biology of nuclear envelope rupture and repair processes is therapeutically relevant. The adenoviral protein E4orf4 exerts tumor cell selective killing. However, the molecular basis for the selective action of E4orf4 remains poorly understood. E4orf4 has been shown to reorganize the actomyosin network near the nucleus and to cause dramatic nuclear deformations. We hypothesized that E4orf4 exerts a selective toxicity by disrupting the nucleus' shape and dynamics, notably through its capacity to deregulate the actin cytoskeleton organization. The general objective of this thesis work is to study the contribution of the modifications of the nucleus' shape and dynamics in the cytotoxic activity of E4orf4, and identify the mechanisms involved. The premise is that the cellular targets of E4orf4 would regulate the remodeling of the nuclear envelope by mechanical forces and nuclear plasticity. In order to address this hypothesis, we analyzed the effects of E4orf4 on the perinuclear actin network and on the organization of the nuclear envelope in a variety of tumorigenic and non-tumorigenic cell lines and identified the cellular effectors involved. The work presented in Chapter 1 indicates that E4orf4 disrupts the organization of the nuclear envelope in tumorigenic cells only, in a manner that depends on the recruitment of contractile actin fibers at the nuclear envelope surface. This process requires its association with the polarity protein Par3 and the transmission of mechanical forces to the nuclear envelope by the LINC complex. Remarkably, this selective toxic activity of E4orf4 is associated with repetitive ruptures of the nuclear envelope causing a loss of nuclear integrity in a significant proportion of the cells. In addition, the work presented in Chapter 2 identifies the epigenetic regulator Ash2L as a novel substrate of the oncogenic tyrosine kinase Src, that is targeted by E4orf4 and that modifies the nuclear response to mechanical stress. Molecular, biochemical and functional analyzes revealed that Src-mediated Ash2L Tyr phosphorylation is deregulated by E4orf4 and increases the nuclear mechanical resistance to the mechanical stress induced by E4orf4 or lamin A/C deficiency. In addition, Ash2L also regulates nuclear ruptures caused by physical constraints during confined cell migration. Together, this work has identified two novel cellular targets of E4orf4, Par3 and Ash2L, regulating its tumor cell-selective action that is characterized by the induction of repetitive nuclear ruptures. Importantly, these studies suggest that E4orf4's targets are bona fide regulators of nuclear ruptures induced by mechanical stress in tumorigenic cells. This thesis work establishes E4orf4 as a new paradigm for studying the mechanisms controlling nuclear envelope rupture and repair events and nuclear plasticity, which are relevant for the metastatic properties of tumor cells.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer dont l’incidence augmente le plus vite parmi les hommes. Selon la Société Canadienne du Cancer, en 2015, 24 000 nouveaux cas de cancer de la prostate seront diagnostiqués et 4 100 patients en décèderont. Bien que des techniques cliniques pour la détection, le diagnostique et le traitement du CaP soient disponibles et importantes dans le traitement actuel de la maladie, elles sont cependant limitées. L’exploitation de plusieurs promoteurs dont l’activité est altérée au cours du développement du cancer est un moyen pour surmonter ces limitations. L’ARN non codant PCA3 est un biomarqueur unique du CaP qui a été largement étudié et dont l’expression est 60 fois plus forte dans les cellules de CaP que dans les cellules bégnines de prostate. Le gène de l’APS (PSEBC) est un marqueur important en clinique, il reflète la réponse au traitement par privation androgénique. Ces études ont pour objectif de développer des systèmes d’amplification transcriptionnel avec les promoteurs PCA3 et PSEBC pour non seulement cibler mais aussi caractériser les cellules cancéreuses de prostate lors de la progression de la maladie. Nous avons générés plusieurs systèmes dans des adénovirus contenant différentes constructions avec le promoteur proximal PCA3 de 152 pb, le système d’amplification TSTA et le gène rapporteur de la luciférase. Nous avons testé leur spécificité pour les cellules du CaP par infection transitoire. Nous avons amélioré le système TSTA et généré le PCA3-3STA. Nous avons ensuite intégré le promoteur PCA3 avec le promoteur PSA pour générer un autre nouveau système d’amplification transcriptionnelle qui se nomme le système «Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA)». Ces systèmes ont ensuite été exploités avec un microscope à bioluminescence pour cibler des cellules de CaP provenant de biopsies liquides de patients. Dans le chapitre deux, nous avons montré que l’activité de PCA3-3STA était hautement spécifique pour les cellules de CaP. Son activité était de 98,7 à 108 fois plus fortes dans les cellules de CaP que dans les cellules primaires bégnines de prostate ou dans les cellules cancéreuses nonprostatiques. Dans des modèles murins de xénogreffes de lignées cellulaires de CaP, nous avons montré que PCA3-3STA pouvait imager de manière très sensible l’activité du promoteur PCA3. De plus, sur des modèles de cultures primaires de biopsies, nous avons montré que le système PCA3-3STA ciblait spécifiquement les cellules épithéliales de CaP sans affecter les cellules stromales. Dans le chapitre trois, nous avons ensuite développé une technique en combinat la microscopie à bioluminescence avec le système TSTA et le promoteur PSA pour cibler les cellules de CaP purifiées de sang de patients et évaluer, cellule par cellule, l’hétérogénéité de leur réponse aux anti-androgènes. Cette technique a aussi montré que la microscopie à bioluminescence est hautement quantitative et a la capacité de détecter les changements moléculaires à l’échelle de la cellule. Le quatrième chapitre présente le système MP-ITSTA. Le système intègre l’activation combinée de deux promoteurs qui contrôlent l’expression d’un seul gène rapporteur. La combinaison du promoteur PCA3 avec celui de l’APS permet d’évaluer, cellule par cellule, la réponse aux anti-androgènes de cellules de CaP prélevés à partir d’urine de patients. C’est pourquoi, les systèmes PCA3-3STA et MP-ITSTA sont des systèmes d’expression spécifiques au cancer de la prostate avec le potentiel de cibler et détecter avec précision les cellules épithéliales de CaP ainsi que leur réponse aux traitements thérapeutiques in vivo et ex vivo. Ces systèmes peuvent jouer un rôle important pour l’imagerie moléculaire, l’immunothérapie et la thérapie génique. / Development Of Transcriptional Amplification Systems To Target and Interrogate Cancer Cells Based On Gene Expression Altered During Cancer Development and Treatment Prostate cancer (PCa) is the fastest rising cancer among the males. According to the Canadian Cancer Society in 2015 it was estimated that 24 000 new cases will be diagnosed with prostate cancer and 4100 patients will die from the disease. Although already available clinical techniques for the detection, prognosis and treatment of PCa play an important role in decision making, they are limited in terms of the ability of detecting PCa cells, prognosis and increasing over all survival of patients. Exploitation of several gene promoters altered during cancer development act as important tool to overcome these limitations. PCA3 noncoding long RNA is a unique PCa biomarker that has been widely studied for its sixty-fold overexpression in PCa cells, compared to benign prostate cells. PSA (PSEBC) gene is of high clinical significance as it can give an account of response to androgen deprivation treatments. These studies aim to develop Transcriptional Amplification Systems that can target as well as characterise cancer cells during disease progression using PCA3 and PSA gene promoters. Various adenovirus constructs incorporating the proximal 152 bp PCA3 promoter, the TSTA system and the Firefly luciferase reporter gene were generated and the specificity of the promoter was tested in PCa cells by transient infection. We have improved the TSTA system and generated the (PCA3-3STA). We further integrated the PCA3 promoter along with the PSA promoter to generate a new transcriptional amplification system that we named the Multiple Promoter Integrated Transcriptional Amplification (MP-ITSTA) system. These systems were further applied to target PCa cells from body fluids of patients using bioluminescence microscopy. In chapter two we show that PCA3-3STA activity was highly specific for PCa cells, ranging between 98.7 and 108.0-fold higher, respectively, than that for benign prostate or non-PCa cells. In PCa cell line mouse xenografts, PCA3-3STA was shown to image PCA3 promoter activity with high sensitivity. Moreover, when primary PCa biopsies were infected with PCA3-3STA, it managed to image PCa epithelial cells but not stromal cells. In chapter three we further developed a bioluminescence microscopy technique using the TSTA system with PSA promoter to target PCa cells from blood of patients and assess heterogeneous single cell response to antiandrogens. This technique also shows that bioluminescence microscopy is highly quantitative and has the ability to detect molecular changes at the cellular level. The fourth chapter presents the MP-ITSTA system. This system integrates the combined activation of two promoters giving a single reporter gene expression. PCA3 when combined with the PSA promoter could assess single cell response to antiandrogens in cells isolated from urine of patients. Hence, PCA3-3STA and MP-ITSTA utilizing the bioluminescence microscopy represent a prostate- and PCa-specific expression systems with the potential to target, with high accuracy, PCa epithelial cells, assess their response to therapy in vivo and ex vivo. This can play an important role for imaging, immunotherapy, or gene therapy.

La protéine E4orf4 de l’adénovirus humain est membre d’une famille de facteurs tumoricides, qui induisent la mort cellulaire des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales. Il a été montré que dans les cellules transformées, E4orf4 induit un programme de mort cellulaire non apoptotique dépendante des kinases Src et d’une dérégulation de la dynamique d’actomyosine. Cette activité toxique d’E4orf4 est déterminée notamment par sa localisation intracellulaire : E4orf4 est initialement nucléaire, puis elle s’accumule graduellement dans le cytoplasme où elle initie un remodelage atypique du cytosquelette d’actine associé à la mort cellulaire. L’inhibition de l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4 empêche également le remodelage de l’actine, et vice versa. Il existe donc un lien fonctionnel entre la dynamique subcellulaire d’E4orf4, le remodelage du réseau d’actine, et l’activité toxique d’E4orf4 ; toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués demeurent peu compris. Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour but d’identifier les effecteurs cellulaires contrôlant la localisation d’E4orf4 et d’étudier leur implication dans son activité tumoricide. Des analyses protéomiques ont identifié la protéine de polarité Par3 (PARD3) comme un partenaire d’E4orf4 requis pour l’induction de son activité toxique dépendante de l’actine. Les résultats suggèrent que Par3 et ses partenaires formant le complexe de polarité Par sont impliqués dans le remodelage d’un réseau périnucléaire d’actomyosine dans les cellules tumorales. Ce phénomène stimule la formation et la rupture de blebs de noyau, menant à des bris transitoires de l’enveloppe nucléaire et permettant l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4. D’autre part, nous avons mis en évidence qu’E4orf4 stimule le recrutement du cochaperon BAG3 et de la machinerie autophagique aux sites de formation des blebs nucléaires. Les résultats suggèrent qu’une voie autophagique dépendante de BAG3 est induite en réponse à E4orf4 afin de faire face au stress mécanique, laquelle pourrait contribuer à maintenir l’intégrité et/ou à réparer l’enveloppe nucléaire après sa rupture. En outre, Par3 et BAG3 contribuent également au remodelage de l’enveloppe nucléaire induit par une diminution de sa rigidité par déplétion des lamines en absence d’E4orf4. Ces résultats suggèrent qu’ils participent à la régulation normale de la mécanique nucléaire dans les cellules cancéreuses. iv Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse appuient un rôle inconnu jusqu’alors pour Par3 et BAG3 dans la plasticité de l’enveloppe nucléaire, qui émerge comme un processus important de la biologie des cellules cancéreuses, contribuant notamment à la migration et à l’invasion tumorale. Cette voie de remodelage du noyau impliquant Par3 et BAG3 pourrait offrir de nouvelles opportunités pour le développement de thérapies moléculaires ciblées. / The human adenovirus E4orf4 protein is considered as a tumoricidal factor, as it induces cell death in tumor cells while exhibiting low toxicity in non-transformed cells. It was demonstrated that E4orf4 engages a non-apoptotic cell death program, which depends on Src-family kinases and perturbations of actomyosin dynamics. This toxic activity relies on E4orf4 localization dynamics: while E4orf4 is initially nuclear, it gradually accumulates in the cytoplasm where it initiates an atypical remodeling of the actin cytoskeleton associated with cell death. Inhibition of E4orf4’s cytoplasmic accumulation also inhibits actin remodeling, and vice versa. Thus, current data support a functional connection between E4orf4’s subcellular dynamics, actin remodeling, and E4orf4-induced cell death in tumor cells; however, the molecular mechanisms involved are misunderstood. The work presented in this thesis was aimed at identifying key cellular effectors that control E4orf4’s localization dynamics and interrogating their role in the regulation of E4orf4’s tumoricidal action. We identified the polarity protein Par3 (PARD3) as a binding partner of E4orf4 that is required for the induction of its actin-dependent toxic activity, using proteomic, biochemical and cellular approaches. The results suggest that Par3 and the other Par complex proteins are involved in E4orf4-induced remodeling of the perinuclear actin network in tumor cells. The resulting increase in perinuclear contractility stimulates the formation and rupture of nuclear blebs, leading to transient breaks in the nuclear envelope, cytoplasmic accumulation of E4orf4, and loss of nuclear compartmentalization. Moreover, we found that E4orf4 triggers the recruitment of the co-chaperone BAG3 and the autophagic machinery at nuclear blebs formation sites. The results suggest that a BAG3-dependent autophagy pathway is induced in response to E4orf4 to cope with mechanical stress, which could participate in maintaining the integrity and/or repairing the nuclear envelope after its rupture. Furthermore, Par3 and BAG3 also regulate nuclear envelope remodeling and integrity in cells depleted of lamins, suggesting that these E4orf4 targets may be bona fide regulators of nuclear mechanics in cancer cells. Thus, the results presented in this thesis support a so-far unappreciated role for Par3 and BAG3 in nuclear envelope plasticity, which emerges as a crucial process regulating cancer vi cell biology, notably during tumor cell migration and invasion. This nuclear remodeling pathway involving Par3 and BAG3 could offer new opportunities for the development of targeted molecular therapies.

Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence, E sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique. Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement. L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle de sélectines, chimiokines et intégrines. Le blocage de l'augmentation de l'activité de SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par l’adhérence de la voie SAPK2/p38. / Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29 cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27. Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38 and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins, chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1) adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2p38 pathway.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus commun chez les hommes de plus de 50 ans, représentant 20% de l'incidence de tous les cancers en 2021. Après l'approche initiale par chirurgie, environ 30% des patients ont une récurrence et suivent une thérapie de déprivation androgénique, qui mène éventuellement à l'atteinte d'un état de résistance à la castration pour lequel aucun traitement curatif n'existe. De récentes études ont montré un intérêt pour l'activation de la AMP-activated kinase (AMPK) comme traitement pour les CaP résistants à la castration. Cette stratégie repose sur la capacité de la AMPK à inactiver la mechanistic target of rapamycin (mTOR), une protéine impliquée dans une voie de signalisation associée à la prolifération des cellules cancéreuses. Contrairement au dogme établi, nos résultats indiquent que la AMPK n'inhibe pas mTOR dans différents modèles cellulaires de CaP, suggérant que ses fonctions y seraient différentes. En effet, l'activation de la AMPK par le A-769662 a démontré que son activité est nécessaire pour le maintien des fonctions mitochondriales en réponse aux androgènes. Pour étudier plus en profondeur les fonctions de la AMPK, nous avons développé un modèle n'exprimant pas les sous-unités catalytiques de la AMPK, à partir de cellules de CaP 22Rv1. Ce modèle a confirmé que l'activité de la AMPK est essentielle pour maintenir la production d'ATP maximale via la respiration mitochondriale dans les cellules de CaP. En fait, des essais de flux extracellulaire sont montré que le knockout de l'activité de la AMPK nuit à la respiration mitochondriale, à l'intégrité des mitochondries, à la flexibilité métabolique ainsi qu'à la prolifération cellulaire. Ces découvertes mettent de l'avant des fonctions oncogéniques associées à la AMPK et indiquent que l'inhibition des fonctions de la AMPK serait requise, plutôt que son activation, pour le traitement du CaP.