Les spermatozoïdes sont des cellules haploïdes hautement spécialisées ayant pour but ultime la fécondation de l'ovocyte. Afin de devenir aptes à la fécondation, les cellules germinales mâles subissent plusieurs étapes de maturation, impliquant bien des modifications tant au niveau protéique, membranaire et intracellulaire. Toutefois, les spermatozoïdes de mammifères fraîchement éjaculés sont incapables de féconder et acquièrent leur plein pouvoir fécondant à l'intérieur du tractus génital femelle, lors de leur transit pour rencontrer l'ovule. Ces différentes étapes de maturation permettent aux spermatozoïdes d'obtenir, entre autres, leur caractéristique unique concernant leur composition protéique et lipidique. Cette complexité membranaire est un mécanisme permettant aux spermatozoïdes d'avoir une spécificité de signal qui rend possible la capacitaton et la réaction acrosomiale au moment et endroit opportuns. Enfin, ce mémoire traitera du fractionnement membranaire et des partenaires d'interaction de la tyrosine kinase YES1 chez les spermatozoïdes humains.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 juillet 2023) / Au cours du développement et lors du maintien de l'homéostasie chez les adultes, divers processus sont nécessaires pour maintenir l'architecture tissulaire. Par exemple, dans les tissus épithéliaux, la distribution asymétrique des composantes cellulaires menant à la formation de domaines distincts ainsi que la formation des jonctions sont des processus cellulaires clés qui doivent être finement régulés pour maintenir la structure et la fonction épithéliales. La dérégulation de l'un de ces processus peut entraîner des défauts dans l'architecture épithéliale et contribuer à la progression de maladies comme le cancer. Dans les dernières années, un nombre croissant d'études ont mis en évidence un lien entre la signalisation des récepteurs EPH et le développement et le maintien de l'homéostasie des tissus épithéliaux. Notamment, les récepteurs EPH interagissent avec des protéines impliquées dans des processus tels que l'établissement et le maintien de la polarité des cellules épithéliales et des jonctions cellulaires. La dérégulation de la signalisation des récepteurs EPH a aussi été associée à des défauts d'orientation de division cellulaire. Nous avons émis l'hypothèse qu'un sous-groupe de récepteurs EPH coordonne la morphogénèse épithéliale en interagissant avec des protéines impliquées dans la polarité apico-basale. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé la culture tridimensionnelle de cellules Caco-2, une lignée du cancer du côlon. Nous avons d'abord montré qu'au moins deux des quatorze récepteurs EPH (EPHA1 et -B4) sont exprimés dans des cellules épithéliales Caco-2 polarisées. L'analyse de la localisation subcellulaire de ces deux récepteurs dans les sphéroïdes de Caco-2 a révélé qu'EPHA1 et EPHB4 sont localisés au domaine basolatéral. Pour comprendre le rôle des récepteurs EPH dans la morphogenèse épithéliale, nous avons effectué des expériences de perte de fonction. Nos résultats montrent que la déplétion d'EPHA1 ou EPHB4 mène à la formation de sphéroïdes désorganisés. Nous avons identifié les domaines des récepteurs EPH responsables de la coordination de la morphogénèse épithéliale dans les sphéroïdes de Caco-2 par analyse structure-fonction. Nos résultats montrent que le domaine intracellulaire d'EPHA1 et plus particulièrement sa région incluant le domaine de liaison aux protéines SAM et le motif PDZ est responsable du rôle d'EPHA1 dans l'organisation des sphéroïdes épithéliaux. En ce qui concerne EPHB4, nos résultats suggèrent que les défauts de morphogénèse dans les sphéroïdes de Caco-2 dépendent plutôt de son domaine extracellulaire. Pour mieux comprendre le phénotype associé à la perte de fonction d'EPHA1 et EPHB4, nous avons exploré deux processus qui, lorsqu'ils sont dérégulés, peuvent entraîner des défauts dans l'organisation tissulaire : le maintien de la polarité apico-basale et l'orientation du fuseau mitotique. Plutôt que d'affecter l'intégrité de la polarité apico-basale, nos résultats suggèrent que le phénotype de perte de fonction provient de défauts dans l'orientation du fuseau mitotique de cellules en division, ce qui est crucial pour le maintien d'une monocouche cellulaire pendant la morphogenèse du tissu épithélial. En conclusion, nos résultats montrent qu'EPHA1 et EPHB4 joue un rôle important dans la morphogénèse épithéliale des sphéroïdes de Caco-2 via la régulation de l'orientation du fuseau mitotique. Toutefois, EPHA1 et EPHB4 régulent ce processus selon deux mécanismes moléculaires différents. Puisque l'organisation en monocouche est perdue dans les tissus cancéreux, nos travaux pourraient permettre de mieux comprendre comment ces récepteurs contribuent à la morphogenèse épithéliale et à l'homéostasie dans le contexte de la progression du cancer. / During development and adult tissue homeostasis, various processes are required to maintain tissue architecture. For instance, in epithelial tissues, coordination of apical and basal membrane morphogenesis and cell-cell adhesion are key molecular mechanisms that must be tightly regulated to maintain epithelial structure and function. Dysregulation of any of these processes can lead to defects in epithelial architecture and contribute to the progression of diseases such as cancer. In the past years, a growing number of studies have demonstrated a link between EPH-EFN signaling and the development and maintenance of epithelial tissue homeostasis. In particular, several partners of the EPH receptors have been implicated in the establishment and maintenance of epithelial cell polarity and cell junctions. Dysregulation of EPH-EFN signaling has also been associated with defects in the orientation of cell divisions. We hypothesized that a subgroup of EPH receptors coordinates epithelial morphogenesis by interacting with proteins involved in apical-basal polarity. To test this hypothesis, we used three-dimensional culture of Caco-2 epithelial cells, a colon-cancer cell line. We first showed that at least two of the fourteen EPH receptors (EPHA1 and -B4) are expressed in polarized Caco-2 cells. Analysis of the subcellular localization of these two receptors in Caco-2 spheroids revealed that EPHA1 and EPHB4 were localized to the basolateral domain. To further study the role of EPH receptors in epithelial morphogenesis, we have performed loss-of-function experiments. These showed that either EPHA1 or EPHB4 depletion led to the formation of disorganized spheroids. We identified the structural domains of the EPH receptors responsible for coordinating epithelial morphogenesis in Caco-2 spheroids using a structure-function approach. Our results indicated that the intracellular domain of EPHA1 and more particularly the region including the SAM domain and the PDZ motif was required for the formation of normal epithelial spheroids. In contrast, our results suggested that the correct formation of Caco-2 spheroids required the extracellular domain of EPHB4. To better understand the phenotype associated with the loss of function of EPHA1 and EPHB4, we explored two processes that, when deregulated, can lead to defects in tissue organization: maintenance of apical-basal polarity and mitotic spindle orientation. Rather than affecting the integrity of the apical-basal polarity, our results suggested that the loss-of-function phenotype stems from defects in mitotic spindle orientation in dividing cells, which is known to be crucial for the maintenance of a cell monolayer during epithelial tissue morphogenesis. In conclusion, our results showed that EPHA1 and EPHB4 played an important role in Caco-2 spheroids epithelial morphogenesis via the regulation of mitotic spindle orientation. However, EPHA1 and EPHB4 regulate this process by different molecular mechanisms. Since monolayer organization is lost in cancerous tissues, our work could provide insight into how these receptors contribute to epithelial morphogenesis and homeostasis in the context of cancer progression.

Plusieurs réponses cellulaires aux stimuli extracellulaires sont transmises par des voies de signalisation qui agissent en aval de récepteurs membranaires tels les récepteurs tyrosine kinase (RTK). Les signaux provenant des RTK sont souvent relayés via des protéines adaptatrices comme NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) et NCK2 dont les fonctions sont considérées redondantes et indissociables. Toutefois, certaines études suggèrent que chacune de ces deux protéines pourraient avoir des cibles cellulaires spécifiques et des fonctions uniques. L’objectif de mon projet de doctorat était d’analyser la spécificité des protéines NCK1/2, c’est-à-dire d’identifier pour chacune des cibles uniques, pour ensuite caractériser ce qui génère cette spécificité tout en définissant la fonction de ces interactions. En premier lieu, j’ai utilisé deux techniques complémentaires de protéomique, soit (i) des purifications d’affinité (AP) et (ii) du marquage de proximité in vivo (BioID) suivies d’analyses en spectrométrie de masse (MS) afin de caractériser les interactomes respectifs de NCK1/2. La combinaison de ces deux approches m’a permis d’identifier plus d’une centaine d’interactions spécifiques pour chaque NCK. Des analyses bio-informatiques basées sur ces résultats m’ont permises de mettre en évidence que NCK2 semble plus spécifiquement impliquée que NCK1 dans la régulation de l’organisation du cytosquelette d’actine, structure essentielle lors de la division et de la cytokinèse. En comparant simultanément des cellules fibroblastiques murines (MEF) déplétées soit pour NCK1, soit pour NCK2, j’ai remarqué que les cellules Nck2-/-, à l’inverse des cellules Nck1-/- étaient plus multinucléées et présentent un midbody altéré en longueur. Également, j’ai remarqué une altération dans la composition du midbody des cellules Nck2-/- tel que suggéré par l’absence dans cette structure des protéines Polo-like kinase1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) ou encore Aurora B (AURKB), régulateurs clefs de la cytokinèse. Finalement, j’ai montré que la fonction de NCK2 durant la cytokinèse repose principalement sur son domaine SH2. Dans un deuxième temps, j’ai sélectionné 27 partenaires identifiés en MS et confirmé par une méthode orthogonale leurs interactions respectives avec NCK1 et/ou NCK2. Grâce à des tests de liaison in vitro, j’ai déterminé que plusieurs protéines dont la Plakophiline 4 (PKP4), un régulateur de la cytokinèse, lient directement et spécifiquement NCK2. Par différentes expériences in vitro, j’ai pu déterminer que NCK2 lie les portions N-terminale et centrale de PKP4 grâce à son domaine Src Homology (SH) 2 et que la spécificité de NCK2 envers PKP4 ne semble pas dépendre seulement des propriétés intrinsèques du SH2. L’association résulte plutôt de la combinaison d’une partie ou de l’ensemble des propriétés des domaines et régions interdomaines constituant les protéines NCK1/2. En conclusion, bien que les fonctions de NCK1/2 soient généralement considérées comme redondantes, mes résultats démontrent que ces protéines sont capables de lier des partenaires différentspour réguler des fonctions biologiques distinctes. Ainsi, mes travaux suggèrent que NCK2 semble spécifiquement requise lors du processus de cytokinèse. De plus, l’ensemble de mes expériences in vitro apporte une première idée du mécanisme de spécificité des protéines NCK1/2 en suggérant que leur spécificité ne semble pas entièrement provenir des propriétés intrinsèques de leurs domaines individuels, mais plutôt d’une combinaison des propriétés de leurs domaines et/ou régions interdomaines respectives. / Signals from cell surface receptors are often relayed via adaptor proteins that can serve as hubs to recruit appropriate target signaling molecules and guide signals along specific pathways. Among these, adaptor proteins NCK1 (Non-Catalytic region of tyrosine Kinase 1) and NCK2 have functions that are often considered redundant and/or indistinguishable. The main goal of my work was to demonstrate that NCK1 and NCK2 are not fully redundant and may each display functional specificity. To achieve this, I delineated NCK1-and NCK2-specific signalling networks, identified for each unique target, then characterized what generates this specificity and obtained the function of these interactions. First, to identify the complement of interaction partners for NCK1 and NCK2, I used two unbiased mass spectrometry (MS)-based approaches: (i) epitope-tagged protein affinity purification (AP) followed by MS analysis and (ii) in vivo proximity labelling (BioID). The combination of these two approaches allowed me to identify more than one hundred specific interactions for each NCK. Bioinformatics analyzes based on the specific partners identified in MS enabled me to highlight that NCK2 was more specifically involved in the regulation of the actin cytoskeleton organization, structure essential for cell division and cytokinesis. By simultaneously comparing mouse embryo fibroblasts (MEF) depleted either for NCK1 or NCK2, I noticed that Nck2-/-, but not Nck1-/-cells are multi-nucleated and display extended protrusions reminiscent of intercellular bridges, which correlate with an extended time spent in cytokinesis as well as a failure of a significant proportion of cells to complete abscission. Further analysis of this phenotype revealed that the midbody of NCK2-deficient cells is not only increased in length, but also altered in composition, as judged by the mislocalization of the Polo-like kinase 1 (PLK1), Epithelial cell transforming 2 (ECT2) and Aurora B (AURKB) proteins. Moreover, I showed that NCK2 function during cytokinesis requires its SH2 domain. Second, to underline the molecular mechanism of specific protein complex formation, I selected based on my MS results 27 partners to confirm by an orthogonal method their respective interactions with NCK1 and/or NCK2. By using in vitro binding assays, I was able to determine that several proteins including Plakophilin 4(PKP4), a key regulator of the cytokinesis process, were able to bind directly and specifically to NCK2. Through various in vitro experiments, I was able to determine that NCK2 binds the N-terminal and central portions of PKP4 through its SH2 domain and that the specificity of PKP4 toward NCK2 does not appear to result from the intrinsic properties of its SH2 alone. This association seems to result from the combination of some or all of the properties of the individual domains and inter-regions constituting the NCK1/2 proteins. In conclusion, despite what is generally accepted, I showed that both NCK1 and NCK2 may form specific protein complexes, thus reflecting the functional specificity of these two adaptor proteins. I further demonstrated that NCK1 and NCK2 are not completely redundant. I also shed light on a previously uncharacterized function for the NCK2 adaptor protein in cell division. Finally, my in vitro experiments provide an explanation for the specificity mechanism of NCK1/2 adaptor proteins by suggesting that their specificity come from the combination of the properties of their respective domains and/or interdomain regions.

Le neutrophile humain est impliqué dans la première ligne de défense du corps humain. Pour jouer ce rôle le neutrophile doit se rendre au site inflammatoire et phagocyter les agents microbiens. L'objectif de cette étude est d'étudier les mécanismes impliqués lors de la chimiotaxie des neutrophiles et la phagocytose. Les résultats obtenus permettent d'identifier plusieurs voies de signalisation impliquées dans ces deux réponses majeures du neutrophile et décrivent des différences majeures entre les signaux chimiotactiques qui permettent une spécialisation de la réponse.

Les polymorphonucléaires neutrophiles sont les principales cellules effectrices du système immunitaire inné. Les cristaux d'urate monosodique sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre les neutrophiles humains et les cristaux d'UMS est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aiguë. Le principal objectif de ce projet de recherche est d'identifier les voies de signalisation activées par les cristaux d'UMS et de caractériser leurs fonctions dans les réponses des neutrophiles humains.

Titre de l'écran-titre (visionné le 18 avril 2023) / La migration des lymphocytes T à travers la matrice extracellulaire (MEC) du tissu interstitiel est essentielle au développement de la réponse immunitaire adaptative. Pour atteindre les sites inflammatoires, les lymphocytes T doivent traverser la barrière endothéliale, et ce, suivant le mode de migration bidimensionnel (2D) qui implique les intégrines. De plus, ils doivent traverser la MEC du tissu interstitiel, formée majoritairement de collagène, et ce, suivant le mode tridimensionnel (3D). Nous et d'autres avons montré que la migration des lymphocytes Th17 à travers le collagène 3D implique le récepteur à activité tyrosine kinase nommé récepteur de domaine discoïdine 1 (DDR1). Ainsi, leur migration dépend de la voie MAPK/ERK induite par l'activité enzymatique de DDR1. Ici, nous rapportons que les cellules Th1 et Th2 expriment des niveaux comparables de DDR1 à ceux des cellules Th17 et que leur migration à travers le collagène est dépendante de DDR1. Cependant, l'adhésion des cellules auxiliaires (Th) au collagène est indépendante de DDR1, conformément au mouvement amiboïde des cellules T dans les modèles de matrice 3D. Sur un autre plan, il est connu que DDR1 peut induire deux voies de signalisation, la voie canonique dépendante de son activité enzymatique et la voie non canonique indépendante de celle-ci. Nos résultats montrent que l'activité enzymatique de DDR1 est essentielle à la migration des lymphocytes Th. En effet, l'inhibition de son activité enzymatique par le 7rh et par la construction DDR1 kinase-dead ont fortement réduit la migration des cellules Th. De plus, nous avons montré que la voie canonique MAPK/ERK est essentielle à leur migration. En somme, ces résultats fournissent de nouvelles connaissances sur les mécanismes de migration des lymphocytes T. Enfin, l'activité enzymatique de DDR1 pourrait être une cible thérapeutique afin d'inhiber l'infiltration des lymphocytes T dans les sites inflammatoires observés dans les maladies auto-immunes et allergiques. / T cell migration across tissue extracellular matrix (ECM) is a critical step in the development of adaptive immune response. To reach their target sites, T cells have to pass through two main barriers. One is the endothelial barrier and the second one is the interstitial matrix. Passing through the endothelial barrier follows the rules of two-dimensional (2D) mode of migration that has been studied in detail and involves integrin receptors. However, there are less studies regarding T cell migration through the interstitial matrix, which follows the rules of three-dimensional (3D) mode of migration. We and others previously showed that T cell migration across the 3D collagen that is the main component of the interstitial matrix involves the non-integrin collagen tyrosine kinase receptor named discoidin domain receptor 1 (DDR1). Previously, our group has reported that human Th17 cells migrate in 3D collagen via DDR1-mediated activation of the MAPK/ERK pathway. Herein, we report that human Th1 and Th2 effector cells express comparable levels of DDR1 as Th17 cells and also migrate in 3D collagen in a DDR1- dependent manner. DDR1 does not promote adhesion of Th effector cells to collagen consistent with the amoeboid movement of T cells in 3D matrix models. Furthermore, DDR1 could trigger its downstream signaling pathway either with or without using its tyrosine kinase domain, which is called canonical and non canonical signaling pathways, respectively. Therefore, we evaluated if this effect of DDR1 in promoting T cells 3D migration is mediated via DDR1 canonical pathway or non canonical pathway. Our results showed that the DDR1 tyrosine kinase activity was required for T cell migration. Indeed the specific DDR1 kinase inhibitor 7rh and the DDR1 kinase-dead construct strongly reduced the migration in 3D collagen of Th1, Th2 and Th17 cells. Finally, we showed that the DDR1 kinase activity was required for collagen-mediated MAPK/ERK activation, which is essential for T cell migration. Together, these results bring new insights into the mechanisms of T cell migration in 3D collagen and suggest that inhibiting the DDR1 kinase activity might be beneficial to inhibit T cell infiltration into inflammatory tissues in autoimmune and allergic diseases.

La réponse cellulaire aux stimuli extracellulaires est souvent médiée par des voies de signalisation qui agissent en aval des récepteurs transmembranaires, comme les récepteurs tyrosine kinases (RTK). Avec quatorze membres, la famille des récepteurs Eph représente la plus grande famille de RTK chez l'humain. Contrairement aux autres RTK, les ligands des récepteurs Eph, les éphrines, sont des protéines associées à la membrane cellulaire. La signalisation Eph-éprhines est donc principalement impliquée dans des événements de communication qui impliquent des contacts cellule-cellule comme la migration cellulaire, la répulsion et l'adhésion cellule-cellule. Ces événements sont cruciaux pour certains processus biologiques tels le guidage axonal et l'organisation tissulaire dans l'organisme en développement et chez l'adulte. Les récepteurs Eph sont fréquemment surexprimés ou dérégulés dans divers cancers, en particulier dans les plus agressifs et mortels. Récemment, la signalisation Eph-éphrines est devenue une nouvelle cible émergente pour le traitement du cancer. Bien que les fonctions biologiques des récepteurs Eph aient été largement étudiées, notre compréhension des mécanismes moléculaires grâce auxquels les récepteurs Eph régulent des phénotypes cellulaires précis demeure incomplète. Pour mieux comprendre le système de signalisation impliquant les Eph, mes travaux ont porté sur l'identification de nouvelles protéines effectrices en aval des récepteurs Eph et sur l'étude de leurs implications dans les fonctions régulées par les récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les complexes de signalisation associés aux récepteurs Eph dans des conditions natives, j'ai appliqué une approche basée sur la spectrométrie de masse (MS), le marquage de proximité BioID. Cela m'a permis de surmonter les limites de l'utilisation d'approches conventionnelles de purification par affinité pour cartographier les interactions protéine-protéine liées aux récepteurs transmembranaires. J'ai obtenu un réseau de signalisation dépendant des récepteurs EphA4, - B2, -B3 et -B4, qui comprend 395 protéines, dont la plupart n'avaient jamais été liées à la signalisation Eph-dépendante. Pour tester la pertinence biologique des partenaires identifiés, j'ai examiné la contribution de 17 candidats en utilisant une approche de perte de fonction dans une expérience de tri cellulaire dépendante des récepteurs Eph. J'ai pu montrer que la déplétion de quelques candidats, incluant la protéine Par3, bloque le tri des cellules. En utilisant la purification par affinité combinée à la MS, j'ai aussi identifié un complexe de signalisation impliquant la kinase C-terminal SRC (CSK), dont le recrutement aux complexes Par3 dépend des signaux des récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les interactions protéiques suivant la liaison Eph-éphrine, j'ai effectué des expériences de TurboID. Ces études m'ont permis d'identifier des complexes protéiques associés au récepteur EphA4 lorsqu'il est lié à l'éphrine-B2. J'ai également étudié les interactions protéine-protéine dépendantes de la liaison du récepteur EphB2 aux éphrines-B1 et -B2. Pour explorer si l'interaction d'EphB2 avec ces deux ligands peut mener à une réponse de signalisation inverse différente, j'ai identifié les partenaires de des ephrin-B1/-B2 lorsque stimulés par EphB2. Enfin, j'ai cartographié les réseaux de signalisation dépendants des récepteurs EphA4 et EphB2 sauvages ou kinase-inactifs, ce qui m'a permis de conclure que la perte de leur activité catalytique a conduit à des changements majeurs dans les interactomes dépendants de ces récepteurs. L'ensemble de mes résultats a permis de mieux définir les complexes protéiques dépendants des récepteurs Eph. Mes études ont mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux récepteurs Eph et de leur contribution dans le processus de délimitation des tissus, un processus souvent perturbé dans des maladies comme le cancer. / The cellular response to extracellular stimuli is often mediated by signaling pathways that act downstream of transmembrane receptors, such as receptor tyrosine kinases (RTKs). With fourteen members, the Eph family of RTKs is the largest in humans. In contrast to other RTKs, Eph receptor cognate ligands, ephrins, are tethered to the cell surface. This results in Eph receptor-ephrin signaling being mainly involved in short-range cell-cell communication events that regulate cell migration, repulsion and cell-cell adhesion. These events are crucial in biological processes such as axon guidance and tissue boundary formation in the developing and adult organisms. Eph receptors are frequently overexpressed or deregulated in a variety of human tumors, especially in the more aggressive and lethal ones. In recent years, the Eph-ephrin signaling system became an emerging new target for cancer treatment. Although a plethora of Eph receptor biological functions have been extensively studied, we still have a vague idea on the molecular mechanisms of Eph receptor signal transduction, underlying how Eph receptors regulate precise cellular phenotypes. To better understand the Eph receptor signaling system, my studies focused on the identification of novel Eph receptor downstream effector proteins and the determination of their requirement for Eph receptor-regulated functions. To unravel Eph receptor-associated signaling complexes under native conditions, I applied a mass spectrometry (MS)-based approach, namely BioID proximity labeling. This allowed me to overcome the limitations of conventional affinity purification approaches for mapping protein-protein interactions of transmembrane receptors. I obtained a composite signaling network from EphA4, -B2, -B3 and -B4 receptors that comprises 395 proteins, most of which not previously linked to Eph signaling. To test the biological relevance of the identified Eph receptor proximity interactors, I examined the contribution of 17 candidates using a loss-of-function approach in an Eph receptor-dependent cell sorting assay. I showed that depletion of a few candidates, including the signaling scaffold Par3, blocks Eph receptordependent cell sorting. Using affinity purification combined with MS, I further delineated a signaling complex involving C-terminal SRC kinase (CSK), whose recruitment to Par3 complexes is dependent on Eph receptor signals. To further elucidate Eph receptor-centric signaling complexes that are formed upon ephrin binding and are affected by Eph receptor catalytic activity I performed TurboID experiments. I systematically mapped ligand stimulation-dependent signaling networks downstream of EphA4 and EphB2 receptors. I dissected the impact of ephrin-B2 stimulation on the formation of EphA4- nucleated proximal protein complexes. Moreover, I showed the differential recruitment of EphB2 partners upon receptor binding to the same subclass of ligands, ephrin-B1 and ephrin-B2. To explore whether the EphB2 interactions with these two ephrin-B ligands elicit different reverse signaling responses, I delineated ephrin-B1/-B2 proximity partners recruited upon EphB2 stimulation. I also determined that the kinase domain of EphA4/-B2 plays a major role in determining the composition of signaling networks around the receptors, as a loss of catalytic activity led to a drastic decrease in a number of interactors with the receptors. Collectively, my definition of Eph receptor signaling networks sheds light on physiologically relevant Eph receptor-centered protein complexes that occur in living cells. These studies will lead to a better understanding of the mechanisms by which Eph receptors transmit signals at the membrane and give insight into how Eph receptor-mediated signaling pathways contribute to boundary formation, a process often disrupted in diseases like cancer.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie rare caractérisée par une obstruction progressive et un remodelage vasculaire des artères pulmonaires distales, conduisant à une pression artérielle pulmonaire moyenne supérieure à 20mmHg. L'augmentation de la pression aboutit à une dysfonction du ventricule droit et la mort. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement curatif pour l'HTAP. Il est donc primordial d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Comme dans le cancer, les cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire des patients atteints d'HTAP présentent un phénotype hyper-prolifératif et résistant à l'apoptose, entraînant un remodelage vasculaire pulmonaire. Ainsi, plusieurs stratégies thérapeutiques anti cancéreuses pourraient être utiles pour le traitement de l'HTAP. Compte tenu de l'expression altérée des récepteurs tyrosines kinases dans l'HTAP ainsi que dans le cancer, les inhibiteurs de tyrosine-kinases (ITK) ont été mise sur le marché pour le traitement de différents types de cancers et ont été envisagées dans le cadre de l'HTAP. Ainsi, l'ITK, Imatinib, a été capable de régresser l'HTAP induite dans des modèles expérimentaux, tandis que l'administration d'un autre inhibiteur, le Dasatinib, était associée au développement de l'HTAP. Récemment, plusieurs études observationnelles ont démontré le développement de l'HTAP chez des patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) présentant des réarrangements de la kinase lymphocytaire anaplasique (ALK) et qui ont reçu des ITK ALK/cMET, notamment Xalkori (R-Crizotinib), Ceritinib, Brigatinib et Lorlatinib. Étant donné que l'hypertension pulmonaire peut être associée à plusieurs maladies, y compris le cancer du poumon, la question demeure de savoir si le développement de l'HTAP chez les patients atteints d'un cancer du poumon recevant l'ITK ALK/c-MET représente un événement indésirable du médicament ou un résultat de la propagation de la maladie. Ainsi, l'objectif principal de chapitre 1 est de déterminer si le R-Crizotinib (connu sous le nom de Xalkori et qui est une première ligne de traitement des patients ayant un CPNPC-ALK positif) exacerbe l'HTAP et/ou prédispose à l'HTAP dans des modèles animaux. In vivo, le traitement par R-Crizotinib a entraîné une élévation marquée de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne associée à une augmentation de l'épaisseur de la paroi médiale des artères pulmonaires distales. De plus, R-Crizotinib, administré avant l'exposition à une faible dose de monocrotaline (MCT), induit une réponse hypertensive pulmonaire exagérée, comme en témoigne une augmentation de la pression systolique du ventricule droit et de la pression artérielle pulmonaire moyenne, de l'épaisseur de la paroi médiale et une diminution du débit cardiaque. In vitro, nous avons démontré que le traitement avec R-Crizotinib réduit la prolifération des cellules endothéliales contrôles de l'artère pulmonaire, effet associé à la formation de cellules multinucléées, ce qui est généralement observée dans les cellules qui meurent d'une une catastrophe mitotique. En conclusion, nous avons démontré que l'agent anticancéreux R-Crizotinib favorise le dysfonctionnement des cellules endothéliales, conduisant à la prédisposition et à l'exacerbation de l'HTAP dans des modèles animaux. Les dernières années de recherche ont approuvé l'importance des marques épigénétiques dans le développement de l'HTAP. En effet, nous nous sommes intéressés, dans le deuxième volet de la thèse, au facteur épigénétique « G9a », qui s'est révélé surexprimé dans différents types de cancers, favorisant la survie et la prolifération des cellules. Compte tenu de l'analogie cancer/HTAP, G9a fut un candidat idéal pour l'étude de son potentiel rôle dans le développement de l'HTAP. Ainsi, l'objectif principal du chapitre 2 est de déterminer si G9a est impliqué dans la progression et la pathogenèse de l'HTAP et de déterminer si son inhibition est bénéfique dans les modèles animaux. Nous avons démontré que G9a est surexprimé dans les artères pulmonaires de patients HTAP et dans les modèles expérimentaux. In vitro, l'inhibition pharmacologique de G9a à l'aide de BIX01294 diminue drastiquement la capacité d'hyper prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses HTAP. Grâce au séquençage d'ARN, nous avons démontré que l'inhibition de G9a s'accompagnait d'une altération du flux d'autophagie et d'une accumulation de lipides. Enfin, le traitement thérapeutique avec BIX01294 a réduit le remodelage vasculaire pulmonaire et la pression artérielle pulmonaire moyenne dans un modèle expérimentale de rat et a également amélioré l'hémodynamique pulmonaire et la fonction ventriculaire droite dans un autre modèle de souris. Ces résultats suggèrent que l'inhibition de G9a pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique dans l'HTAP. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare and fatal disease characterized by "a progressive loss and obstructive remodeling of pulmonary arteries (PAs) leading to a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) greater than 20mmHg. The persistent elevation of pulmonary pressures leads to right ventricular dysfunction and death. Currently, there is no cure for patients with PAH, which increases the need to develop new and effective therapeutic strategies. Pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) from PAH patients exhibit a "cancer-like" hyperproliferative and apoptosis-resistant phenotype leading to pulmonary vascular remodeling. Therefore, several anti-cancer therapies could be useful for the treatment of PAH. Given the altered expression of receptor tyrosine kinases and their ligands in PAH as well as in cancer, tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have been marketed for the treatment of different types of cancers and have been in the spotlight for anti-PAH drug research. Indeed, the tyrosine kinase inhibitor, Imatinib, was able to regress established PAH in experimental models, while the administration of another inhibitor, Dasatinib, was associated with the development of PAH. Recently, several observational studies have highlighted the development of PAH in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) with anaplastic lymphocyte kinase (ALK) rearrangements who received ALK/cMET TKIs, including Xalkori (R-crizotinib), Ceritinib, Brigatinib, and Lorlatinib. Since pulmonary hypertension can be associated with several diseases, including lung cancer, the question remains whether the development of PAH in lung cancer patients receiving cMET/ALK TKIs represents an adverse drug event or a result of disease spread. Thus, the main objective of Chapter 1 is to determine whether R-Crizotinib (known as Xalkori and which is the first-line treatment for patients with advanced ALK-positive NSCLC) exacerbates PAH and/or predisposes to PAH in experimental animal models. In vivo, R-Crizotinib treatment resulted in a marked elevation of the right ventricular systolic pressure (RVSP) and mPAP which was associated with an increased medial wall thickness of the distal PAs. Additionally, we found that pretreatment of rats with R-Crizotinib, induced an exaggerated pulmonary hypertensive response, as evidenced by the increased RVSP, mPAP, medial wall thickness, and decreased cardiac output. In vitro, we have demonstrated that treatment with R-Crizotinib reduces the proliferation of control pulmonary artery endothelial cells, which was accompanied by the appearance of multinucleated cells, a feature commonly seen in cells dying from mitotic catastrophe. In conclusion, we have demonstrated for the first time that the anticancer agent R-Crizotinib promotes endothelial cell dysfunction, leading to susceptibility and exacerbation of PAH in animal models. Previous studies have demonstrated the importance of epigenetic marks in the development and progression of PAH. Indeed, we were interested in the second part of the thesis, in the epigenetic factor "G9a", which was found to be overexpressed in different types of cancers, promoting cell survival and proliferation. Given the similarities between PAH and cancer, G9a was the ideal candidate to study in PAH. Thus, the main objective of Chapter 2 is to determine if G9a is involved in the progression and pathogenesis of PAH and to determine if its inhibition is beneficial in PAH animal models. We demonstrated that G9a is overexpressed in PAs of PAH patients and in experimental models. In vitro, we found that pharmacological inhibition of G9a using BIX01294 drastically reduces the PAH-PASMC proliferation and survival. Through RNA sequencing analysis, we demonstrated that G9a inhibition is accompanied by an impaired autophagy flux and lipid accumulation. Finally, therapeutic treatment with BIX01294 reduced pulmonary vascular remodeling as well as mPAP in an experimental rat model and also improved pulmonary hemodynamics and right ventricular function in another PAH mouse model. These results suggest that G9a inhibition could represent a new therapeutic approach in PAH.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus humain induit la mort cellulaire de façon sélective dans les cellules transformées lorsqu'elle est exprimée en dehors de son contexte viral. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont permis d'identifier une cible majeure de E4orf4, les tyrosine kinases de la famille Src. L'association de E4orf4 à la tyrosine kinase Src entraîne des perturbations au niveau du cytosquelette d'actine, ce qui mène à l'activation d'un sentier alternatif de mort cellulaire physiologique à partir du cytoplasme (activité toxique cytoplasmique). Les travaux présentés dans cette thèse démontrent que E4orf4 est phosphorylée sur résidus tyrosine et que sa phosphorylation est requise pour son activité toxique cytoplasmique. Quatre résidus tyrosine (Y) phosphorylés ont été identifiées : Y26, Y42, Y59 et Y60. La phosphorylation de la tyrosine 42 et possiblement des tyrosines 26 et 59 est modulée par l'activité des kinases de la famille Src. Le développement d'anticorps polyclonaux phospho-spécifiques a permis de confirmer que les tyrosines 42 et 60 sont phosphorylées in vivo, dans les conditions où E4orf4 induit la mort cellulaire. L'anticorps anti-phospho-Y42 reconnaît également des substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4. Certains de ces substrats ont été isolés par immunoprécipitation à l'aide de cet anticorps et ont été identifiés par spectrométrie de masse de type LC-MS/MS. De plus, E4orf4 phosphorylée, Src et les substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4 sont enrichis dans un compartiment vésiculaire juxtanucléaire à partir duquel le signal de mort semble initié. L'utilisation de mutants de E4orf4 montre que sa phosphorylation possède deux rôles majeurs. La phosphorylation de la tyrosine 42 potentialise l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 en stabilisant sa localisation cytoplasmique et membranaire et en favorisant sa phosphorylation sur d'autres sites. La tyrosine 26 et le site tyrosine 59/60 contribuent individuellement pour environ 50% de l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 et semblent permettre le recrutement de complexes signalétiques menant à l'induction de la mort cellulaire. Mes résultats suggèrent que la protéine adaptatrice Grb2, la tyrosine phosphatase Shp2, la kinase DNA-PK et l'ATPase p97-VCP s'associent à E4orf4. Le rôle potentiel de ces protéines dans l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 est discuté.

Les cellules s'acclimatent à leur environnement en décodant les signaux extracellulaires et en formant des complexes protéiques spécifiques afin d'entamer une réponse biologique adéquate. Par exemple, la liaison des récepteurs tyrosines kinases (RTK) à leurs ligands extracellulaires active de nombreuses voies de signalisation en créant des sites phosphotyrosines (pTyr) pouvant servir de points d'ancrage pour des protéines cytoplasmiques. Le recrutement de protéines adaptatrices, qui sont constituées uniquement de domaines modulaires médiant des interactions protéiques et qui ne contiennent aucune activité catalytique, au niveau de RTK activés favorise l'assemblage de complexes protéiques spécifiques. La formation de ces complexes permet le réarrangement des réseaux d'interactions protéine-protéine (IPP), ce qui est un processus essentiel pour l'homéostasie cellulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires permettant la régulation des fonctions des protéines adaptatrices restent peu caractérisés à ce jour. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons identifié une nouvelle boucle d'autorégulation négative existante entre des RTK et des protéines adaptatrices constituées de domaines d'homologie à SRC 3 (SH3). Cette famille de domaines cible des peptides riches en proline et est fréquemment retrouvée dans les protéines impliquées dans la transduction de signaux. Nous avons déterminé que le RTK EPHA4 phosphoryle directement une tyrosine située dans les poches de liaisons des trois domaines SH3 des protéines adaptatrices NCK1 et NCK2, ce qui inhibe leur capacité à interagir avec leurs partenaires protéiques. De plus, nous avons observé que ce résidu tyrosine est conservé à cette position dans plus de la moitié des 300 SH3 humains. Nos résultats suggèrent que plusieurs RTK pourraient phosphoryler des domaines SH3, et donc inhiber la transduction de signaux directement au niveau du récepteur activé à la membrane plasmique. Les modules SH3 représentent une des familles de domaines les plus répandus et médient une proportion importante des IPP des cellules eucaryotes. Les domaines modulaires ciblant des motifs peptidiques précis tels les SH3 possèdent leur propre structure tridimensionnelle qui est supposée être indépendante de leur protéine hôte. Ils sont donc généralement considérés comme étant des modules d'IPP autonome médiant des interactions via leur spécificité intrinsèque. C'est pourquoi de nombreux SH3 ont été étudiés in vitro, isolés de leur protéine hôte, au cours des deux dernières décennies. Cependant, nous ne savons pas si ces domaines sont nécessaires et suffisants pour dicter des IPP dans leur contexte protéique naturel in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons délété systématiquement les domaines SH3 de la levure Saccharomyces cerevisiae dans le but d'identifier les interactions SH3-dépendantes in vivo. Afin de déterminer si les SH3 sont suffisants pour médier des IPP dans des cellules vivantes, nous avons échangé le domaine SH3 de la protéine liant l'actine Abp1 par tous les autres SH3 de la levure ainsi que par ceux de ses orthologues humains. Ces expériences ont mis en évidence que les domaines SH3 dictent rarement des interactions indépendamment de leur protéine hôte. De plus, nous avons observé que les modules SH3 peuvent affecter les IPP de leur protéine hôte, possiblement via des interactions allostériques. Finalement, nous avons déterminé que même le positionnement de ces domaines est critique pour les IPP et les fonctions de leur protéine hôte, par exemple l'endocytose et la séparation de phases, chez la levure et l'humain. Nos travaux démontrent clairement l'importance du contexte protéique des domaines SH3 et que les fonctions de ceux-ci dépendent de leur protéine hôte. Ces résultats améliorent considérablement notre compréhension du fonctionnement des domaines SH3 dans des cellules saines et lors de pathologies. / Cells adapt to their environment by decoding extracellular signals and forming specific protein complexes to initiate the correct biological response. For example, the activation of receptor tyrosine kinases (RTKs) following binding to their extracellular ligands regulates numerous signaling pathways by creating phosphotyrosine (pTyr) sites that can serve as binding motifs for cytoplasmic proteins. The recruitment of adaptor proteins, consisting only of modular protein interaction domains and containing no catalytic activity, at activated RTKs promotes the assembly of specific protein complexes. The formation of these complexes allows the rearrangement of protein-protein interaction (PPI) networks, which is an essential process for homeostasis. However, the molecular mechanisms regulating the functions of adaptor proteins remain poorly characterized. We identified a negative autoregulatory loop existing between RTKs and adaptor proteins containing SRC homology 3 (SH3) domains. This family of modules targets proline-rich peptides and is enriched in proteins involved in signal transduction. We have determined that the RTK EPHA4 directly phosphorylates a tyrosine located in the binding pocket of the three SH3 domains of the adaptor proteins NCK1 and NCK2, and that this inhibits their ability to interact with their protein partners via SH3-dependent associations. In addition, we observed that this tyrosine residue is conserved at this position in more than half of the 300 human SH3s. Our results suggest that several RTKs may phosphorylate SH3 domains, and therefore inhibit signal transduction directly at the sites of activated receptors at the plasma membrane. SH3s modules represent one of the most widespread families of domains and mediate a significant proportion of all PPIs in eukaryotic cells. Modular domains targeting precise peptide motifs such as SH3s have their own three-dimensional structure, which is independent of their host protein. They are therefore generally considered to be autonomous PPI modules mediating interactions via a domain-intrinsic specificity. Based on this, many SH3s have been studied in vitro isolated from their host protein, over the past two decades. However, we still do not know whether these domains are necessary and sufficient to dictate PPIs in their natural protein context in vivo. To answer this question, we systematically deleted SH3 domains of the yeast Saccharomyces cerevisiae to identify SH3-dependent interactions in vivo. In order to determine whether SH3 domains are sufficient to mediate PPIs in living cells, we exchanged the SH3 domain of the actin-binding protein Abp1 with all the other yeast SH3s as well as those of its human orthologs. These experiments demonstrated that SH3 domains rarely dictate interactions independently of their host protein. In addition, we observed that SH3s can affect their host's PPIs according to the domain sequence, possibly via allosteric interactions. Ultimately, we determined that even the positioning of these domains is critical for the PPIs and the functions, for example endocytosis and phase separation, of their host protein in yeast and humans. Our work clearly demonstrates the importance of the protein context of SH3 domains and that their functions depend on their host protein. These results considerably improve our understanding of the functions of SH3 domains in normal cells and in the context of pathologies.