Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2015-2016 / Src régule le remodelage du cytosquelette d’actine et les propriétés invasives des cellules. Une régulation spatio-temporelle du transport endosomal polarisé est nécessaire pour ces fonctions et le rétromère, un substrat de Src, est un élément crucial de ce trafic. Nous avons postulé que le rétromère pourrait moduler le transport requis pour le remodelage cellulaire et la migration induits par Src. Nous montrons qu’une perte de fonction du rétromère dans des cellules épithéliales exprimant v-Src mène à la formation d’invadosomes désorganisés et anormalement stables, mais toujours aptes à dégrader la matrice extracellulaire. Dans un modèle de cellules cancéreuses, une perte de fonction du rétromère diminue la migration en affectant la polarisation et la directionalité des cellules, mais augmente la migration trans-endothéliale. Nos résultats suggèrent un rôle pour le rétromère en aval de Src dans le remodelage de l’actine, la polarité, la migration cellulaire et l’invasion, possiblement par la phosphorylation du rétromère. / Src-family kinases (Src) modulate actin cytoskeleton remodeling and tumor cell invasive properties. Directional endosomal trafficking needs to be regulated in time and space to support these processes, but little is known on the mechanisms involved. The retromer, a Src kinase target, is emerging as a key player of endosomal recycling. We postulated that the retromer could modulate the polarized trafficking of endosomes required to support Src-induced cell remodeling and migration. We show that retromer loss of function caused the assembly of disorganized, more stable invadosomes in epithelial cells expressing v-Src, which were nevertheless able to degrade extracellular matrix. In a cancer cell model, inhibition of retromer function reduced cell migration by affecting polarization and directionality of cells, but promoted transendothelial cancer cell migration. The results thus suggest the existence of a phosphorylation-regulated function for the retromer downstream of Src in actin remodeling, cell polarity, cell migration and invasion.

La résistance à l'insuline associée à l'obésité est une condition qui favorise les troubles métaboliques tels que le diabète de type 2 (T2D) et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD). Des altérations de l'homéostasie des lipides et du glucose, ainsi qu'une inflammation chronique de bas grade sont les caractéristiques du T2D et de la NAFLD. SHP-1 (codé par le gène *PTPN6*) est une tyrosine phosphatase avec deux domaines SH2 et est connu pour agir comme modulateur du métabolisme du glucose et des lipides. SHP-1 régule également la signalisation des cytokines et l'expression des gènes inflammatoires. En plus d'être localisé dans le cytoplasme, SHP-1 se trouve également dans le noyau des cellules épithéliales. La fonction de ce SHP-1 nucléaire reste inconnue. Ici, nous avons étudié les fonctions dépendantes et indépendantes de la tyrosine phosphatase de SHP-1 dans le contrôle des voies métaboliques. Des découvertes antérieures de notre laboratoire ont établi un lien entre SHP-1 et l'activité du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ2 (PPARγ2). PPARγ2 est un facteur de transcription activé par des ligands et contrôle le métabolisme des lipides. Dans le chapitre II, nous avons constaté que SHP-1 interagit avec PPARγ2 principalement via son domaine SH2 en N-terminal et peut déphosphoryler PPARγ2 *in vitro*. Nos données suggèrent que PPARγ2 est phosphorylé sur le résidu tyrosine 78 (Y78) et que la déphosphorylation catalysée par SHP-1 est associée à la stabilité de PPARγ2. L'invalidation génétique de SHP-1 dans des cellules exprimant PPARγ2 augmente l'expression des cibles transcriptionnelles de PPARγ2 telles que *FABP4* et *CD36* en plus d'augmenter l'adipogenèse. Ces effets étaient atténués dans des cellules exprimant une forme mutée de PPARγ2 où la tyrosine 78 avait été remplacée par une phénylalanine ne pouvant être phosphorylée (Y78F). Collectivement, ces résultats indiquent que l'activité phosphatase de SHP-1 contrôle la stabilité de PPARγ2 et donc affecte l'adipogenèse. SHP-1 est un modulateur de la signalisation de l'insuline. L'invalidation génétique de SHP-1 spécifiquement dans les hépatocytes chez la souris (SHP-1 KO) est associée à une glycémie à jeun plus basse que celle de leurs congénères non transgéniques. Les souris SHP-1 KO présentaient également une diminution importante de la production hépatique de glucose, suggérant donc l'existence d'une autre fonction de SHP-1 sur l'homéostasie du glucose, possiblement indépendante de l'insuline. Dans le chapitre III, nous avons découvert que SHP-1 agit comme coactivateur pour contrôler la transcription du gène phosphoénolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) et donc régule la gluconéogenèse. SHP-1 est recruté à la région régulatrice du gène *PCK1*, le cite potentiel où il interagit avec l'ARN polymérase II (RNAPII). Le recrutement de SHP-1 à la chromatine est dépendant du facteur de transcription transducteur de signal et activateur de transcription 5 (STAT5). L'épuisement de STAT5 ainsi que SHP-1 résulte en une diminution du niveau de transcrit de *PCK1* et une réduction de la gluconéogenèse. Ensemble, ces résultats indiquent que nous avons découvert une nouvelle fonction de SHP-1 où la phosphatase agit comme un co-régulateur transcriptionnel clef du gène *PCK1* et exerce un contrôle sur la gluconéogenèse. / Insulin resistance coupled with obesity is a condition that promotes metabolic disorders such as type 2 diabetes (T2D) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Alterations in lipid and glucose homeostasis, as well as low-grade chronic inflammation are the hallmarks of T2D and NAFLD. SHP-1 (encoded by the gene Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 6, *PTPN6*) is a tyrosine phosphatase with two SH2 domains and is known to act as a modulator of glucose and lipid metabolism. In addition, SHP-1 also regulates cytokine signaling and inflammatory gene expression. Besides being localized in the cytoplasm, SHP-1 is also found in the nucleus of epithelial cells. The function of this nuclear SHP-1 remains elusive. Here, we investigated tyrosine phosphatase dependent and independent functions of SHP-1 in controlling metabolic pathways. Previous findings from our laboratory established a link between SHP-1 and peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) activity. PPARγ2 is a ligand-activated transcription factor that controls lipid metabolism. In chapter II, we found that SHP-1 interacts with PPARγ2 mainly via its N-terminal SH2 domain and can dephosphorylate PPARγ2 *in vitro*. Our data suggest that PPARγ2 is tyrosine phosphorylated mainly on tyrosine residue 78 (Y78) and SHP-1-mediated dephosphorylation of PPARγ2 is associated with its stability. The knockdown of SHP-1 in PPARγ2 expressing cells resulted in enhanced expression of the classical PPARγ2 targets *FABP4* and *CD36* coupled with increased adipogenesis. These effects were blunted in cells expressing mutant PPARγ2 where tyrosine 78 has been replaced with the non-phosphorylatable phenylalanine (Y78F). Collectively, phosphatase activity of SHP-1 controls the stability of PPARγ2 thereby affecting lipid metabolism. SHP-1 is a modulator of insulin signaling. Hepatocyte-specific SHP-1 KO mice compared to their wild type control littermates exhibited lower fasting glucose and markedly decreased hepatic glucose production suggesting the existence of an additional insulin-independent effect of SHP-1 on glucose homeostasis. In Chapter III, we found that SHP-1 acts as a co-activator for controlling the transcription of the phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (*PCK1*) gene thereby regulating gluconeogenesis. SHP-1 is recruited to the regulatory region of the *PCK1* gene, the potential site where it interacts with RNA polymerase II (RNAPII). The recruitment of SHP-1 to the chromatin was mediated by the transcription factor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5). Depletion of STAT5 as well as SHP-1 resulted in a decrease in *PCK1* transcript levels and blunted gluconeogenesis. Taken together, we discovered a novel function of SHP-1 whereby it acts as a key transcriptional co-regulator of the *PCK1* gene and exerts control over gluconeogenesis. Collectively, findings from these studies provide novel functions of SHP-1 in controlling lipid and glucose metabolism.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. [162]-185. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

À mon arrivée dans le laboratoire, les travaux réalisés indiquaient que le trafic des endosomes de recyclage (ERs) vers le Golgi était régulé par les kinases de la famille Src (KFS) et contribuait au remodelage de l’actine induit par différents stress (E4orf4, staurosporine). Or les KFS coordonnent la dynamique de l’actine et le trafic membranaire, mais les mécanismes impliqués demeurent peu caractérisés. Des évidences récentes indiquaient aussi que le trafic endosomal contribuait à la transformation cellulaire induite par des formes oncogéniques des KFS, laquelle est associée à l’assemblage de structures invasives riches en actine (podosomes). En se basant sur ces données, notre hypothèse de recherche était que le transport des ERs vers le Golgi sous le contrôle du rétromère, un régulateur majeur des voies de transport rétrograde, pourrait contribuer à la formation des podosomes lors de la transformation cellulaire induite par v-Src. Les objectifs du travail présenté dans ce mémoire étaient de caractériser les changements précoces dans le trafic endosomal dépendant du rétromère suivant l’activation de v-Src et d’adresser leur contribution dans la formation des podosomes. Mes travaux ont tiré profit de l’utilisation d’un modèle permettant l’activation rapide d’un mutant thermosensible de v-Src dans des cellules épithéliales MDCK. J’ai ainsi pu observer dans ce modèle une polarisation précoce des ERs autour des podosomes en formation. Une augmentation dans le nombre et la morphologie des endosomes rétromère-dépendants (Vps26) a été mesurée et coïncidait avec un transport accru de cargos dépendants du rétromère vers le Golgi. Notamment, l’inhibition de Rab7, un régulateur du rétromère, interfère avec la formation des endosomes Vps26-positifs et des podosomes. En conclusion, mes résultats suggèrent que v-Src active les voies de transport dépendantes du rétromère pour mobiliser des protéines de signalisation et/ou des lipides bioactifs nécessaires au remodelage polarisé de l’actine et à la formation des structures invasives.

Le spermatozoïde, afin d'être en mesure de féconder l'ovule, doit subir une série de modifications membranaires et biochimiques, regroupées sous le terme capacitation. De ces modifications, une augmentation de la phosphorylation en tyrosine de certaines protéines spermatiques spécifiques ainsi qu'une augmentation du Ca²⁺ intracellulaire sont observées. Il a été démontré que la phosphorylation sur résidu tyrosine associée à la capacitation des spermatozoïdes est sous le contrôle étroit du Ca²⁺, de la voie AMPc/PKA et des dérivés actifs de l'oxygène. De plus, il a été montré que la libération des réservoirs de Ca²⁺ par la thapsigargine, un inhibiteur spécifique des Ca²⁺ -ATPase du réticulum endoplasmique et sarcoplasmique (SERCA), pouvait provoquer l'augmentation de la phosphorylation en tyrosine et ce, dépendante des tyrosines kinases de la famille de src. Tous ces éléments suggèrent qu' il y a une Ca²⁺-ATPase sensible à la thapsigargine présente dans les spermatozoïdes permettant l'accumulation de Ca²⁺ dans les réservoirs et qu'au moins un membre de la famille de src dont l'activité est Ca²⁺ -dépendante est présente dans les spermatozoïdes. Dans un premier temps, j'ai identifié la Ca²⁺-ATPase SERCA2. C'est la première étude qui démontre que ce type de Ca²⁺ -ATPase est présente dans les spermatozoïdes de mammifères. La présence de SERCA2 au niveau de l'acrosome dans les spermatozoïdes humains, murins et bovins, suggère que cette Ca2+ -ATPase puisse contrôler la [Ca2+]i en accumulant le Ca²⁺ au niveau de l'acrosome. Puisque src est modulée positivement par le Ca²⁺, j'ai vérifié sa présence et son rôle dans les spermatozoïdes humains. Dans cette étude, j'ai clairement démontré que l'activité de src est Ca²⁺ dépendante et modulée positivement par la voie AMPc/PKA. De plus, la kinase src semble active tout au long de la capacitation et pourrait donc contribuer à l'augmentation de la phosphorylation associée à la capacitation. Enfin, j'ai tenté d' identifier des substrats de src par deux approches différentes. L'identification de ces protéines permettra de mieux comprendre le rôle de cette tyrosine kinase dans les fonctions Ca²⁺ -dépendantes du spermatozoïde.

Src family kinases (SFKs) are key regulators of cell proliferation, differentiation, and survival. The expression of these non-receptor tyrosine kinases is strongly correlated with cancer development and tumor progression. Thus, this family of proteins serves as an attractive drug target. The activation of SFKs can occur via multiple signaling pathways, yet many of them are poorly understood. Here, we summarize the current knowledge on G protein-coupled receptor (GPCR)- mediated regulation of SFKs, which is of considerable interest because GPCRs are among the most widely used pharmaceutical targets. This type of activation can occur through a direct interaction between the two proteins or be allosterically regulated by arrestins and G proteins. We postulate that a rearrangement of binding motifs within the active conformation of arrestin-3 mediates Src regulation by comparison of available crystal structures. Therefore, we hypothesize a potentially different activation mechanism compared to arrestin-2. Furthermore, we discuss the probable direct regulation of SFK by GPCRs and investigate the intracellular domains of exemplary GPCRs with conserved polyproline binding motifs that might serve as scaffolding domains to allow such a direct interaction. Large intracellular domains in GPCRs are often understudied and, in general, not much is known of their contribution to different signaling pathways. The suggested direct interaction between a GPCR and a SFK could allow for a potential immediate allosteric regulation of SFKs by GPCRs and thereby unravel a novel mechanism of SFK signaling. This overview will help to identify new GPCR–SFK interactions, which could serve to explain biological functions or be used to modulate downstream effectors.