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Le NGF (Nerve Growth Factor) induit la croissance des cellules cancéreuses de sein, alors qu’il est sans effet sur les cellules normales. Il participe également au développement tumoral in vivo et est une cible thérapeutique potentielle dans le cancer du sein. Le NGF agit via les récepteurs TrkA et p75NTR. De même, le précurseur du NGF, le proNGF, peut être sécrété et induire la mort neuronale en se liant à p75NTR et à la sortiline. Néanmoins, aucune donnée n’a été rapportée sur l’expression et les effets potentiels du proNGF dans le cancer du sein. Au cours de ma thèse, nous avons démontré que le proNGF est produit et sécrété par les cellules cancéreuses de sein. Nous avons observé une surproduction du proNGF dans les biopsies cancéreuses malignes par rapport aux biopsies normales et aux pathologies bénignes. Cette surexpression est associée à l’envahissement des nœuds lymphatiques.J’ai confirmé, in vitro, que le proNGF, comme le NGF, favorise l’invasion des cellules cancéreuses de sein. Néanmoins, ces effets sont induits via des voies de signalisation distinctes. Ainsi, j’ai montré le rôle essentiel de la sortiline dans l’effet pro-invasif du proNGF. De même, le proNGF, comme le NGF, est capable d’activer la phosphorylation de TrkA mais ceci conduit à des voies de transduction différentes. Une analyse de l’interactome de TrkA a permis d’identifier des protéines différentiellement recrutées en fonction du ligand. Ainsi, l’ensemble des résultats obtenus a permis de mettre en évidence l’intervention du proNGF dans le cancer du sein. La discrimination des voies induites par le proNGF et par le NGF offre la possibilité de nouvelles modulations thérapeutiques dans ce cancer. / Nerve Growth Factor (NGF) induces the growth of breast cancer cells, whereas it has no effect on normal breast epithelial cells. NGF acts also on the tumor development in vivo and is considered as a potential therapeutic target in breast cancer. To exert its effects, NGF binds the receptors TrkA and p75NTR. More recently, proNGF, the NGF precursor, has been found to be secreted and to induce neuronal cell death by binding to a sortilin/p75NTR complex. Nevertheless, so far no data has been reported on the expression and the putative effects of proNGF in breast cancer cells. During my thesis, we have demonstrated that proNGF is produced and secreted by breast cancer cells. Moreover, we revealed an overproduction of proNGF in malignant breast tumors, in comparison to benign tumors and normal biopsies. Interestingly, a statistically significant association was obtained between the presence of proNGF and lymph node invasion by breast cancer cells. I confirmed that proNGF, but also NGF, induces in vitro breast cancer cell invasion. However, both proNGF and NGF induce their effects through distinct signaling pathways. I found that sortilin is essential for the proNGF pro-invasive effect while p75NTR is not necessary. Interestingly, proNGF, like NGF, is able to activate TrkA phosphorylation but this leads to different transduction cascades. TrkA interactome analysis allowed the identification of proteins differentially recruited on the receptor, depending on the ligand. Thus, our results demonstrate the first implication of proNGF in breast cancer. Deciphering of the pathways induced by proNGF and NGF would give the opportunity for new therapeutic modulations in breast cancer.

Les héparanes sulfates (HS) sont des polysaccharides linéaires dont l’état de sulfatation détermine les propriétés biologiques. La dernière étape de leur maturation est catalysée par les HS 3-O-sulfotransférases (HS3STs), qui sont représentées par sept isoenzymes. La fonction de ces enzymes dans la progression tumorale reste controversée. C’est dans ce contexte que nous avons étudié leur rôle en utilisant la lignée de cancer du sein MDA-MB-231.Nous avons montré que l’expression transitoire des HS3ST2, 3B et 4 augmente la prolifération et la survie des cellules, ce qui est associé à une suractivation de Src et Akt. En complément, nous avons observé une augmentation de l’activation de la voie NF-κB et de l’expression de protéines anti-apoptotiques. Ces réponses ont été corrélées à une résistance accrue des cellules transfectées à la mort induite par des stimuli pro-apoptotiques ou par les cellules NK. Ces premiers résultats suggèrent que les HS 3-O-sulfatés pourraient avoir un rôle protecteur contre le système immunitaire. La neuropiline-1 a récemment été décrite comme un ligand des HS 3-O-sulfatés. Nous avons donc poursuivi notre étude en analysant le rôle de ce co-récepteur dans des cellules exprimant stablement la HS3ST3B. L’invalidation d’expression de la neuropiline-1 réduit la prolifération et la survie des cellules transfectées, ainsi que l’activation de Src et Akt. Ces derniers résultats suggèrent que les propriétés pro-tumorales des HS modifiés par la HS3ST3B sont dépendantes de leur interaction avec la neuropiline-1. Dans leur ensemble, nos travaux suggèrent que l’expression de certaines HS3STs dans les cellules cancéreuses pourrait être de mauvais pronostic. / Heparan sulfate (HS) is a linear polysaccharide in which the sulfation pattern determines the biological properties. The last step of HS maturation is catalyzed by the HS 3-O-sulfotransferases (HS3ST), which are represented by seven isozymes. The functions of HS3STs in cancer progression are still controversial. In this context, we focused our investigations on the roles of these enzymes in MDA-MB-231 breast cancer cells. First, we found that transient expression of HS3ST2, 3B and 4 enhanced their proliferation and survival. It turns out that these effects are related to an increase in the activation of Src and Akt. Complementary to this, we observed an increase in the activation of the NF-κB pathway and the expression of anti-apoptotic proteins. In line with these findings, we showed that HS3ST-transfected cells were more resistant to cell death induced by pro-apoptotic stimuli or NK cells. These results suggest that, in addition to increasing cellular growth, 3-O-sulfated HS can also protect cancer cells against the immune system. Neuropilin-1 was recently described as a preferential ligand of 3-O-sulfated HS. Thus, we investigated the role of this co-receptor in MDA-MB-231 cells that carry a stable expression of HS3ST3B. We demonstrated that silencing neuropilin-1 resulted in reduced proliferation and survival, which was associated with a strong decrease in Src and Akt activation. These last results support a model in which HS3ST-modified HS may display tumor-promoting functions through the interaction with neuropilin-1. Overall, our findings suggest that the expression of certain HS3STs in cancer cells could be associated with a bad prognosis.

Le laboratoire INSERM U908 a montré le rôle déterminant du facteur de croissance NGF dans l’agressivité du cancer du sein. De précédentes études ont montré que l’inhibition de l’activité de TrkA, le récepteur du NGF, aboutissait à une diminution de la taille des tumeurs in vitro mais aussi dans des modèles pré-cliniques. Néanmoins, ces inhibiteurs ont donné lieu à des essais cliniques décevants. La résistance à ces inhibiteurs est en partie due à l’association de récepteurs membranaires. Plus précisément, mon travail de thèse a permis de démontrer qu’une forme particulière du récepteur CD44 interagit avec TrkA ce qui conduit à une résistance aux traitements. De plus, j’ai également montré l’existence d’une interaction entre TrkA et deux autres récepteurs. Ainsi, j’ai pu déterminer précisément comment ces récepteurs coopèrent afin de développer des inhibiteurs ciblant leur interaction. Ces inhibiteurs pourraient donc s’avérer efficaces pour le traitement de certains cancers du sein. Ma thèse souligne l’importance des complexes de récepteurs dans la plasticité des cellules cancéreuses et leur capacité à s’adapter pour résister aux thérapies ciblées. / INSERM U908 lab highlighted the role of NGF in breast cancer aggressiveness through the activation of its receptor TrkA. Previous works demonstrated that inhibition of TrkA activity contributes to a significant decrease of the tumors size in vitro or in pre-clinical model. Nevertheless, these inhibitors resulted in disappointing clinical trials. The resistance to TrkA inhibitors is in part due to the activation of alternative pathways through the formation of membrane receptor complexes. More precisely, my PhD work demonstrates that a particular form of the receptor CD44 interacts with TrkA leading to treatment resistance. Moreover, I also demonstrate an association between TrkA and two other receptors. I identified how these receptors interact and I developed some inhibitors targeting the interaction. These inhibitors could be effective for treating breast cancer. My PhD highlights the importance of membrane receptor complexes in cancer cells plasticity and their abilities to adapt for resisting to targeted therapies.

L’homéostasie sodique joue un rôle prépondérant lors de la carcinogénèse prostatique. Cependant, le rôle du canal de fuite sodique NALCN lors de la carcinogénèse prostatique était totalement inconnu. L’objectif principal de cette étude était d’étudier le rôle de NALCN dans la dérégulation de l’homéostasie sodique lors de la tumorigenèse prostatique. Tout d’abord, nous avons montré sur des coupes de tissus prostatiques que l’expression de NALCN est augmentée dans les cancers. De plus, NALCN est surexprimé dans les lignées cancéreuses prostatiques les plus agressives. Nous avons vérifié la fonctionnalité du canal NALCN et de ses protéines associées via des expériences d’imagerie sodique dans ces lignées. Grâce à notre étude, nous montrons que NALCN n’est pas impliqué dans le cycle cellulaire, la viabilité cellulaire, l’apoptose ni la prolifération. En revanche, nous avons démontré que ce canal affecte grandement la motilité, la migration et l’invasion de nos lignées cellulaires cancéreuses prostatiques. Nous avons montré que NALCN et le proto-oncogène Src sont co-localisées dans le cancer de la prostate, notamment au niveau de structures appelées invadopodes. Enfin, nous avons prouvé par des études in vivo que la croissance tumorale et la formation de métastases sont inhibées lorsque l’expression du canal NALCN est diminuée. En conclusion, nos données mettent en évidence que le canal NALCN est un acteur important dans l’augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses de prostate à la fois in vitro et in vivo. NALCN peut donc être considéré comme une nouvelle cible thérapeutique permettant de diminuer l’agressivité des cancers de la prostate. / Importantly, altered Na+ homeostasis was implemented in prostate carcinogenesis. However, until now nothing was known about a newly discovered Na+ leak channel, NALCN, and its role in prostate malignancy. Therefore, the main objective of this study was to investigate the involvement of NALCN as a potential candidate of the deregulated Na+-dependent signalling mechanisms in prostate cancer. Interestingly, NALCN represented distinctly different localization patterns and levels of expression between human healthy and cancer prostate tissues. Indeed, NALCN was expressed preferentially in highly aggressive prostate cancer cell lines. Na+ imaging results verified on functionality of NALCN channelosome in these cells. Our study also revealed that NALCN was not involved in cell cycle, viability, apoptosis and proliferation, but significantly affected motility, migration and invasiveness of the prostate cancer cells. Interestingly, it was already reported that protooncogene Src family kinase is recruited to the NALCN complex. In this study, we confirmed that NALCN and Src kinase are co-localized in human prostate cancer cells, particularly in the structures that represent invadopodia formation sites. Furthermore, in vivo studies confirmed that NALCN downregulation inhibits tumour growth and metastasis formation. Overall, these data provide evidence on NALCN contribution to the increased metastatic potential of human prostate cancer cells in vitro and in vivo. Therefore, NALCN could provide new perspective molecular target for the disease suppression, in particular at its advanced stages.

Les cancers de l’ovaire épithéliaux (EOC) sont parmi les affections néoplasiques gynécologiques les plus meurtrières dans les sociétés occidentales. Il n’existe actuellement aucune méthode de dépistage efficace de la maladie dans ses phases précoces de développement. Les travaux de ce doctorat furent articulés autour de deux objectifs relatifs à la recherche de biomarqueurs des EOC. Le premier fût le développement des méthodes d’analyses par spectrométrie de masse MALDI pour le criblage global des marqueurs des différents types d’EOC. Une procédure d’extraction des protéines de hautes masses moléculaires sur coupes de tissus à été créée afin de repousser les limites de sensibilité de la méthode. Ensuite, des analyses multivariées ont permis la comparaison des informations spectrales contenues entre des zones histologiques de natures différentes. Tous ces développements ont conduit à la validation au niveau histopathologique d’un biomarqueur de l’immunosuppression associée au cancer de l’ovaire, le fragment C-terminal de PA28 ou Reg-Alpha. Une autre problématique, la détermination de l’origine des EOC, a également pu être étudiée. Le deuxième objectif fût l’exploration de l’implication relative des différents membres des proprotéines convertases dans les EOC, des enzymes clés dans la maturation de nombreux acteurs moléculaires de la progression tumorale. Pour ce faire, des lignées cellulaires SKOV-3, Knock Down des différents membres de ces enzymes ont été créées pour l’étude de la redondance fonctionnelle de celles-ci. Il a alors été possible de déterminer, in cellulo et in vivo que PACE4 est particulièrement influente sur la progression du cancer de l’ovaire séreux. / Epithelial ovarian Cancers (EOC) are amongst the most deadly gynecological neoplastic afflictions in western countries. As this time, there is no method for the efficient screening of the disease in its early steps of development. The topics of this PhD are based on two objectives related to biomarkers research of EOC. The first one was the development of analytical methods for MALDI Mass Spectrometry for global biomarkers screenings in different types EOC. An extraction procedure for high molecular mass proteins on tissue sections has been designed in order to push back the limits of sensitivity of the method. Then, multivariate analyses allowed us to compare spectral informations contained in histological regions of different natures. All these developments conducted to the histopathological validation of a biomarker of immunosupression associated to ovarian cancer, namely the C-terminal fragment of PA28 (Reg-Alpha). Another issue, the determination of EOC origin, has also been studied. The second goal of this PhD has been the exploration of the relative implication of the different members of proproteine convertases (PCs) in EOC, which are keys enzymes involved in the maturation of many molecular actors of tumoral progression. To do so, SKOV-3 cell lines have been knocked-down for different PCs to study the functional redundancy of these enzymes. It has then been possible to determine, in cellulo and in vivo, that PACE4 is particularly influent on ovarian cancer progression.

Les tumeurs sont très hétérogènes à la fois au niveau moléculaire et au niveau de la diversité cellulaire composant leur microenvironnement. La classification des gliomes repose actuellement sur des critères histologiques qui sont enclins à de fortes subjectivités inter- et intra-observateurs. Le but de ce projet est de réaliser une classification moléculaire des gliomes de haut grade en se basant sur des données protéiques permettant de localiser des biomarqueurs potentiels directement sur le tissu. Des sous-régions ayant des profils moléculaires différents ont été mises en évidence et les molécules les composants ont été identifiées. Les résultats démontrent que les annotations histologiques ne concordent pas avec la classification moléculaire. Cette hétérogénéité est également retrouvée dans le microenvironnement des tumeurs où l’on retrouve des cellules immunitaires telles que les macrophages. Les macrophages sont détournés de leur fonction par la tumeur pour lui permettre de se développer. Une stratégie thérapeutique pour contrer sa croissance est de réorienter le phénotype des macrophages vers un phénotype antitumoral. L’inhibition de la proprotéine convertase 1/3 s’est révélée être une stratégie prometteuse pour la réactivation des macrophages via les récepteurs TLR. Les facteurs sécrétés par ces macrophages ont un effet sur la viabilité et l’invasion de différentes cellules cancéreuses en fonction des ligands des récepteurs TLR utilisés. La première partie nous a permis d’identifier des sous-groupes de gliomes qui en fonction de leur profil moléculaire pourront recevoir des traitements personnalisés basés, par exemple, sur l’inhibition de proprotéines convertases. / Tumors are highly heterogeneous both histologicaly and molecularly. In fact, several non-neoplasic cell types are present in the microenvironment. Glioma classification is based on histological criteria that are prone to inter- and intra-observers subjectivities. Within tumors of same grade, subgroups can be differentiated. The aim of this project is to realize a molecular classification of high grade glioma based on proteomics data allowing the localization of potential biomarkers directly on the tissue. Subregions having different molecular profiles have been highlighted and the molecules comprising them have been identified in a localized way. Results prove that histological annotations do not necessarily correspond to molecular classification. This heterogeneity is also found in the tumor microenvironment where we can find immune cells such as macrophages. Macrophages are changed from their primary function by the tumor to allow it to grow. A therapeutic strategy to counter the tumor growth has been developed in order to switch macrophages phenotype toward an antitumor one. The inhibition of PC1/3 enzyme has proven to be a promising therapy to reactivate macrophages via TLR receptors. Secreted factors by these PC1/3 inhibited macrophages have an effect on cancer cells viability and invasion according to TLR ligand used. The first part will allow us to identify subgroups of glioma which, depending on their molecular profiles, could, in a long-term view, receive personalized treatments based on the inhibition of proproteins convertases combined to TLR ligands.

Le cancer colorectal (CRC) est la deuxième cause de décès par cancer dans le monde. Contrairement aux autres types de cancer, le CRC est une pathologie qu’il est possible à la fois de prévenir et de guérir si la tumeur est réséquée à un stade précoce. Cependant la plupart des CRC ne sont pas détectés avant d’avoir envahi d’autres organes ou des ganglions lymphatiques car les tests de dépistages actuels ne sont pas suffisamment spécifiques et sensibles. Dans ce contexte, il est urgent d’identifier des biomarqueurs permettant de détecter les CRC à des stades précoces, de suivre le développement des tumeurs pendant la durée du traitement et de prédire les récidives. Les mucines, O-glycosylprotéines majeures du mucus qui protège l’épithélium intestinal, sont fréquemment altérées dans les cancers colorectaux et jouent un rôle important dans la pathogénèse de la maladie. L’objectif principal de ce travail de thèse était d’explorer les altérations d’expression et de glycosylation des mucines intestinales durant les différentes étapes de la transformation maligne, et d’identifier, parmi les molécules modifiées, de potentiels biomarqueurs utilisables pour évaluer le pronostic et le risque de récidive après traitement. Les mucines ont été purifiées à partir de pièces opératoires d’individus sains et de patients atteints de CCR et leur profil de glycosylation a été déterminé par spectrométrie de masse. Les résultats obtenus démontrent une très forte diminution du niveau d’expression des O-glycanes sialylés basés sur un core 3 dans la tumeur, corrélée à une forte augmentation des O-glycanes sialylés basés sur un core 1. Aucune corrélation n’a pu être faite entre les stades des tumeurs et les répertoires de glycosylation des mucines. Cependant, à l’exception des antigènes sialyl-Tn, les tumeurs de patients ayant récidivé présentaient moins d’altérations dans leur profil de glycosylation de mucines, comparées aux tumeurs sans récidive. Ces résultats suggèrent que les O-glycanes de mucines provenant de tumeurs avec récidive masqueraient la situation pathologique en mimant une situation physiologique saine afin d’échapper au système de défense immunitaire. Nous avons également confirmé une augmentation de l’expression d’un antigène sialyl-Lex basé sur un core 3 dans la tumeur de patients sans récidive, qui semble entrer en compétition avec son homologue sulfo-Lex dans le côlon sain. Nous avons démontré une diminution significative de l’expression des Gal-3-O-sulfotransférases ainsi que de faibles variations de l’expression des α2,3-sialyltransférases, qui pourraient expliquer l’inversion des ratios d’expression de ces 2 antigènes. L’expression de DMBT1, une mucine-like, est fortement augmentée dans les stades précoces du CCR et une très forte expression de DMBT1 dans la muqueuse de résection des patients semble corrélée à un mauvais pronostic. En conclusion, notre travail a permis de démontrer pour la première fois une possible corrélation entre le profil de glycosylation des mucines dans la tumeur réséquée et le risque de récidive. Ces travaux démontrent également des altérations spécifiques de la glycosylation des mucines durant la transformation maligne et la progression vers le CCR. Ces résultats devraient permettre d’identifier de nouveaux marqueurs utilisables pour le pronostic et pour guider les oncologues dans le choix des traitements post-opératoires. / Colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related death in the Western world. Unlike many other malignancies, CRC is a preventable and curable disease if early stage tumors are removed. However many CRC remain undetected until they have spread to the surrounding organs or lymph, correlating with poor prognosis because of the low sensitivity and specificity of fecal occult blood tests used for screening of risk populations. In this context, there is an urgent need to identify biomarkers for early detection of CRC, to follow tumor development during the course of therapy and to predict recurrence. Mucins, major glycoproteins found in the mucus film covering and protecting the colon mucosa, are frequently altered in colon cancer and implicated in the pathogenesis of cancer. The main goal of this PhD project was to explore alteration of expression and glycosylation of colonic mucins during progression of adenomas to a colorectal cancer and to identify, among all these modified molecules, new potential biomarkers for prognosis and recurrence after treatment. Mucins were purified from healthy individuals and patients with colon cancer and their O-glycosylation patterns were determined by mass spectrometry. The obtained data showed an important decrease in the level of expression of sialylated core 3 based O-glycans in tumors correlated with an increase in sialylated core 1 structures. No correlation was established between stages of the tumor samples and mucin O-glycosylation. However, with the notable exception of sialyl Tn antigens, tumors with recurrence presented a milder alteration of glycosylation profile than tumors without recurrence. These results suggest that mucin O-glycans from tumors with recurrence might mimic a healthier physiological situation, hence deceiving the immune defense system. We confirmed an increased expression of a core 3 sialyl-Lex hexasaccharide in tumors of patients without any recurrence during the first 3 years after resection of the tumor, which appeared to compete with its sulfo-Lex counterpart in normal tissue. We demonstrated a significant decrease of expression of Gal-3-O-sulfotransferases together with small variations of α2,3-sialyltransferases expression levels that could explain the inversion of ratio for these two sugar motifs. Expression of DMBT1, a mucin-like, was highly increased in early stages of colon carcinoma and a high expression in normal mucosa of patients seemed to be correlated with a poor prognosis. In conclusion, our work demonstrated for the first time a possible correlation between mucin O-glycosylation patterns in the resected tumor of patients and the risk of recurrence. This study highlights specific pattern of mucin alterations during malignant transformation and progression of colon cancer. These findings might prove valuable as prognostic tools orienting the cure to be given to patients after resection.

Notre laboratoire a montré que le NGF et les neurotrophines sont des facteurs déterminants de la cancérogenèse mammaire, et plus particulièrement de la croissance et de l’invasion des cellules cancéreuses de sein. Les effets du NGF dépendent, entre autres, de l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase TrkA. Récemment, nous avons décrit que le précurseur du NGF, le proNGF, est également produit et sécrété par les cellules cancéreuses de sein pour induire leur invasion via la formation d’un complexe sortiline/TrkA. Néanmoins, les différentes signalisations induites par le NGF et le proNGF ne sont pas encore parfaitement décryptées dans le cancer du sein. Au cours de ma thèse, j’ai démontré que le NGF et le proNGF induisent des complexes de récepteurs distincts. Ainsi, alors que le NGF conduit à la formation d’un complexe membranaire TrkA/CD44, le proNGF recrute quant à lui la sortiline, TrkA et EphA2. En outre, les études in vivo, réalisées dans un modèle de souris SCID, montrent que la croissance tumorale est dépendante de la formation de ces complexes. Ainsi, l’administration conjointe d’un inhibiteur de l’activité kinase de TrkA (CEP-701) et d’un ARN interférent dirigé soit contre CD44, soit contre EphA2, diminue significativement le volume tumoral en comparaison à l’utilisation en monothérapie du CEP-701 ou d’un siEphA2 ou du siCD44. L’ensemble de mes résultats a permis d’approfondir les mécanismes d’action du NGF et de son précurseur dans les cellules cancéreuses mammaires et suggère l’existence de mécanismes de résistance à travers les coopérations TrkA/CD44 et TrkA/EphA2, ouvrant ainsi l’opportunité à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les cancers. / We have shown that autocrine stimulation of breast tumor cells by NGF increased both cell growth and migration/invasion. These effects are mediated by TrkA, a receptor tyrosine kinases. Recently, it has been described that proNGF, the NGF precursor, is also produced and secreted by breast cancer cells to induce invasion through activation of sortilin/TrkA complex. Nevertheless, NGF and proNGF signaling are still unclear in breast cancer. During my thesis, I have demonstrated that the pro-invasive signaling of (pro)NGF requires the formation of NGF/TrkA/CD44 and proNGF/sortilin/TrkA/EphA2 complexes. I have showed that each of these receptor complexes leads to the induction of two separate transduction pathways, one dependent on TrkA phosphorylation, and the other independently. Furthermore, by using a SCID mouse xenograft model, we have demonstrated the involvement of TrkA/CD44 and TrkA/EphA2 complexes in tumor growth. Interestingly, the co-administration of an inhibitor of the TrkA kinase activity (CEP-701) and a siRNA directed either against CD44 or against EphA2, decreases significantly the tumor burden in comparison to the use of CEP-701, siEphA2 or siCD44 alone. Thus, our findings have improved the knowledge of NGF and proNGF signaling in breast cancer cells and suggest the presence of resistance mechanisms mediated by TrkA/CD44 and TrkA/EphA2 interactions, thereby giving the opportunity for new therapeutic modulations in breast cancer.