Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les cellules tumorales malignes accumulent des altérations génétiques qui favorisent une plasticité nucléaire accrue et l'invasion tumorale. La réorganisation des réseaux d'actomyosine cause une augmentation des forces mécaniques qui sont transmises à l'enveloppe nucléaire par des connexions physiques. Ces connexions physiques permettent aux cellules d'ajuster la réponse nucléaire aux stress du microenvironnement tumoral, incluant les carences d'espace et de nutriments, et d'induire une réponse cellulaire adaptative pour échapper à ces contraintes. En outre, ces forces mécaniques causent souvent des ruptures de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorales. Ces ruptures nucléaires pourraient favoriser les déformations nucléaires requises durant la migration cellulaire à travers les espaces serrés de la matrice extracellulaire. Remarquablement, les cellules tumorales survivent à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire grâce à des mécanismes de réparation efficaces. Cependant, les ruptures nucléaires répétées causent une accumulation de dommages à l'ADN et pourraient contribuer à l'acquisition d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, élucider les mécanismes moléculaires régulant les processus de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire pourrait identifier des cibles thérapeutiques pertinentes pour contrecarrer l'invasion tumorale. La protéine adénovirale E4orf4 induit une activité toxique sélective chez les cellules tumorales. Cependant, les bases moléculaires de l'action sélective d'E4orf4 demeurent méconnues. Il a été démontré qu'E4orf4 réorganise le réseau d'actomyosine à proximité du noyau et provoque des déformations nucléaires dramatiques. Nous avons émis l'hypothèse que la protéine adénovirale E4orf4 exerce une activité toxique sélective dans les cellules tumorigéniques en perturbant la forme et la dynamique nucléaire, notamment via sa capacité à déréguler l'organisation du cytosquelette d'actine. L'objectif général de ces travaux de thèse est d'étudier la contribution des changements de forme et de dynamique nucléaire dans l'activité toxique d'E4orf4 et les mécanismes impliqués. La prémisse est que les cibles cellulaires d'E4orf4 réguleraient le remodelage de l'enveloppe nucléaire par les forces mécaniques et la plasticité nucléaire. Afin d'adresser cette hypothèse, les effets d'E4orf4 sur le réseau périnucléaire d'actine et sur l'organisation de l'enveloppe nucléaire, de même que les effecteurs cellulaires impliqués, ont été étudiés dans une variété de lignées cellulaires tumorigéniques et non-tumorigéniques. Les travaux présentés au Chapitre 1 indiquent qu'E4orf4 perturbe l'organisation de l'enveloppe nucléaire dans les cellules tumorigéniques seulement, d'une manière qui dépend du recrutement de fibres contractiles à l'enveloppe nucléaire. Ce processus requiert son association avec la protéine de polarité Par3 et la transmission des forces mécaniques à l'enveloppe nucléaire par le complexe LINC. Remarquablement, cette activité toxique sélective d'E4orf4 est associée à des ruptures répétées de l'enveloppe nucléaire provoquant une perte de l'intégrité nucléaire chez une proportion significative de cellules. De plus, les travaux présentés au Chapitre 2 identifient le régulateur épigénétique Ash2L comme substrat de la tyrosine kinase oncogénique Src dont la signalisation est perturbée par E4orf4 qui modifie la réponse nucléaire au stress mécanique. Des analyses moléculaires, biochimiques et fonctionnelles ont révélé que la phosphorylation d'Ash2L par Src est dérégulée par E4orf4 et qu'elle augmente la résistance du noyau aux ruptures de l'enveloppe nucléaire induites soit par E4orf4 ou par un affaiblissement de la lamina nucléaire. De plus, Ash2L régule également les ruptures nucléaires causées par les contraintes physiques appliquées lors de la migration cellulaire sous confinement. Ensemble, ces travaux ont permis d'identifier deux nouvelles cibles cellulaires d'E4orf4, Par3 et Ash2L, qui régulent son action toxique sélective, laquelle est caractérisée par l'induction de ruptures nucléaires répétées. En outre, nos travaux suggèrent que les cibles d'E4orf4 sont des régulateurs authentiques des ruptures nucléaires par le stress mécanique. Ces travaux établissent E4orf4 comme un nouveau paradigme pour étudier les mécanismes qui contrôlent les évènements de rupture et réparation de l'enveloppe nucléaire et la plasticité nucléaire qui ont un effet sur les propriétés métastatiques des cellules tumorales. / Malignant tumor cells accumulate genetic alterations that increase nuclear plasticity and tumor invasion. Reorganization of actomyosin networks increases cellular contractility and mechanical forces that are transmit to the nuclear envelope through physical connections. These physical connections enable the cells to adjust their nuclear response to microenvironmental stress, including space and nutrient deficiencies, and to induce an adaptive cellular response to escape these stresses. In addition, these mechanical forces often cause ruptures of the nuclear envelope in tumor cells. Notably, nuclear ruptures are thought to facilitate the nuclear deformations required during cell migration through the tight spaces of the extracellular matrix. Remarkably, tumor cells can survive repeated nuclear ruptures using efficient nuclear envelope repair mechanisms. However, repeated nuclear ruptures cause DNA damage accumulation and could contribute to a more invasive tumor cell phenotype. Thus, understanding the biology of nuclear envelope rupture and repair processes is therapeutically relevant. The adenoviral protein E4orf4 exerts tumor cell selective killing. However, the molecular basis for the selective action of E4orf4 remains poorly understood. E4orf4 has been shown to reorganize the actomyosin network near the nucleus and to cause dramatic nuclear deformations. We hypothesized that E4orf4 exerts a selective toxicity by disrupting the nucleus' shape and dynamics, notably through its capacity to deregulate the actin cytoskeleton organization. The general objective of this thesis work is to study the contribution of the modifications of the nucleus' shape and dynamics in the cytotoxic activity of E4orf4, and identify the mechanisms involved. The premise is that the cellular targets of E4orf4 would regulate the remodeling of the nuclear envelope by mechanical forces and nuclear plasticity. In order to address this hypothesis, we analyzed the effects of E4orf4 on the perinuclear actin network and on the organization of the nuclear envelope in a variety of tumorigenic and non-tumorigenic cell lines and identified the cellular effectors involved. The work presented in Chapter 1 indicates that E4orf4 disrupts the organization of the nuclear envelope in tumorigenic cells only, in a manner that depends on the recruitment of contractile actin fibers at the nuclear envelope surface. This process requires its association with the polarity protein Par3 and the transmission of mechanical forces to the nuclear envelope by the LINC complex. Remarkably, this selective toxic activity of E4orf4 is associated with repetitive ruptures of the nuclear envelope causing a loss of nuclear integrity in a significant proportion of the cells. In addition, the work presented in Chapter 2 identifies the epigenetic regulator Ash2L as a novel substrate of the oncogenic tyrosine kinase Src, that is targeted by E4orf4 and that modifies the nuclear response to mechanical stress. Molecular, biochemical and functional analyzes revealed that Src-mediated Ash2L Tyr phosphorylation is deregulated by E4orf4 and increases the nuclear mechanical resistance to the mechanical stress induced by E4orf4 or lamin A/C deficiency. In addition, Ash2L also regulates nuclear ruptures caused by physical constraints during confined cell migration. Together, this work has identified two novel cellular targets of E4orf4, Par3 and Ash2L, regulating its tumor cell-selective action that is characterized by the induction of repetitive nuclear ruptures. Importantly, these studies suggest that E4orf4's targets are bona fide regulators of nuclear ruptures induced by mechanical stress in tumorigenic cells. This thesis work establishes E4orf4 as a new paradigm for studying the mechanisms controlling nuclear envelope rupture and repair events and nuclear plasticity, which are relevant for the metastatic properties of tumor cells.

La protéine E4orf4 de l’adénovirus humain est membre d’une famille de facteurs tumoricides, qui induisent la mort cellulaire des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales. Il a été montré que dans les cellules transformées, E4orf4 induit un programme de mort cellulaire non apoptotique dépendante des kinases Src et d’une dérégulation de la dynamique d’actomyosine. Cette activité toxique d’E4orf4 est déterminée notamment par sa localisation intracellulaire : E4orf4 est initialement nucléaire, puis elle s’accumule graduellement dans le cytoplasme où elle initie un remodelage atypique du cytosquelette d’actine associé à la mort cellulaire. L’inhibition de l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4 empêche également le remodelage de l’actine, et vice versa. Il existe donc un lien fonctionnel entre la dynamique subcellulaire d’E4orf4, le remodelage du réseau d’actine, et l’activité toxique d’E4orf4 ; toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués demeurent peu compris. Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour but d’identifier les effecteurs cellulaires contrôlant la localisation d’E4orf4 et d’étudier leur implication dans son activité tumoricide. Des analyses protéomiques ont identifié la protéine de polarité Par3 (PARD3) comme un partenaire d’E4orf4 requis pour l’induction de son activité toxique dépendante de l’actine. Les résultats suggèrent que Par3 et ses partenaires formant le complexe de polarité Par sont impliqués dans le remodelage d’un réseau périnucléaire d’actomyosine dans les cellules tumorales. Ce phénomène stimule la formation et la rupture de blebs de noyau, menant à des bris transitoires de l’enveloppe nucléaire et permettant l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4. D’autre part, nous avons mis en évidence qu’E4orf4 stimule le recrutement du cochaperon BAG3 et de la machinerie autophagique aux sites de formation des blebs nucléaires. Les résultats suggèrent qu’une voie autophagique dépendante de BAG3 est induite en réponse à E4orf4 afin de faire face au stress mécanique, laquelle pourrait contribuer à maintenir l’intégrité et/ou à réparer l’enveloppe nucléaire après sa rupture. En outre, Par3 et BAG3 contribuent également au remodelage de l’enveloppe nucléaire induit par une diminution de sa rigidité par déplétion des lamines en absence d’E4orf4. Ces résultats suggèrent qu’ils participent à la régulation normale de la mécanique nucléaire dans les cellules cancéreuses. iv Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse appuient un rôle inconnu jusqu’alors pour Par3 et BAG3 dans la plasticité de l’enveloppe nucléaire, qui émerge comme un processus important de la biologie des cellules cancéreuses, contribuant notamment à la migration et à l’invasion tumorale. Cette voie de remodelage du noyau impliquant Par3 et BAG3 pourrait offrir de nouvelles opportunités pour le développement de thérapies moléculaires ciblées. / The human adenovirus E4orf4 protein is considered as a tumoricidal factor, as it induces cell death in tumor cells while exhibiting low toxicity in non-transformed cells. It was demonstrated that E4orf4 engages a non-apoptotic cell death program, which depends on Src-family kinases and perturbations of actomyosin dynamics. This toxic activity relies on E4orf4 localization dynamics: while E4orf4 is initially nuclear, it gradually accumulates in the cytoplasm where it initiates an atypical remodeling of the actin cytoskeleton associated with cell death. Inhibition of E4orf4’s cytoplasmic accumulation also inhibits actin remodeling, and vice versa. Thus, current data support a functional connection between E4orf4’s subcellular dynamics, actin remodeling, and E4orf4-induced cell death in tumor cells; however, the molecular mechanisms involved are misunderstood. The work presented in this thesis was aimed at identifying key cellular effectors that control E4orf4’s localization dynamics and interrogating their role in the regulation of E4orf4’s tumoricidal action. We identified the polarity protein Par3 (PARD3) as a binding partner of E4orf4 that is required for the induction of its actin-dependent toxic activity, using proteomic, biochemical and cellular approaches. The results suggest that Par3 and the other Par complex proteins are involved in E4orf4-induced remodeling of the perinuclear actin network in tumor cells. The resulting increase in perinuclear contractility stimulates the formation and rupture of nuclear blebs, leading to transient breaks in the nuclear envelope, cytoplasmic accumulation of E4orf4, and loss of nuclear compartmentalization. Moreover, we found that E4orf4 triggers the recruitment of the co-chaperone BAG3 and the autophagic machinery at nuclear blebs formation sites. The results suggest that a BAG3-dependent autophagy pathway is induced in response to E4orf4 to cope with mechanical stress, which could participate in maintaining the integrity and/or repairing the nuclear envelope after its rupture. Furthermore, Par3 and BAG3 also regulate nuclear envelope remodeling and integrity in cells depleted of lamins, suggesting that these E4orf4 targets may be bona fide regulators of nuclear mechanics in cancer cells. Thus, the results presented in this thesis support a so-far unappreciated role for Par3 and BAG3 in nuclear envelope plasticity, which emerges as a crucial process regulating cancer vi cell biology, notably during tumor cell migration and invasion. This nuclear remodeling pathway involving Par3 and BAG3 could offer new opportunities for the development of targeted molecular therapies.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La mort cellulaire programmée assure l'élimination des cellules représentant une menace pour l'organisme. Des lésions génétiques permettant de résister à la mort par apoptose contribuent à la progression tumorale et à la résistance aux thérapies anticancéreuses classiques. Les travaux présentés dans cette thèse visent une meilleure compréhension des programmes alternatifs de mort cellulaire agissant efficacement dans les cellules tumorales. La protéine E4orf4 de l'adénovirus active un tel programme indépendant de p53 et de l'activité des caspases. Des données suggèrent que E4orf4 redirige l'activité oncogénique de Src vers la réorganisation de l'actine au détriment des voies de survie cellulaire. L'objectif de cette thèse est d'étudier la contribution de la dynamique de l'actine dans la mort cellulaire induite par E4orf4. Les résultats indiquent que E4orf4 induit deux programmes alternatifs de mort cellulaire selon sa localisation dans les cellules transformées. E4orf4 induit un programme indépendant de Src à partir du noyau et un programme dépendant de Src et de l'activité des calpaïnes à partir d'un compartiment membranaire. Une étude approfondie du programme dépendant de Src a révélé que la translocation de E4orf4 dans le cytoplasme et les membranes active la myosine II et stimule une nouvelle polymérisation de l'actine, laquelle est associée avec le recrutement et l'ancrage des endosomes de recyclage dans une région juxtanucléaire. Ce remodelage de l'actine requiert l'association de E4orf4 avec Src et une activation locale des voies de signalisation des petites GTPases RhoA/Rho kinase, Racl et Cdc42/N-Wasp. Certains résultats suggèrent que la présence de E4orf4 dans les radeaux lipidiques pourrait favoriser le recrutement de la machinerie de régulation de l'actine par la production de PIP2. E4orf4 détournerait le trafic endosomal pour permettre l'assemblage d'un anneau contractile juxtanucléaire ancré à la périphérie de la cellule par des fibres de stress. Des résultats solides indiquent que l'activité cytotoxique de E4orf4 relève de son effet sur la dynamique de l'actine. Cette thèse propose qu'un dérèglement de la dynamique de l'actine qui interfère avec le trafic membranaire normal peut déclencher un programme de mort cellulaire alternatif à partir des voies de sécrétion.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 août 2023) / Les changements dans la forme et la déformation du noyau qui déterminent la plasticité nucléaire influencent le potentiel métastatique des cellules tumorales. Entre autres, la migration cellulaire dans un environnement confiné repose sur de grandes déformations nucléaires qui sont limitées par la rigidité nucléaire. L'enveloppe nucléaire (NE) est souvent fragilisée, entraînant une rupture de la NE durant l'interphase. En outre, les cellules cancéreuses sont sujettes aux ruptures spontanées de la NE et subissent des ruptures de la NE lors de la migration confinée. Bien que les cellules cancéreuses survivent à des événements répétés de ruptures nucléaires en réparant leur enveloppe nucléaire, une perte transitoire et répétée de l'intégrité de celle-ci est associée à l'accumulation de dommages à l'ADN, à l'instabilité génomique et à la promotion d'un phénotype tumoral invasif. Ainsi, l'étude des mécanismes impliqués pourrait identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Récemment, nous avons décrit la protéine adénovirale E4orf4 comme un nouvel outil pour déchiffrer ces mécanismes. E4orf4 induit une destruction sélective des cellules tumorales en provoquant une forte incidence de ruptures de la NE. Nous avons identifié Ash2L, un régulateur épigénétique, comme un nouveau substrat de la tyrosine kinase Src qui est dérégulée par E4orf4. La déplétion d'Ash2L, ou sa phosphorylation site-spécifique, interfèrent avec les ruptures de la NE induites par E4orf4 ou par une carence en lamine A. Notre hypothèse est qu'Ash2L et sa phosphorylation modulent la résilience mécanique de la NE, en partie, en régulant l'organisation de la chromatine. Le but de ce projet de maîtrise était d'étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la résilience nucléaire au stress mécanique par Ash2L, en poursuivant deux objectifs spécifiques : 1) Analyser la contribution de l'organisation de la chromatine à l'effet régulateur d'Ash2L sur les ruptures de l'enveloppe nucléaire ; 2) Analyser l'impact d'Ash2L et de sa phosphorylation sur l'organisation de la chromatine. Afin d'analyser la contribution de l'organisation de la chromatine à l'effet régulateur de Ash2L, nous avons utilisé des inhibiteurs des histones méthyltransférases affectant la compaction de la chromatine. Par microscopie en temps réel, nous montrons que de courts traitements avec ces inhibiteurs dans les cellules déplétées en Ash2L rétablissent partiellement les phénotypes de rupture de la NE induits par E4orf4 ou par une carence an lamines A. De plus, la déplétion d'Ash2L ou sa phosphorylation site-spécifique réduit la triméthylation de l'histone H3 sur la lysine 4 et semble modifier l'organisation des foyers d'hétérochromatine enrichis en histone H3 triméthylée sur la lysine 27. Enfin, nous avons découvert que la déplétion d'Ash2L réduit le potentiel migratoire des cellules métastatiques de carcinomes rénaux RCC4 dans un microenvironnement dense. Les résultats obtenus suggèrent qu'Ash2L et sa phosphorylation régulent la résilience nucléaire au stress mécanique en modifiant l'état de compaction de la chromatine. Ash2L pourrait donc contribuer à la réponse adaptative des cellules cancéreuses aux changements du microenvironnement qui favorisent l'invasion tumorale. / Changes in the shape and deformability of the nucleus, that determines nuclear plasticity, influence the metastatic potential of tumor cells. Among other events, cell migration in a confined environment relies on large nuclear deformations which are limited by nuclear rigidity. The nuclear envelope (NE) is often weakened, leading to NE rupture during interphase. In addition, cancer cells are prone to spontaneous NE ruptures and undergo NE ruptures during confined migration. Although cancer cells survive repeated events of nuclear rupture by repairing the NE, transient and repeated NE integrity loss is associated with DNA damage accumulation, genomic instability, and the promotion of an invasive tumor phenotype. Therefore, the study of the mechanisms involved could identify new therapeutic targets. Recently, we described the adenoviral protein, E4orf4, as a new tool to decipher these mechanisms. E4orf4 induces selective destruction of tumor cells causing a high incidence of NE ruptures. We have identified Ash2L, an epigenetic regulator, as a novel substrate for the Src tyrosine kinase which is deregulated by E4orf4. Ash2L depletion, or its site-specific phosphorylation, interferes with NE ruptures induced by E4orf4 or by lamin A deficiency. We hypothesize that Ash2L and its phosphorylation modulate the mechanical resilience of NE, in part, by regulating chromatin organization. This master's project aimed to study the mechanisms involved in the regulation of nuclear resilience to mechanical stress by Ash2L and pursued two specific objectives: 1) To analyze the contribution of chromatin organization to the regulatory effect of Ash2L on nuclear envelope ruptures; 2) To analyze the impact of Ash2L and its phosphorylation on the organization of chromatin. To analyze the contribution of chromatin organization to the regulatory effect of Ash2L, we used histone methyltransferase inhibitors affecting chromatin compaction. By real-time microscopy, we show that short treatments with these inhibitors in cells depleted of Ash2L partially restore the NE disruption phenotypes induced by E4orf4 or by lamin A deficiency. In addition, Ash2L depletion or its site-specific phosphorylation reduces the trimethylation of histone H3 on lysine 4 and appears to modify the organization of heterochromatin foci enriched in trimethylated histone H3 on lysine 27. Finally, we discovered that the depletion of Ash2L reduces the migratory potential of metastatic RCC4 renal carcinoma cells in a dense microenvironment. The results obtained suggest that Ash2L and its phosphorylation regulate nuclear resilience to mechanical stress by modifying the state of chromatin compaction. Ash2L may therefore contribute to the adaptive response of cancer cells to changes in the microenvironment that promote tumor invasion.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Les mécanismes de mort cellulaire programmée (MCP), dont l'apoptose est le mieux caractérisé, assurent l'élimination des cellules qui sont potentiellement dangereuses pour l'organisme. Or, l'acquisition de lésions génétiques touchant des régulateurs clefs de l'apoptose contribue à la transformation cellulaire et à la résistance face à plusieurs thérapies anticancéreuses. Les travaux présentés dans cette thèse visent une meilleure compréhension des mécanismes alternatifs de MCP qui opèrent sélectivement dans les cellules cancéreuses. La protéine E4orf4 de 1'adenovirus humain active un tel mécanisme de MCP qui est indépendant des caspases et insensible à la surexpression de BCL-2. Au début de mon doctorat, les données indiquaient que l'activité toxique de E4orf4 reposait sur une modulation de l'activité des kinases de la famille Src (Src family kinases, SFKs) menant à des changements de la dynamique de l'actine régulés par les Rho GTPases. Notamment, il était établi que Cdc42 était activé par E4orf4 et stimulait la polymérisation de l'actine au niveau des endosomes de recyclage (ERs). En se basant sur ces données, l'objectif de cette thèse était d'étudier l'impact des changements de l'actine régulés par Cdc42 sur le trafic des ERs et les conséquences sur la dynamique des organelles impliquées dans la signalisation de la MCP. Mes résultats ont mis en évidence une voie de signalisation dépendante des SFKs Src et Yes, de Cdc42 et de Rabl la qui stimule le transport rétrograde des ERs au Golgi et inhibe le recyclage de cargos à la membrane plasmique. Une telle mobilisation des ERs au Golgi est associée à des changements de la dynamique du Golgi, lesquels sont requis pour la progression du signal de mort cellulaire et mènent à une fragmentation du Golgi. Ce processus a également été impliqué dans la mort cellulaire induite par la staurosporine en présence d'inhibiteurs de caspases, suggérant un rôle conservé dans les mécanismes alternatifs de mort cellulaire. Mes travaux ont aussi suggéré que les changements observés dans le transport endosomal et la dynamique du Golgi influence la dynamique des mitochondries en inhibant la fusion mitochondriale, laquelle est normalement requise pour le métabolisme énergétique et la survie cellulaire. En somme, mes travaux ont identifié une nouvelle voie de signalisation qui est activée en réponse au stress et qui est impliquée dans la communication inter-organelle via la mobilisation des ERs vers diverses organelles.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus de type 2 induit un mécanisme de mort cellulaire alternatif indépendant des caspases et qui résiste à l'oncogène Bcl-2. E4orf4 constitue donc un outil moléculaire puissant pour étudier de nouveaux effecteurs impliqués dans la mort cellulaire. À mon arrivée dans le laboratoire, il avait été démontré qu'E4orf4 usurpait l'activité des tyrosine kinases de la famille Src afin de réorganiser le cytosquelette d'actine et que ce processus était corrélé avec son activité cytotoxique. Par contre, la nature des modifications de la dynamique de l'actine ainsi que le mécanisme moléculaire impliqué étaient inconnus. L'hypothèse à la base de mes travaux est qu'E4orf4 désorganise le réseau d'actine en manipulant l'activité des Rho GTPases et que le débalancement de la dynamique de l'actine qui en résulte engage la cellule dans un programme de mort cellulaire alternatif. Mes travaux indiquent qu'E4orf4 active le sentier Src-RhoA-ROCK, ce qui stimule la contractilité cellulaire en activant la myosine II. L'activité de cette dernière est essentielle, car son inhibition bloque le programme de mort cellulaire induit par E4orf4. Par conséquent, mes travaux ont contribué à établir un lien fonctionnel entre la dynamique de l'actine et la mort cellulaire. De plus, mes résultats indiquent que la stimulation du sentier Src-RhoA -ROCK par E4orf4 contribue à activer la MAP kinase JNK qui est nécessaire pour phosphoryler la sérine 178 de paxilline. Mes résultats montrent que la phosphorylation de cette sérine de paxilline diminue sa mobilité, contribuant ainsi à stabiliser les plaques d'adhérence en aval d'E4orf4. En outre, la phosphorylation de la sérine 178 de paxilline est essentielle à l'activité cytotoxique d'E4orf4, car son iphibition interfère avec la réorganisaton du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire induites par E4orf4. Ainsi, mes travaux suggèrent que JNK coopère avec la myosine II pour perturber la dynamique de l'adhérence et de l'actine en aval d'E4orf4. En conséquence, je propose qu'E4orf4 induit l'axe de signalisation Src-RhoA-ROCK pour générer un stress mécanique via la coordination des dynamiques de l'adhérence et de l'actine qui culmine par la mort programmée de la cellule.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus humain induit la mort cellulaire de façon sélective dans les cellules transformées lorsqu'elle est exprimée en dehors de son contexte viral. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont permis d'identifier une cible majeure de E4orf4, les tyrosine kinases de la famille Src. L'association de E4orf4 à la tyrosine kinase Src entraîne des perturbations au niveau du cytosquelette d'actine, ce qui mène à l'activation d'un sentier alternatif de mort cellulaire physiologique à partir du cytoplasme (activité toxique cytoplasmique). Les travaux présentés dans cette thèse démontrent que E4orf4 est phosphorylée sur résidus tyrosine et que sa phosphorylation est requise pour son activité toxique cytoplasmique. Quatre résidus tyrosine (Y) phosphorylés ont été identifiées : Y26, Y42, Y59 et Y60. La phosphorylation de la tyrosine 42 et possiblement des tyrosines 26 et 59 est modulée par l'activité des kinases de la famille Src. Le développement d'anticorps polyclonaux phospho-spécifiques a permis de confirmer que les tyrosines 42 et 60 sont phosphorylées in vivo, dans les conditions où E4orf4 induit la mort cellulaire. L'anticorps anti-phospho-Y42 reconnaît également des substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4. Certains de ces substrats ont été isolés par immunoprécipitation à l'aide de cet anticorps et ont été identifiés par spectrométrie de masse de type LC-MS/MS. De plus, E4orf4 phosphorylée, Src et les substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4 sont enrichis dans un compartiment vésiculaire juxtanucléaire à partir duquel le signal de mort semble initié. L'utilisation de mutants de E4orf4 montre que sa phosphorylation possède deux rôles majeurs. La phosphorylation de la tyrosine 42 potentialise l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 en stabilisant sa localisation cytoplasmique et membranaire et en favorisant sa phosphorylation sur d'autres sites. La tyrosine 26 et le site tyrosine 59/60 contribuent individuellement pour environ 50% de l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 et semblent permettre le recrutement de complexes signalétiques menant à l'induction de la mort cellulaire. Mes résultats suggèrent que la protéine adaptatrice Grb2, la tyrosine phosphatase Shp2, la kinase DNA-PK et l'ATPase p97-VCP s'associent à E4orf4. Le rôle potentiel de ces protéines dans l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 est discuté.