La base moléculaire de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) est encore peu comprise. Lors d’une étude antérieure, nous avons déterminé PRDM6 comme gène potentiellement hypométhylé dans les tumeurs de cancer ovarien de haut stade et grade comparés à des tissus normaux. L’hypométhylation n’a pas pu être confirmée, mais la surexpression de ce gène dans les tumeurs de COE laisse croire que PRDM6 peut avoir une implication dans ce cancer. L’expression de PRDM6 fut diminuée dans la lignée COE SKOV3 par la technique de l’interférence à l’ARN et des études fonctionnelles furent effectuées. La diminution de l’expression de PRDM6 entraine la diminution significative de la migration, l’invasion et la formation de colonie qui sont des facteurs nécessaires à la carcinogénèse. De plus, une analyse de l’expression génique a permis de confirmer la sousexpression de gènes associés au développement du cancer dans les lignées dont l’expression de PRDM6 est diminuée. / The molecular base of the progression of epithelial ovarian cancer (EOC) is still poorly understood. In a previous study, we identified the gene PRDM6 as potentially hypomethylated in high grade and stage EOC tumors compared to normal tissue. The hypomethylation could not be confirmed, but the overexpression of this gene in EOC tumors suggests that PRDM6 might have some implications in this type of cancer. Using RNA interference, PRDM6 expression was decreased in the EOC cell line SKOV3 and functional studies were performed. Decreased expression of PRDM6 induced a significant decrease in migration, invasion and colony formation factors that are necessary for carcinogenesis. In addition, an analysis of gene expression confirmed the underexpression of genes associated with the development of cancer in cell lines whose PRDM6 expression was decreased.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) est la forme de cancer gynécologique la plus létale. Ainsi, la compréhension des changements moléculaires associés à ce cancer métastatique ovarien peut mener à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques essentielles. La glycosylation, une modification post-traductionnelle, joue un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires. Cette glycosylation participe à des événements physiopathologiques majeurs durant la progression tumorale. De plus, il a été prouvé que l’expression aberrante des structures glycanes interfère avec des mécanismes cellulaires comme l’adhésion, la migration et la prolifération des cellules. Dans ce contexte, notre laboratoire a récemment montré que le gène codant pour la protéine N-acétylgalactosaminyltransférase 3 (GALNT3), membre de la famille des GalNAcTransférases (GalNAc-Ts), est hypométhylé et que la protéine GALNT3 est plus fortement exprimée dans les tumeurs CEO dont la sévérité est de grade élevé (“high-grade (HG) serous”), en comparaison avec des tumeurs à potentiel malin faible (“low malignant potential (LMP) ”) et des tissus ovariens normaux. Ces observations indiquent un fort potentiel oncogénique pour le gène GALNT3 dans les stades avancés du CEO. Ces premières constatations suggèrent également que la surexpression de GALNT3 peut jouer un rôle important dans la tumorigenèse du CEO en augmentant sa dissémination via une O-glycosylation de type mucine aberrante. Ces glycosylations anormales peuvent donc être impliquées dans la carcinogenèse ovarienne et nécessitent une étude approfondie. Dans ce projet de recherche, nous proposons d’approfondir les observations déjà obtenues in vitro en utilisant un modèle in vivo chez la souris, afin d’élucider le rôle fonctionnel de la GALNT3 et d’autres membres de cette famille dans la progression du CEO. A partir d’une étude de glycoprotéomique indépendante de la masse, qui a permis d’identifier des glycopeptides intacts ou métaboliquement marqués, ce projet de recherche a rendu possible la définition précise du rôle de GALNT3 dans la O-glycosylation des cibles de type mucine au sein des cellules CEO. Ainsi, via une recherche ciblée dans la base de données « SwissProt » du protéome humain, nous avons trouvé plusieurs centaines de glycoprotéines et glycopeptides uniques, différemment exprimés dans les clones cellulaires dépourvus en iv GALNT3 KD. Par la suite, nous avons identifié les gènes codant pour ces glycoprotéines et glycopeptides. Nous avons notamment trouvé, parmi la liste, un groupe de gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire dont les modifications post-traductionnelles sont, de manière intéressante, principalement supprimées dans les clones GALNT3 KD. De plus, nous nous sommes intéressés aux autres membres de la famille des GalNAc-Ts dans le CEO et nous avons montré que de multiples membres et pas uniquement GALNT3 peuvent jouer un rôle important dans la dissémination et la progression du CEO. De plus, une découverte très intéressante fut la redondance possible des rôles joués par certains membres de la famille des GalNAc-Ts dans le CEO. Ainsi, nous avons identifié GALNT6 qui serait, à l’image de GALNT3, impliquée dans la dissémination et la progression du CEO. Cette implication du GALNT6 est supportée par le fait que cette protéine a les mêmes fonctions que GALNT3, suggérant un effet compensatoire de GALNT6 en absence de GALNT3. Pour tester cette hypothèse, nous avons abolie l’expression des deux protéines GALNT3 et GALNT6, in vivo, et nous avons observé une effet significatif sur la formation des tumeurs et la survie des animaux. Pour la suite de ce projet, nous proposons d’analyser la structure glycane des différentes glycoprotéines identifiées dans les cellules cancéreuses, afin de déterminer les altérations des modifications O-glycanes suite à la perte d’expression de GALNT3 et d’autres membres de la famille des GalNAc-Ts. En conclusion, notre étude contribue à comprendre la participation du glycoprotéome dans la tumorigenèse du CEO et à identifier d’autres cibles de type mucine ou des O-glycoprotéines dont l’expression aberrante serait modulée dans le CEO. Ainsi, pris dans son ensemble, ce projet de recherche montre la possibilité de discriminer entre des cellules cancéreuses et des cellules contrôles via les glycosylations de leurs protéines et permet d’entrevoir la glycobiologie comme une voie prometteuse pour l’identifier de nouveaux biomarqueurs pour le diagnostic du CEO. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecologic malignancy, thus understanding the molecular changes associated with ovarian cancer metastasis could lead to the identification of essential therapeutic targets. Glycosylation is a post-translational modification (PTM) of proteins playing a major role in various cell properties. Glycosylation participates in major pathophysiology events during tumor progressions, and the aberrant expression of glycan structures was shown to interfere with cell properties such as cell adhesion, migration, and proliferation. The lab has previously identified the polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (GALNT3) gene, a member of the GalNAc-Transferases (GalNAc-Ts) gene family, as hypomethylated and overexpressed in high-grade (HG) serous EOC tumors, compared to low malignant potential (LMP) EOC tumors and normal ovarian tissues. Taken together, the data obtained were indicative of a strong oncogenic potential of the GALNT3 gene in advanced EOC and suggest that GALNT3 overexpression might contribute to EOC dissemination through aberrant mucin O-glycosylation, thus specifying some of the putative mechanisms of abnormal glycosylation implicated in ovarian carcinogenesis, which warrant further investigation. The current research project focused on expanding the in vitro observations obtained by using animal models to investigate in vivo the functional significance of GALNT3 and other close members of the GalNAc-Ts gene family in serous EOC progression. Moreover, by applying a mass-independent chemical glycoproteomics platform to characterize intact, metabolically labeled glycopeptides, this project more profoundly characterized the role of GALNT3 in aberrant O-glycosylation of mucin-like targets in EOC cells. Isotopically recorded ions were searched against the Swiss-Prot human proteome; and data obtained were indicative of hundreds of unique glycoproteins and glycopeptides that were differentially expressed upon GALNT3 KD. Related gene groups were identified, and interestingly, genes implicated in mechanisms of cellular metabolic functions, and PTMs were found to be predominantly suppressed in GALNT3 KD clones. In accordance, we also investigated the role of other members of the GalNAc-T family in EOC and we showed that multiple members and not only GALNT3 can play an important role in EOC cancer dissemination and progression. One very interesting finding was the redundant role some members of the GalNAc-T family members play in EOC. We investigated the compensatory functions of GALNT3 and GALNT6, and we were able to demonstrate these two genes can impose that synthetic backup. Furthermore, we found that and their ablation can affect animal survival and tumor formation as observed both in vivo and in vitro. In continuation of this work, this project will focus on analyzing the glycan structures of those differentially expressed glycoproteins, to further examine the specific O-glycans alterations associated with the GALNT3 and other members of the GalNAc-Ts upon gene knockout (KO). Fully elaborated glycopeptides can reveal structural details of the glycoproteome, thus our results could give important information on the glycome in EOC cells, and the identification of other O-glycoproteins/mucin-like targets whose aberrant expression may be modulated by these in EOC. Taken together, the ability to mark differences in the glycosylation of proteins between cancer cells and control cells can emphasize glycobiology as a promising field for potential biomarker identification.

Les cancers du sein et des ovaires sont parmi les cancers gynécologiques les plus fréquents et meurtriers. Parmi les nombreux facteurs de risque de développer un cancer, on retrouve notamment l'instabilité génétique et les mutations. Par exemple, des mutations dans les gènes de réparation de l'ADN tels que BRCA1 ou BRCA2, tous les deux impliqués dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN par recombinaison homologue (RH), augmentent la prévalence des cancers du sein et des ovaires puisque 70% des cancers du sein et 40% des cancers des ovaires en possèdent. En effet, une mutation dans la RH va mener à une instabilité génomique, créant des cassures simple-brin de l'ADN qui une fois répliquée deviendront des cassures double-brin de l'ADN, ce qui est très toxique pour les cellules. Depuis plusieurs dizaines d'années, les chercheurs se basent sur le concept de létalité synthétique afin de trouver des pistes thérapeutiques pour les patientes. En effet, lorsque dans la cellule, une voie de réparation est indisponible, une seconde voie pourra agir permettant la survie de celle-ci. Cependant, si cette seconde voie est inhibée, la cellule ne pourra pas réparer le dommage, et entrera en mort cellulaire. C'est sur ce principe que les inhibiteurs de PARP (PARPi) ont été développés et sont maintenant utilisés en clinique depuis 2014 pour traiter les patients atteints de cancer des ovaires, des seins, du péritoine, des trompes de Fallope, de la prostate ou du pancréas, dans un contexte de déficience pour les gènes BRCA1 ou BRCA2 ou lorsqu'un phénotype BRCAness est constaté. Si l'utilisation de ces drogues en clinique a été une révolution, 40% des patients ont par la suite développé une résistance, entrainant une non-réponse au traitement, une réponse partielle ou une récidive du cancer. Il est donc nécessaire de mieux comprendre comment fonctionnent ces drogues pour être en mesure de mieux étudier ces résistances afin d'offrir de meilleurs traitements, plus adaptés, aux patients. Dans ce contexte de résistance aux PARPi, de nombreuses équipes de recherche ont réalisé des criblages génétiques afin d'identifier des gènes de sensibilité ou de résistance à différents PARPi, dans un contexte BRCA1-déficient, BRCA2-déficient ou dans un contexte neutre. DYNLL1, une protéine composante de la chaine légère des dynéines, a été identifiée comme impliquée dans la résistance aux PARPi dans plusieurs criblages réalisés en 2018. En effet, il a été montré que DYNLL1 interagit avec des protéines de la réparation de l'ADN pour médier le choix de la voix de réparation, mais également pour inhiber l'étape cruciale de résection de l'ADN lors de la RH. L'absence de cette protéine dans un contexte BRCA1-déficient entraine une résistance des cellules à l'Olaparib, premier PARPi approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) en 2014. Dans cette étude, nous avons identifié le mécanisme biochimique par lequel DYNLL1 prévient la résection de l'ADN ainsi que le mécanisme de résistance aux PARPi dans les cellules de cancer du sein triple négatif dans un contexte déficient pour les gènes BRCA1 et DYNLL1 grâce à l'utilisation d'un modèle bidimensionnel puis tri-dimensionnel plus complexifié. Grâce à l'analyse de données publiques de l'expression de DYNLL1 dans des échantillons de cancers du sein et des ovaires, nous avons comparé la survie générale des patientes selon leur profil d'expression des protéines BRCA1 et DYNLL1. Nous avons également pris en compte DYNLL2, un paralogue de DYNLL1 homologue à plus de 93% et cependant jamais identifié dans les criblages de résistance, dans notre étude. Nous avons ainsi montré que si DYNLL2 ne semble pas avoir de rôle direct dans la résistance aux PARPi, son rôle dans la réparation de l'ADN mérite néanmoins d'être étudié. En résumé, cette étude apporte de nombreuses précisions sur le rôle de DYNLL1 dans la biologie des cancers du sein et des ovaires déficients pour BRCA1 qui pourront potentiellement permettre de l'utiliser comme biomarqueur pour orienter le choix thérapeutique des patientes dans le futur et ainsi grandement améliorer leur prise en charge. / Breast and ovarian cancers are amongst the most frequent and deadly gynecological cancers. Amid the different risk factors for tumorigenesis, we can find genetic instabilities and mutations. For example, mutations in the DNA repair pathways genes such as BRCA1 and BRCA2, both involved in double strand break repair and more specifically homologous recombination increase the prevalence for breast and ovarian cancer since 70% of breast cancer and 40% of ovarian cancer have some. Indeed, a mutation in homologous recombination leads to genomic instability which can create a single strand DNA break, which, once replicated, will become a double strand break, the most toxic DNA lesion for the cell. For the last decades, researchers have been using the concept of synthetic lethality to find new therapeutic approaches to treat the patients. Indeed, when in the cell, one DNA repair pathway isn't available, another pathway can be used for it to survive. However, if this second pathway is inhibited, the cell will not be able to repair the defect and will die. Based on this concept, PARP inhibitors have been used to treat patients with ovarian, breast, peritoneal, fallopian, pancreas and prostate cancers in a BRCA1/2-deficient or BRCAness context since 2014. The use of those drugs has been a revolution for patients' care, but sadly, 40% of them develop resistance to PARP inhibitors, leading to either no response to the treatment, a partial response, or a recurrence of the cancer. Therefore, it is necessary to better understand how those drugs work to study their resistance and offer better, or personalized treatments to the patients. In this context, many teams performed genetic screenings to identify genes involved in the sensitivity and resistance to PARP inhibitors, in a BRCA1 and/or BRCA2-deficient or in a neutral context. DYNLL1, a component of the dynein light chain, has been identified as involved in the resistance to PARP inhibitors in multiple screens performed in 2018. Indeed, it has been shown that DYNLL1 interacts with DNA repair proteins to mediate the repair pathway choice, but also to inhibit the important step of DNA resection in homologous recombination. The lack of this protein in a BRCA1-deficient context leads to a resistance of the cells to Olaparib, the first PARP inhibitor approved by the FDA in 2014. In this study, we identified the biochemical mechanism by which DYNLL1 prevents DNA resection as well as the PARP inhibitor resistance mechanism in triple negative breast cancer in a BRCA1 and DYNLL1 deficient context, using a two and three-dimensional cell model. Through an analysis of public data , we were able to compare the overall survival of the patients depending on the expression of BRCA1 and DYNLL1 in breast and ovarian cancers. In our study, we also considered DYNLL2, a paralog of DYNLL1, with 93% of homology that has however never been identified in the resistance screens. Thus, we showed that DYNLL2 doesn't seem to have a direct role in the resistance to PARP inhibitor, but that its role in DNA repair should be investigated. In brief, this study brings a lot of precisions on the role of DYNLL1 in the biology of BRCA1-deficient breast and ovarian cancers, which could potentially allow the use of this protein as a biomarker to facilitate the therapeutic choice for patients in the future, and largely improve their care.

À la suite d'un diagnostic de cancer de l'ovaire, la prise en charge thérapeutique constitue une étape déterminante dans la survie des patientes atteintes. Actuellement, la plupart de celles-ci subiront une cytochirurgie suivie d'une chimiothérapie standard comprenant du Cisplatin (ou Carboplatin) et du Paclitaxel. Malgré une réponse initiale adéquate, il a été démontré que 75-80% d'entre elles récidiveront peu de temps après la fin de leurs ("leurs" prend un "s" si chaque femme à plusieurs traitements) traitements. Dans ces cas de récidive, la plupart des patientes développeront aussi une résistance à la chimiothérapie. A ce stade, l'administration d'un traitement efficace devient donc un problème de taille pour les oncologues. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans notre programme de recherche, nous avons évalué le profil d'expression génique de six paires de tumeurs prélevées avant et après la chimiothérapie (CT) de six patientes atteintes d'un cancer épithéliale de l'ovaire (CEO), dans le but de pouvoir caractériser moléculairement les récidives résistantes de l'ovaire. Nos résultats ont montré la présence d'une signature moléculaire spécifique dans les tumeurs post-CT présentant une surexpression de gènes associés à des mécanismes connues de chimiorésistance et à la régulation négative de la prolifération. D'autres gènes liés à la réponse aux traitements, à l'apoptose, au contrôle du cycle cellulaire et à la régulation positive de la prolifération sont sous-exprimés dans ces mêmes tumeurs. Nous avons aussi analysé le profil d'expression génique de tumeurs primaires de l'ovaire de type séreux présentant différentes réponses aux agents chimiothérapeutiques, dans le but d'identifier une signature moléculaire spécifique associée à la réponse aux traitements primaires. Nos résultats suggèrent que la chimiorésistance innée peut être attribuée à une action combinée de différents facteurs liés au transport de la drogue (acquisition/excrétion), à la prolifération cellulaire ainsi qu'à des altérations dans le métabolisme, la réponse inflammatoire et l'apoptose. Une liste prédictive contenant 43 gènes a été développée et possède la capacité de pouvoir classifier les patientes ayant une tumeur séreuse de l'ovaire selon leur risque de récidiver tôt ou tard à la suite de leurs CT Découlant de ces études, plusieurs biomarqueurs associés à la chimiorésistance ont été identifiés. L'expression de certains d'entre eux a été validée dans une cohorte contenant 166 patientes atteintes de CEO présentant différents temps de survie (survie avec ou sans progression de la maladie) suivant leurs (idem) traitements de CT initiaux. Sur une liste contenant 15 candidats potentiels, nous avons observé qu'une plus faible expression protéique du biomarqueur HSP10 ainsi qu'une diminution de la prolifération cellulaire (via une plus faible expression du marqueur Ki67) prédisent une plus faible survie sans progression de la maladie et donc, par déduction, une plus grande chance de développer une chimiorésistance. L'expression protéique d'autres biomarqueurs (CTSL2 et MUC1) a été évaluée dans notre cohorte et nous avons trouvé que ceux-ci montraient une tendance à être associés avec la survie des patientes. Ceux-ci devront cependant être revalidés dans une plus grande cohorte de patientes. L'analyse des profils d'expression génique des tumeurs chimiorésistance de l'ovaire a aussi mené à l'identification de l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires (Célébrex) en termes de traitement potentialisateurs pouvant augmenter l'effet cytotoxique du Cisplatin sur les cellules de cancer de l'ovaire. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la réponse immédiate des cellules de cancer de l'ovaire aux traitements de CT ainsi que l'émergence d'une chimiorésistance précoce, nous avons étudié les profils d'expression génique de sphéroïdes dérivés de six lignées cellulaires de cancer de l'ovaire suivant un traitement avec des agents chimiothérapeutiques couramment utilisés dans le traitement des CEO (Cisplatin, Paclitaxel et Topotecan). Nous avons trouvé que l'induction de gènes liés aux mécanismes de réplication et de réparation de l'ADN dans les sphéroïdes traités avec du Cisplatin et du Topotecan pourraient être associée avec la réponse immédiate aux traitements et pourrait être liée à un mécanisme précoce de résistance. De façon similaire, la surexpression de différents isotypes de tubulines suivant un traitement des sphéroïdes avec du Paclitaxel pourrait représenter un effet compensatoire précoce à l'action de cette drogue. Finalement, les conditions de croissance en sphéroïde, condition reconnue pour altérer l'expression génique, pourrait substantiellement contribuer à réduire l'efficacité des agents chimiothérapeutiques sur les sphéroïdes de cancer de l'ovaire. Pris ensemble, les résultats présentés dans cette thèse aideront à mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à la chimiorésistance dans les cancers ovariens et aideront à définir de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour ce type de patientes.

À ce jour, les études épidémiologiques ont démontré que seulement 25% des agrégations familiales de cancer du sein observées ont lieu dans des familles ayant une mutation dans l'un des gènes de prédisposition comprenant BRCA 1, BRCA2, TP53, PTEN, ATM, STK11, CHEK2, BR/P1 et PALB2. Le nombre et les propriétés des facteurs génétiques composant le 75% restant de l'excès du risque génétique sont encore inconnus, quoique selon le modèle polygénique ce risque génétique serait causé par plusieurs allèles de susceptibilité pouvant, par exemple, influencer le métabolisme des hormones sexuelles. En effet, il est maintenant bien établi que les estrogènes jouent un rôle prédominant dans la régulation de la croissance cellulaire, ainsi que la différentiation de la glande mammaire normale et des carcinomes mammaires hormono-sensibles. Parmi les enzymes responsables de la formation et l'inactivation des stéroïdes sexuels actifs, les membres de la famille des 17~-hydroxystéroïde déshydrogénases (17~-HSDs) sont d'excellents candidats. Afin d'évaluer le rôle potentiel de ces gènes candidats, nous avons donc procédé au re-séquençage des régions promotrices, des jonctions intron-exon et des exons des gènes HSD17B1, HSD17B2, HSD17B7 et HSD17B12 chez une cohorte de 50 Canadiennes Françaises atteintes d'un cancer du sein, nonporteuses d'une mutation BRCA 1/2 et provenant de familles ayant une forte histoire de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Pour ces gènes, nos analyses ne démontrent pas l'existence de mutations germinales qui auraient permis d'expliquer le regroupement de cas de cancer du sein chez ces familles. Toutefois, nous avons identifié 88 variants de séquence dont environ la moitié n'avaient jamais été répertoriés. De plus, nous avons aussi procédé à l'étude de l'impact fonctionnel des cinq variants résultant en un changement d'acide aminé chez les enzymes 17~-HSD de types 1 et 2 et nous avons démontré par expression in vitro que ces variations faux-sens ne modifient pas les propriétés catalytiques de ces enzymes. Finalement, des marqueurs ont été sélectionnés pour mener de futures études d'association à l'aide de larges cohortes, a'fin de mieux définir la possible association entre le risque génétique de cancer du sein et les variants de séquence des gènes HSD1781, HSD1782, HSD1787 et HSD17812.