Bien que le risque de développer un carcinome augmente avec le vieillissement, la sénescence reste considérée comme un mécanisme suppresseur de tumeurs. Contrairement aux fibroblastes de derme, les kératinocytes primaires humains (NHEK) ne sont pas bloqués irréversiblement au plateau de sénescence in vitro. Une fraction de NHEK sénescents échappe à la mort et génère de nouvelles cellules néoplasiques. Le développement des cancers peut être stimulé par leur micro-environnement vieillissant pro-inflammatoire produit principalement par les fibroblastes sénescents. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser le sécrétome des fibroblastes sénescents de derme et d’en étudier l’impact sur l’émergence néoplasique des NHEK. Nous avons montré que les fibroblastes sénescents de derme produisent un sécrétome pro-inflammatoire : sécrétion de cytokines (MCP-1 ; IL-6), de facteurs de croissance (HGF/SF) et de métalloprotéases (MMP-1 ; -2…). Le conditionnement des cultures des NHEK par ce sécrétome des fibroblastes sénescents stimule la transition épithélium-mésenchyme et la migration des NHEK néoplasiques. Les MMP-1 et -2, sécrétées par les fibroblastes sénescents sont à l’origine des capacités migratoires de ces NHEK néoplasiques en activant leur récepteur à la thrombine PAR-1 (Proteases Activated Receptor), généralement associé aux stades tardifs. La caractérisation du sécrétome des fibroblastes sénescents par une analyse protéomique, montre aussi un défaut de sécrétion de plusieurs glycoprotéines de la matrice extracellulaire, aux propriétés anti-tumorales, provoqué par l’activation des voies de réponse au stress du réticulum endoplasmique associé à la sénescence. / While the risk to develop a carcinoma increased with aging, cellular senescence is consider as a potent barrier to tumorigenesis. Contrarily to the fibroblasts, senescence of normal human primary epidermal keratinocytes (NHEK) is not irreversible. Indeed, a fraction of NHEK spontaneously escapes from the senescence plateau and grows as neoplastic cells. Carcinoma development could be enhanced by the aging pro-inflammatory micro-environment produced principally by senescent fibroblasts. The aim of my thesis was to describe the characteristics of the secretome of senescent dermal human fibroblasts (NHDF) and then to determine whether it could enhanced early neoplastic step of keratinocytes. We showed that senescent NHDF produce a pro-inflammatory secretome with secretion of cytokines, growth factors and metalloproteinases (MMPs). Conditioning of keratinocytes by senescent NHDF secretome enhanced the early transformation of the neoplastic keratinocytes by promoting Epithelial-to-Mesenchymal Transition and migration ability. Particularly, MMP-1; -2 specifically secreted by senescent NHDF promote the early migratory capacity of these NHEK, by activating the protease-activated receptor-1 (thrombin receptor, PAR-1), up to now associated to more aggressive cancer. The characterization of senescent NHDF conditioned media by a proteomic analysis highlighted a loss of secretion of several extracellular matrix glycoproteins which have some important anti-tumoral proprieties. Finally, we demonstrated that the defective secretions of these glycoproteins by senescent NHDF are the result of a constitutive endoplasmic reticulum stress and activation of the Unfolded Response Pathway.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La capacité des cellules à migrer à distance de leur lieu de production est un élément clé du développement embryonnaire du cerveau. A l'âge adulte, dans le système nerveux central, la migration cellulaire est associée aux niches neurogéniques de la zone sous ventriculaire et du gyrus dentelé. Certaines conditions pathologiques ou lésions cérébrales peuvent créer un environnement pouvant attirer les précurseurs neuronaux en dehors de leurs voies habituelles de migration vers le site de lésion. Finalement, des déficits en migration durant le développement peuvent entrainer l'apparition de pathologies se traduisant par une organisation non conventionnelle des réseaux neuronaux pouvant conduire entre autres à l'apparition de troubles cognitifs ou de symptômes épileptiques. La migration des cellules est guidée par un ensemble complexe de signaux moléculaires, d'interactions physiques et de gradients électriques. C'est l'intégration de ces signaux au niveau intracellulaire qui coordonne la réponse migratoire de la cellule en modulant par exemple le cytosquelette, divers organites tels que les mitochondries ou des mécanismes tels que l'autophagie. Au cours des travaux présentés dans cette thèse, j'ai utilisé comme modèle d'étude la migration des neuroblastes dans le courant migratoire rostral, qui achemine les précurseurs neuronaux depuis la zone sous ventriculaire jusqu'au bulbe olfactif où ils intègrent les réseaux neuronaux existants. Dans le premier chapitre, je me suis intéressé à la contribution du mécanisme d'autophagie dans le contrôle de la migration cellulaire. Nous avons montré que l'autophagie est nécessaire au maintien d'une migration normale et que ce mécanisme est régulé temporellement et spatialement durant la migration. Son activation est liée au niveau énergétique intracellulaire et passe par l'activation d'AMPK, qui est le senseur d'énergie majeur de la cellule. Dans un deuxième temps, je me suis intéressé à l'impact sur la migration cellulaire de mutations des cadhérines Fat4 et Dchs1 qui entrainent chez l'humain un phénotype d'hétérotopie neuronale périventriculaire. Grâce à l'utilisation de greffes de cellules progénitrices issues de cellules humaines pluripotentes induites (dont l'acronyme anglais est iPSC) j'ai pu confirmer un défaut de migration des cellules présentant des mutations pour l'une ou l'autre de ces protéines. Pour finir nous avons aussi pu montrer que ce défaut de migration est accompagné d'une dysfonction dans le flux d'autophagie et une diminution du nombre de lysosomes disponibles. / The ability of cell to migrate away from their sites of production is a major process during embryonic and postnatal brains development allowing for a correct positioning of cells. During adulthood, in the central nervous system, cell migration is still present and, under physiological conditions, is associated with neurogenic niches of the subventricular zone and the dentate gyrus. Some pathologies or brain damaged could de-route migratory neurons away from their normal paths of migration to lesions sites. It should be also mentioned that during embryonic development, migration-associated disorders could lead to brain malformation resulting in cognitive disorder or epilepsy. Migratory behaviors of cells is determined by a complex mixture of extrinsic molecular cues, physical scaffold, or electrical gradient. The integration of these signals at the cellular level creates a coordinated response of intracellular elements like cytoskeleton, mitochondria, or autophagy. In this work, I studied the role of autophagy in neuronal migration under physiological and pathological conditions by using a migration of neuroblasts from the subventricular zone to the olfactory bulb along the rostral migratory stream as model system. In the first chapter of my thesis, I studied the contribution of autophagy in the control of cell migration under physiological conditions. We showed that autophagy is spatially and temporally regulated in migrating neuroblasts and maintains a normal rate of migratory event. This process is controlled by intracellular ATP/ADP level via the activation of AMPK In the second part of this work, I focused on mutation for paired cadherins Fat4 and Dchs1 leading to periventricular neuronal heterotopia phenotypes in humans. By grafting in the pups with NPCs derived from human iPSC with mutation form Fat4 or Dchs1, I showed default of migration in vivo of NPCs with these two mutations. We also showed that these cells exhibit altered autophagy flux associated with a decreased in lysosomal vesicles.

La migration des lymphocytes T dans les tissus interstitiels est régulée par la matrice extracellulaire dont le collagène type l est la composante majeure. Nous avons caractérisé l'expression chez les lymphocytes T d'un récepteur du collagène de la famille des récepteurs à domaine discoïdine (DDRl) et investigué son implication dans la migration. Nous avons démontré que l'activation des lymphocytes T primaires provenant du sang périphérique (PBL) par le récepteur des lymphocytes T induit l'expression de DDRl. Cette induction dépend de la voie des MAPK-Erk. L'activation des PBL augmente leur migration dans une matrice tridimensionnelle de collagène type l et cette augmentation est inhibée par l'addition de récepteurs bloquants DDRI-FC. Nous avons également observé que l'adhésion des PBL au collagène type l augmente en présence de DDRI-FC. Le récepteur DDRI serait donc impliqué dans la migration des PBL activés possiblement grâce à sa capacité de modérer l'adhésion au collagène type 1.

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / L'imagerie cérébrale englobe un éventail de techniques qui permettent la collecte de données neurobiologiques abondantes présentant de l'hétérogénéité dans leur composition chimique. Pour analyser et décrire leur complexité, de nombreuses mesures morphométriques sont extraites afin de caractériser les événements observés. Cependant, sur la base de ces caractéristiques morphométriques, les données semblent souvent homogènes lors de l'analyse. Pour saisir et comprendre la diversité de ces phénomènes biologiques, nous avons choisi d'utiliser des méthodes computationnelles, notamment la réduction de dimension des données et le regroupement. Dans cette thèse, nous présenterons deux exemples d'application. La première partie est consacrée à l'étude de l'hétérogénéité des cellules en migration dans le cerveau en fonction de leur dynamique migratoire. La migration cellulaire est un phénomène important dans le développement du cerveau, notamment dans le cadre des troubles neurodéveloppementaux. Les précurseurs neuronaux, appelés neuroblastes, changent de formes lors de leur migration. Il existe deux phases pour ce processus, une phase stationnaire et une phase migratoire. L'objectif de cette étude est de déterminer si ces populations de neuroblastes peuvent être séparées sur la base de leurs propriétés migratoires mais également d'utiliser des méthodes d'analyses statistiques pour trouver les différentes sous-populations afin de déterminer lesquelles sont communes. Enfin, nous avons étudié les propriétés migratoires de ces différentes populations des neuroblastes en venant perturber la migration à l'aide de modifications génétique ou environnementale. La seconde partie porte sur l'étude de la plasticité structurelle, qui fait référence à la capacité qu'ont deux neurones à former une connexion, appelée synapse, qui peut se renforcer ou s'affaiblir. Ces changements synaptiques sont essentiels pour les processus d'apprentissage et de mémoire. En examinant des images de dendrites du bulbe olfactif prises avec un microscope confocal, on observe des protrusions sur la surface de la dendrite qui servent à recevoir les entrées synaptiques. Pour analyser ces images, nous avons développé un pipeline computationnel destiné à prétraiter les images et extraire les épines dendritiques. À la suite de la reconstruction 3D de la dendrite, nous avons extrait les épines et calculé plusieurs métriques, telles que la longueur et la surface de l'épine, des indicateurs couramment utilisés dans l'analyse des épines dendritiques. En procédant à une réduction de la dimensionnalité du jeu de données et à son partitionnement, nous avons relié la morphologie de chacune de ces sous-populations à leurs propriétés structurelles. Enfin, nous avons comparé le groupe contrôle et le groupe expérimental dans le cas de trois expériences olfactives, deux tâches de renforcement, et une de déprivation, qui ont conduit à des changements de plasticité. Les résultats montrent que la morphologie des épines ou leurs densités sont affectées par ces différentes conditions. En résumé, nous avons développé des outils computationnels permettant de révéler l'hétérogénéité des neurones en développement en fonction de leur dynamique migratoire et de leurs propriétés structurelles. / Brain imaging encompasses a range of techniques that enable the collection of abundant neurobiological data that presents heterogeneity in their chemical composition. To analyse and describe their complexity, numerous morphometric metrics are extracted to characterise the observed events. However, based on these morphometric features, the data often appear homogeneous during analysis. To grasp and understand the diversity of these biological phenomena, we have chosen to use computational methods including dimension reduction of data and clustering. In this thesis, we will present two application examples. The first part is devoted to the study of the heterogeneity of migrating neuronal cells based on their migratory dynamics. Cell migration is an important phenomenon in brain development, particularly in the context of neurodevelopmental disorders. Neuronal precursors, called neuroblasts, change shape during their migration. There are two phases for this process, so-called stationary phase and a migratory phase. The aim of this study is to determine whether neuroblasts can be separated to different sub-populations based on their migratory properties and to use statistical analysis methods to find the different subpopulations and determine which ones are common. Finally, we have studied the migratory properties of these different neuroblast populations by disrupting migration using genetic or environmental modifications. The second part focuses on the study of synaptic plasticity, which refers to the capacity of two neurons to form a connection, called a synapse, which can strengthen or weaken. These changes are central to the synaptic remodelling that occurs during the learning and memory phase. From images of dendrites, taken with a confocal microscope in the olfactory bulb, we have set up a computational pipeline to perform image pre-processing and then extract dendritic spines, which are protrusions on the surface of the dendrite that serve to receive synaptic inputs. After 3D reconstruction of the dendrite, these spines are extracted, and several metrics are calculated, including the length and surface area of the spine, which are standard metrics in spine analysis. After dimension reduction of the dataset and clustering, we have linked the morphology of each of these subpopulations to their structural properties. Finally, we have compared the control group and the experimental group in the case of three experiments that led to plasticity changes. The results show that the morphology of spines or their densities are affected by these different conditions. In summary, we have developed computational tools that reveal the heterogeneity of developing neurons based on their migratory dynamics and structural properties.

La base moléculaire de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) est encore peu comprise. Lors d’une étude antérieure, nous avons déterminé PRDM6 comme gène potentiellement hypométhylé dans les tumeurs de cancer ovarien de haut stade et grade comparés à des tissus normaux. L’hypométhylation n’a pas pu être confirmée, mais la surexpression de ce gène dans les tumeurs de COE laisse croire que PRDM6 peut avoir une implication dans ce cancer. L’expression de PRDM6 fut diminuée dans la lignée COE SKOV3 par la technique de l’interférence à l’ARN et des études fonctionnelles furent effectuées. La diminution de l’expression de PRDM6 entraine la diminution significative de la migration, l’invasion et la formation de colonie qui sont des facteurs nécessaires à la carcinogénèse. De plus, une analyse de l’expression génique a permis de confirmer la sousexpression de gènes associés au développement du cancer dans les lignées dont l’expression de PRDM6 est diminuée. / The molecular base of the progression of epithelial ovarian cancer (EOC) is still poorly understood. In a previous study, we identified the gene PRDM6 as potentially hypomethylated in high grade and stage EOC tumors compared to normal tissue. The hypomethylation could not be confirmed, but the overexpression of this gene in EOC tumors suggests that PRDM6 might have some implications in this type of cancer. Using RNA interference, PRDM6 expression was decreased in the EOC cell line SKOV3 and functional studies were performed. Decreased expression of PRDM6 induced a significant decrease in migration, invasion and colony formation factors that are necessary for carcinogenesis. In addition, an analysis of gene expression confirmed the underexpression of genes associated with the development of cancer in cell lines whose PRDM6 expression was decreased.

Titre de l'écran-titre (visionné le 18 avril 2023) / La migration des lymphocytes T à travers la matrice extracellulaire (MEC) du tissu interstitiel est essentielle au développement de la réponse immunitaire adaptative. Pour atteindre les sites inflammatoires, les lymphocytes T doivent traverser la barrière endothéliale, et ce, suivant le mode de migration bidimensionnel (2D) qui implique les intégrines. De plus, ils doivent traverser la MEC du tissu interstitiel, formée majoritairement de collagène, et ce, suivant le mode tridimensionnel (3D). Nous et d'autres avons montré que la migration des lymphocytes Th17 à travers le collagène 3D implique le récepteur à activité tyrosine kinase nommé récepteur de domaine discoïdine 1 (DDR1). Ainsi, leur migration dépend de la voie MAPK/ERK induite par l'activité enzymatique de DDR1. Ici, nous rapportons que les cellules Th1 et Th2 expriment des niveaux comparables de DDR1 à ceux des cellules Th17 et que leur migration à travers le collagène est dépendante de DDR1. Cependant, l'adhésion des cellules auxiliaires (Th) au collagène est indépendante de DDR1, conformément au mouvement amiboïde des cellules T dans les modèles de matrice 3D. Sur un autre plan, il est connu que DDR1 peut induire deux voies de signalisation, la voie canonique dépendante de son activité enzymatique et la voie non canonique indépendante de celle-ci. Nos résultats montrent que l'activité enzymatique de DDR1 est essentielle à la migration des lymphocytes Th. En effet, l'inhibition de son activité enzymatique par le 7rh et par la construction DDR1 kinase-dead ont fortement réduit la migration des cellules Th. De plus, nous avons montré que la voie canonique MAPK/ERK est essentielle à leur migration. En somme, ces résultats fournissent de nouvelles connaissances sur les mécanismes de migration des lymphocytes T. Enfin, l'activité enzymatique de DDR1 pourrait être une cible thérapeutique afin d'inhiber l'infiltration des lymphocytes T dans les sites inflammatoires observés dans les maladies auto-immunes et allergiques. / T cell migration across tissue extracellular matrix (ECM) is a critical step in the development of adaptive immune response. To reach their target sites, T cells have to pass through two main barriers. One is the endothelial barrier and the second one is the interstitial matrix. Passing through the endothelial barrier follows the rules of two-dimensional (2D) mode of migration that has been studied in detail and involves integrin receptors. However, there are less studies regarding T cell migration through the interstitial matrix, which follows the rules of three-dimensional (3D) mode of migration. We and others previously showed that T cell migration across the 3D collagen that is the main component of the interstitial matrix involves the non-integrin collagen tyrosine kinase receptor named discoidin domain receptor 1 (DDR1). Previously, our group has reported that human Th17 cells migrate in 3D collagen via DDR1-mediated activation of the MAPK/ERK pathway. Herein, we report that human Th1 and Th2 effector cells express comparable levels of DDR1 as Th17 cells and also migrate in 3D collagen in a DDR1- dependent manner. DDR1 does not promote adhesion of Th effector cells to collagen consistent with the amoeboid movement of T cells in 3D matrix models. Furthermore, DDR1 could trigger its downstream signaling pathway either with or without using its tyrosine kinase domain, which is called canonical and non canonical signaling pathways, respectively. Therefore, we evaluated if this effect of DDR1 in promoting T cells 3D migration is mediated via DDR1 canonical pathway or non canonical pathway. Our results showed that the DDR1 tyrosine kinase activity was required for T cell migration. Indeed the specific DDR1 kinase inhibitor 7rh and the DDR1 kinase-dead construct strongly reduced the migration in 3D collagen of Th1, Th2 and Th17 cells. Finally, we showed that the DDR1 kinase activity was required for collagen-mediated MAPK/ERK activation, which is essential for T cell migration. Together, these results bring new insights into the mechanisms of T cell migration in 3D collagen and suggest that inhibiting the DDR1 kinase activity might be beneficial to inhibit T cell infiltration into inflammatory tissues in autoimmune and allergic diseases.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / Src régule le remodelage du cytosquelette d’actine et les propriétés invasives des cellules. Une régulation spatio-temporelle du transport endosomal polarisé est nécessaire pour ces fonctions et le rétromère, un substrat de Src, est un élément crucial de ce trafic. Nous avons postulé que le rétromère pourrait moduler le transport requis pour le remodelage cellulaire et la migration induits par Src. Nous montrons qu’une perte de fonction du rétromère dans des cellules épithéliales exprimant v-Src mène à la formation d’invadosomes désorganisés et anormalement stables, mais toujours aptes à dégrader la matrice extracellulaire. Dans un modèle de cellules cancéreuses, une perte de fonction du rétromère diminue la migration en affectant la polarisation et la directionalité des cellules, mais augmente la migration trans-endothéliale. Nos résultats suggèrent un rôle pour le rétromère en aval de Src dans le remodelage de l’actine, la polarité, la migration cellulaire et l’invasion, possiblement par la phosphorylation du rétromère. / Src-family kinases (Src) modulate actin cytoskeleton remodeling and tumor cell invasive properties. Directional endosomal trafficking needs to be regulated in time and space to support these processes, but little is known on the mechanisms involved. The retromer, a Src kinase target, is emerging as a key player of endosomal recycling. We postulated that the retromer could modulate the polarized trafficking of endosomes required to support Src-induced cell remodeling and migration. We show that retromer loss of function caused the assembly of disorganized, more stable invadosomes in epithelial cells expressing v-Src, which were nevertheless able to degrade extracellular matrix. In a cancer cell model, inhibition of retromer function reduced cell migration by affecting polarization and directionality of cells, but promoted transendothelial cancer cell migration. The results thus suggest the existence of a phosphorylation-regulated function for the retromer downstream of Src in actin remodeling, cell polarity, cell migration and invasion.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel et l’exposition solaire est le facteur étiologique ayant la plus grande incidence sur son initiation. Cependant, l’influence des rayons UV sur la progression du mélanome primaire vers un état métastatique reste inconnue. Notre hypothèse est que les rayons UV peuvent, en plus d’initier la tumeur, stimuler la progression de la maladie vers un état métastatique. L’objectif de cette étude était donc de déterminer les conditions d’irradiation à utiliser, puis d’évaluer les effets directs et indirects des rayons UV sur la migration du mélanome. Les lignées A375, WM983a et SK-MEL-28 ont été cultivés sous forme de sphéroïdes et traitées chroniquement aux rayons UV directement ou indirectement. Puis, leur migration a été évaluée dans deux modèles 3D, soit en gel de collagène I ou en chambre de Boyd en inversée. L’exposition directe des sphéroïdes était constituée de5 minutes d’irradiation (570J/m2) au simulateur solaire tous les 12h pendant 7 jours. Aucune différence significative de migration des cellules cancéreuses n’a pu être observée dans cette condition. Pour l’exposition indirecte, les sphéroïdes ont été mis en contact avec un milieu de culture de kératinocytes immortalisés (HaCaT)ayant été préalablement irradiés de façon chronique aux UVB avec une dose de 75J/m2 tous les 12h pour un total de quinze irradiations (CLUV). Une augmentation significative de la migration des cellules cancéreuses dans le milieu CLUV a été observée pour les sphéroïdes de WM983a et SK-MEL-28. Le profilage des cytokines présentes dans le milieu CLUV a révélé un enrichissement de nombreuses cytokines tel que PDGFaa. En conclusion, le milieu CLUV augmente le potentiel de migration des trois lignées de mélanome primaire. Ainsi, l’exposition chronique aux rayons UV pourrait donc indirectement induire un plus grand pouvoir métastatique via notamment l’action de cytokines surexprimées.

La migration des cellules endothéliales est une des étapes nécessaires à l'angiogenèse physiologique et tumorale. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la kinase de stress SAPK2/p38 via le récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR-2. Nous avons étudié les événements moléculaires suivant l'activation du récepteur du VEGF et menant à l'activation de la voie SAPK2/p38 dans les cellules endothéliales. La tyrosine 1214 en C-terminal du VEGFR-2 est un site majeur d'autophosphorylation nécessaire à l'activation de SAPK2/p38 par le VEGF dans les cellules endothéliales. Le résidu phospho-tyrosine 1214 permet le recrutement de la protéine adaptatrice Nck via son domaine SH2. De plus, l'activation de Fyn, une kinase de la famille Src, mais non c-Src même, dépend de la phosphorylation de la tyrosine 1214. L'utilisation d'un dominant négatif de Fyn empêche l'activation de SAPK2/p38, inhibe la formation de fibres de tension et abolit la migration endothéliale. Nck et Fyn s'associent en réponse au VEGF et l'activité de Fyn est nécessaire à la phosphorylation sur tyrosine de Nck et de la kinase PAK-2. La formation de fibres de tension nécessite aussi l'activation de la petite GTPase Cdc42, ce qui permet d'acheminer le signal du VEGF vers SAPK2/p38, sa cible physiologique MAPKAP K2, puis vers l'actine. Ces résultats suggèrent une séquence d'étapes moléculaires précoces suivant l'activation du VEGFR-2 et régulant la dynamique d'actine nécessaire à la migration endothéliale. 11 s'agit de la première description d'une séquence d'événements couplant l'activation d'un récepteur à activité tyrosine kinase à celle d'une kinase de stress. Par ailleurs, l'identification du rôle du site tyrosine 1214 du VEGFR-2 en fait une cible précise pour le développement d'une drogue anti-angiogénique. / Endothelial cell migration is one major step of physiological and pathological angiogenesis. The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent regulator of angiogenesis and induces actin reorganization into stess fibers and cell migration via activation of SAPK2/p38 downstream of the tyrosine kinase receptor VEGFR-2. We studied the molecular events following the activation of the VEGF-receptor that lead to the activation of the SAPK2/p38 pathway in endothelial cells. The tyrosine 1214 residue in C-terminal of the VEGFR-2 is a major autophosphorylation site that is required for the activation of SAPK2/p38 by VEGF in endothelial cells. The adaptor protein Nck is recruited to the phospho-tyrosine 1214 residue via its SH2 domain. Moreover, the activation of the Src-family kinase Fyn, but not c-Src itself, depends on phospho-tyrosine 1214. A dominant negative form of Fyn inhibits SAPK2/p38 activation, stress fibers formation and endothelial cell migration. Nck and Fyn associate in response to VEGF and Fyn activity is required for the tyrosine-phosphorylation of Nck and PAK-2. The activation of the small Rho GTPase Cdc42 downstream of tyrosine 1214 is also required for the activation of SAPK2/p38, its physiological target MAPKAP K2, and stress fiber formation. Altogether, these results suggest a sequence of early molecular steps following VEGFR-2 activation by VEGF that regulate the actin dynamics required for endothelial cell migration. This is the first description of a sequence of events that couple the activation of a tyrosine kinase receptor to that of a stress-activated kinase. The identification of the role of the tyrosine 1214 residue on VEGFR-2 makes it an appealing target for the development of an anti-angiogenic therapy.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.