HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) est un gène suppresseur de tumeursinactivé dans de nombreux cancers par hyperméthylation de son promoteur ou pardélétion chromosomique. HIC1 joue également un rôle au cours du développement.En son absence, les souris meurent autour de la naissance et présentent desdéfauts de développement observés chez l’Homme dans le Syndrôme de Miller-Dieker. La protéine HIC1 est un facteur de transcription possédant deux domainesde répression transcriptionnelle autonomes, son BTB/POZ N-terminal et sa régioncentrale, suivis de 5 doigts de zinc de type Krüppel C2H2 permettant sa fixation à uneséquence d’ADN spécifique centrée sur un motif GGCA. Au cours de ma thèse, je me suis intéréssé aux mécanismes transcriptionnels mis en place par HIC1 afin de réprimer la transcription de ses gènes cibles. Dans cecadre, nous avons étudié son interaction fonctionnelle avec les protéines de lafamille Polycomb. HIC1 interagit avec hPCL3 et PHF1, deux protéines de la famillePolycomb-like, qui favorisent alors la formation d’un complexe avec les membres duPRC2. Les Polycomb sont retrouvés sur une partie des gènes cibles cibles de HIC1et l’inhibition de HIC1 dans des fibroblastes embryonnaires entraîne la délocalisationpartielle du PRC2 sur au moins un gène cible commun ATOH1. HIC1 est donc le premier facteur de transcription chez l’Homme capable de recruter les Polycomb-like. En parallèle de ce travail, nous avons étudié les caractéristiques de l’interaction entreles deux isoformes de hPCL3 et l’histone méthyl-transférase EZH2. Dans une dernière partie, nous avons mis en évidence de nouveaux gènes cibles de HIC1 impliqués dans la migration et l’invasion des cellules mammaires, deuxmécanismes dérégulés dans les carcinomes en absence de HIC1. ADRB2 code un récepteur membranaire dont l’activation par l’adrénaline en conditions de stress est fortement impliqué dans la croissance tumorale et le processus de métastase dansles cancers du sein. En tant que gène suppresseur de tumeurs, la réexpression de HIC1 inhibe celle d’ADRB2 et impacte fortement la migration et l’invasion de cellules mammaires malignes. / HIC1 (Hypermethylated in Cancer 1) is a tumor suppressor geneepigenetically silenced or deleted in many human cancers. HIC1 is also essential fornormal development since Hic1 deficient mice die perinatally and exhibit grossdevelopmental defects observed in human Miller-Dieker Syndrome.HIC1 encodes a transcriptional repressor with five C2H2 zinc fingers mediatingsequence-specific DNA binding and two autonomous repression domains : an NterminalBTB/POZ and a central region.In the first part of my work, we were interested in the transcription mechanismsused by HIC1 to repress its target genes. We characterized the functional interactionbetween HIC1 and Polycomb repression complexes. We demonstrated that HIC1interacts with hPCL3 and its paralog PHF1 to form a stable complex with the PRC2members. HIC1 shares some of its target genes with Polycomb. Furthermore,depletion of HIC1 leads to a partial displacement of PRC2 from the ATOH1 promoter.Thus, our results identify HIC1 as the first transcription factor able to recruit PRC2 tosome target promoters in human through its interaction with Polycomb-like proteins.In parallel to this work, we better characterized the modalities of the interactionsbetween both isoforms of hPCL3 and the Polycomb histone methyltransferase EZH2.In the last part of this work, we investigated new HIC1 target genes involved inmigration and invasion of breast carcinomas. ADRB2 encodes a membrane receptoractivated by adrenaline, which is released in vivo under stress conditions and isinvolved in tumor growth and metastasis in breast carcinomas. Agonist-mediatedstimulation of ADRB2 increases the migration and invasion of malignant breastcancer cells but the effect is abolished following re-expression of the tumorsuppressor gene HIC1.

Malgré d’importants progrès en recherche fondamentale et clinique, le cancer du sein reste à ce jour le premier cancer féminin en termes d’incidence et de mortalité. Parmi les facteurs contribuant à son développement, notre laboratoire a mis en évidence le rôle des neurotrophines, en particulier le NGF (Nerve Growth Factor) et son précurseur (proNGF). D’autre part, les études récentes ont permis de démontrer l’importance des cellules souches cancéreuses (CSC) dans la tumorigenèse et dans les phénomènes de résistance thérapeutique et de métastase. Mon projet de thèse avait pour but d’étudier les effets du NGF et du proNGF sur la régulation des CSC de sein et d’évaluer la conséquence sur le développement tumoral. Nous avons pu démontrer que le NGF et le proNGF sont capables d’enrichir la population de CSC dans plusieurs lignées de cellules épithéliales mammaires cancéreuses. Cet enrichissement est lié à la surexpression de plusieurs facteurs de transcription essentiels dans le maintien de la pluripotence des cellules souches. Les expériences de tumorigenèse chez les souris montrent que les cellules cancéreuses de sein MCF-7 cultivées en présence de NGF et de proNGF présentent une tumorigenèse accrue comparée aux cellules contrôles. De façon intéressante, seul le traitement au NGF induit la formation de métastases dans cerveau, poumons et foie, ainsi que une transition épithélio-mésenchymateuse. Ces travaux ont permis de monter que le NGF et le proNGF agissent sur le compartiment des CSC et contribuent à la régulation de la plasticité des cellules cancéreuses in vitro et in vivo. / Despite significant advances in cancer research and treatment, breast cancer remains one of the leading causes of cancer-related death in women. NGF (Nerve Growth Factor) and its precursor (proNGF) are overexpressed in breast cancer cells, where they exert a mitotic, anti-apoptotic and pro-invasive effects through an autocrine loop. In the last few years, a raising number of experimental data indicate the importance of “cancer stem cells” (CSC) in tumour development, metastasis and resistance to therapies.The objective of my thesis was to evaluate the influence of NGF and proNGF on breast CSC biology and to determine their consequences on tumour development. We demonstrated that NGF and proNGF are able to enrich for CSC in several breast cancer cell lines. This enrichment is connected to the overexpression of several transcription factors essential for stem cells self-renewal and pluripotency. Tumorigenicity assays in SCID mice proved that cells from MCF-7 cell line cultured with NGF or proNGF are more tumorigenic than the control condition. Nevertheless, only cells pre-treated with NGF were able to develop metastases in brain, lung and liver and to go through an epithelial-to-mesenchymal transition, demonstrating that NGF and proNGF induce their effects through different signaling pathways. Taken together, our results have shown that NGF and proNGF contribute to the regulation of stem cells’ plasticity in vitro and in vivo. Future perspectives concern the comprehension of involved molecular mechanisms in order to better understand their implication in breast cancer development.

Le cancer de la prostate (CaP) représente la deuxième cause de mortalité par cancer dans les pays développés. L'invasion des tissus environnants et l'angiogenèse tumorale promeut la métastase de CaP vers des organes éloignés. L’expression de plusieurs canaux TRP (Transient Receptor Potential) est dérégulée dans les cellules cancéreuses et les cellules endothéliales (CE) dérivées de tumeurs. Ils ont donc été proposés comme marqueurs pour la progression du cancer ainsi que comme cibles potentielles pour une thérapie pharmaceutique. Afin d'étudier les canaux TRP dans la vascularisation du CaP, nous avons isolé et caractérisé trois lignées de CE derivées du CaP (PTEC). Nous avons testé sur les PTEC l'effet de deux molécules anti-angiogénique en combinaison avec des médicaments anti-androgèniques. Les résultats démontrent un comportement résistant des PTEC à des médicaments anti-angiogéniques par rapport à des CE normales. Nous avons criblé l'expression de tous les canaux TRP dans les CE saines et celles dérivées de trois types tumoraux (prostate, sein, rein). Nous avons identifié cinq candidats ‘spécifiques’ du CaP dérégulés seulement dans les PTEC qui ont été caractérisés au niveau fonctionnel et leur rôle potentiel en tant que modulateurs de l'angiogenèse in vitro a été testé. En outre, nous avons étudié le rôle inhibiteur de TRPM8 dans la migration des cellules cancéreuses prostatiques CaP et nous avons également détecté TRPM8 dans les CE dans lesquelles nous avons observé aussi un rôle anti migratoire de TRPM8. Pris dans leur ensemble, nos résultats mettent en lumière de nouveaux acteurs moléculaires pour cibler sélectivement la progression du CaP et son angiogenèse. / Prostate cancer (PCa) is the second most lethal male tumor in developed countries. Metastasis to distant organs is mainly mediated by tissue invasion and angiogenesis, which are indeed two of the main cancer hallmarks. Several Transient Receptor Potential (TRP) proteins are deregulated in cancer cells and angiogenesis and have been suggested as valuable markers in predicting cancer progress and as potential targets for pharmaceutical therapy. In order to screen and study TRP channels in PCa vasculature, we isolated and characterized three lines of human endothelial cells (ECs) from PCa patients (PTEC). We tested the effect of two anti-angiogenic in combination with anti-androgen drugs. The results clearly demonstrate a resistant behavior of endothelial cells isolated from prostate cancer to specific anti-angiogenic drugs compared to normal endothelial cells. We fully profiled the expression of TRP channels in tumor (prostate, breast and renal) and healthy ECs, with particular interest for prostate tumor EC. We identified five ‘prostate specific’ candidates deregulated in PTEC compared to endothelial derived from healthy prostate. ‘Prostate specific’ TRP candidates were functionally characterized and their potential role as in vitro angiogenesis modulators investigated. Our laboratory has already extensively studied the role of TRPM8 in PCa progression and migration. For this reason, we further investigated the molecular mechanism underling this effect in PCa cells as well as in ECs. Taken together, our results bring to light TRP channels as novel molecular players to selectively target prostate tumor progression and angiogenesis.

Une altération du processus de N-glycosylation des protéines peut conduire à l’apparition de pathologies comme le cancer ou les "Congenital Disorders of Glycosylation" (CDG). La première partie de mon travail de thèse a porté sur l’étude de l’implication de la Man2C1 dans la cancérogenèse de la prostate. La Man2C1 est une glycosidase impliquée dans le processus ERAD « Endoplasmic reticulum associated degradation ». Nous avons montré le transfert de précurseurs oligosaccharidiques incomplets de type Man9Gn2 et Man5Gn2 sur les protéines, ainsi qu’une diminution de l’antennarisation des N-glycannes dans des lignées cancéreuses prostatiques. Cependant, même si nous avons observé une corrélation entre l’expression de la Man2C1 et l’activation de la voie PI3K/Akt aucun lien direct n’a été montré entre les deux phénomènes. La deuxième partie de mon travail de thèse a porté sur l’étude fonctionnelle de Gdt1p, orthologue fonctionnel de TMEM165, chez Saccharomyces cerevisiae. TMEM165, est une protéine golgienne dont la déficience conduit à l’apparition d’un CDG de type II. Nous avons étudié le rôle de Gdt1p dans le processus de glycosylation en utilisant différents mutants de pmr1p, unique transporteur de Ca2+/Mn2+ de l’appareil de Golgi. Notre étude a montré que le défaut de glycosylation observé est lié à une perturbation de l’homéostasie golgienne en Mn2+ et que la restauration de la glycosylation par le Mn2+ est associée au gradient calcique golgien, ce qui nous a permis de suggérer un rôle d’antiport Ca2+/Mn2+ pour Gdt1p. / N-glycosylation is a complex process localized in two cellular subcompartiments, the Endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. N-glycans are involved in physiological functions such as cell-cell interactions and also in the folding of N-glycoproteins newly synthesized. Disturbances of N-glycosylation process can lead to pathologies such as cancer or Congenital Disorders of Glycosylation.In the first part of my work, we studied the role of Man2C1 in prostate cancer genesis. Man2C1 is a glycosidase involved in the Endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD). We pointed out the transfer of incomplete Man5Gn2 and Man9Gn2 oligosaccharide precursors and a decrease of N-linked glycan antennary profiles in prostate cancer cell lines. However, neither direct link between Man2C1 expression level, nor catalytic activity of Man2C1 and the level of activation of Akt pathway in prostate cancer cell lines have been demonstrated. In the second part of my work we analyzed the involvement of Gdt1p in N-glycosylation process in Saccharomyces cerevisiae. TMEM165 is a Golgi localized protein whose impairment leads to CDG type II. My study was based on TMEM165 ortholog in Saccharomyces cerevisiae, Gdt1p. We analyzed the involvement of Gdt1p in Glycosylation process using Pmr1p mutants, the only one Ca2+/Mn2+ transporter known in the Golgi apparatus. Our study has demonstrated that the glycosylation defect observed is due to a disturbance in manganese Golgi homeostasis and needs calcium gradient of golgi saccules. Our study confirmed Mn2+ transport function of Gdt1p and suggested an Ca2+/Mn2+ function for Gdt1p.

Selon le modèle hiérarchique, seule une sous-population tumorale, les CSC (cellules souches cancéreuses), est capable de générer une tumeur. Ces CSC possèdent des caractéristiques communes aux cellules souches normales comme la capacité d’autorenouvellement illimité et de différenciation. Plusieurs études ont montré que des traitements anti-tumoraux pouvaient générer des CSC à partir de cellules cancéreuses non souches. Ce mécanisme de reprogrammation pourrait donc être une cause majeure des échecs thérapeutiques et des récidives. Actuellement, il est impossible de différencier les CSC préexistantes des CSC induites (iCSC) suite à la reprogrammation. En effet, ces populations possèdent toutes deux les mêmes propriétés «souches» et sont identifiées par les mêmes marquages conventionnels. De plus, faute de marqueurs de reprogrammation, les études ne permettent pas un suivi dynamique de la plasticité cellulaire. Il est donc impératif de disposer de moyens spécifiques permettant l’identification de manière différentielle des CSC préexistantes et des iCSC pour l'étude de l’implication de la reprogrammation suite aux traitements. Dans le cadre de ce travail de thèse, j’ai mis en évidence que le promoteur de l’ALDH1A1 pouvait être un marqueur de l’activité des CSC. Les cellules identifiées par ce marqueur présentent des propriétés d’autorenouvellement, de différenciation, de résistances aux thérapies et de tumorigenèse in vivo. Le suivi de ces cellules par fluorescence a également permis de visualiser le phénomène de reprogrammation en temps réel suite à l’irradiation. Tout comme il a permis de mettre en évidence le plus fort potentiel d’extravasation de ces cellules dans un modèle de puces mimant un microvaisseau. J’ai ainsi par la suite construit un vecteur d’expression inductible basé sur l’activité de ce promoteur afin de suivre de manière dynamique les différentes populations cellulaires : non CSC, CSC préexistantes et iCSC. Ce vecteur se compose de plusieurs systèmes, notamment le système inductible TetON, le système CRE-loxP et le système de recombinaison Flp/FRT permettant le suivi des populations cellulaires par fluorescence. Mes travaux de thèse ont ainsi permis la génération d’outils utilisables pour le suivi dynamique des CSC et des CSC induites par les thérapies. / Many solid cancers are thought to be organized hierarchically with a small number of cancer stem cells (CSCs) able to re-grow a tumor while their progeny lacks this feature. These CSCs are associated with radioresistance. Recent studies have revealed that non-cancer stem cells may undergo dedifferentiation subsequently obtaining the phenotype and functions of CSCs. Indeed, ionizing radiation reprogrammed differentiated breast cancer cells into induced cancer stem cells (iCSCs). This mechanism of reprogramming can contribute to relapse. CSCs and iCSCs cannot be distinguished as they share the same stem cell-like properties. Breast CSCs can be isolated based on their high ALDH1 activity while iCSC studies require originally sorting of ALDH1-negative cells. Such studies are limited to in vitro experiments. In vivo reprogramming studies require designing a specific CSC and iCSC identification system.During my PhD thesis, I showed that ALDH1A1 promoter can be used to identify cells with CSC. The cells identified by fluorescent protein in which expression is controlled by ALDH1A1 promoter possess self-renewal and differentiation properties. They also exhibited higher capacity to form tumors, and an increased resistance to anticancer therapies. Monitoring of these cells by fluorescence tracking facilitated the visualization of reprogramming phenomenon in real time following the irradiation. In addition, we were able to observed the strongest extravasation potential of these cells in a microvessel mimicking chip model. I have subsequently constructed an inducible expression vector based on the activity of this promoter in order to dynamically follow the different cell populations: non-CSCs, pre-existing CSCs and iCSCs. This vector consists of several systems, including the inducible TetON system, the CRE-loxP system and the Flp / FRT recombination system for monitoring cell populations by fluorescence. My thesis work has thus enabled the generation of tools that can be used for the dynamic monitoring of CSCs and CSCs induced by therapies.

Le cancer colorectal (CCR) est une pathologie dont les causes tiennent en partie d’un style de vie basé sur un régime alimentaire de type occidental et un mode de vie sédentaire. Cela implique par conséquent que le CCR soit associé à d’autres troubles métaboliques tels que l’obésité et le diabète. D’un consensus général on considère que le CCR est une maladie qui est mieux traitée si elle est dépistée relativement tôt ; malheureusement il n’existe toujours pas d’outils de diagnostic suffisamment fiables. A ce propos, différents types de glycosylation ont été proposés comme de potentiels biomarqueurs de cette maladie. Les travaux abordés dans cette thèse ont concerné l'influence de la O-GlcNAcylation (consistant en le transfert d'un seul monosaccharide de N-acétylglucosamine sur des résidus de sérine/thréonine de protéines cytoplasmiques, nucléaires et mitochondriales), sur la glycosylation complexe dans des lignées cellulaires coliques (HT29, HCT116 et CCD841CoN). La O-GlcNAcylation est intimement liée au statut nutritionnel, il est d’ailleurs proposé que son niveau soit plus élevé dans les pathologies métaboliques. Néanmoins il est clairement montré que les cellules et les tumeurs coliques expriment des niveaux plus élevés de O-GlcNAcylation. Plusieurs études ont montré que l’inhibition ou la délétion de la O-GlcNAc transférase (OGT), l’enzyme responsable des processus de O-GlcNAcylation, réduisait l'agressivité ou les propriétés associées au caractère tumoral dans différents modèles de cancer. Quelques études ont également montré que la sous-régulation de l’OGT se répercutait sur les glycosylations complexes : N- et O-glycanes, et glycosphingolipides (GSLs). La O-GlcNAcylation participe à des processus cellulaires clés tels que la transcription et la traduction. Dans une étude préliminaire, nous avons examiné les niveaux de transcrits de quatre-vingt-six glycosyltransférases et glycosidases dans des conditions de siOGT. Le siOGT a permis de constater que plusieurs de ces gènes étaient régulés positivement ou négativement, bien que parmi ces gènes seuls 10 étaient régulés négativement de manière significative. L'influence de l’OGT sur l’expression protéique de plusieurs glycosyltransférases a également été explorée. Nous avons ensuite utilisé plusieurs lectines en microscopie par fluorescence et en cytométrie en flux ainsi que la spectrométrie de masse (glycomique) afin d'élucider les structures complexes des glycanes et leur niveau d’expression dans les cellules coliques traitées par des siOGT. La diminution de O-GlcNAcylation n'a eu qu’un effet modéré sur les N- et O-glycanes globaux. Cependant, l'expression de plusieurs antigènes de surface a été modifiée par le siOGT. La E-cadhérine, un facteur majeur de la transition épithéliale-mésenchymateuse, a été régulée positivement dans les cellules HT29 traitées par le siOGT. De plus, les glycanes complexes portés par la E-cadhérine ont été eux-mêmes modifiés dans les cellules traitées par le siOGT. L'analyse MALDI des GSLs extraits de cellules HCT116 a révélé une altération significative de ces derniers dans les cellules siOGT, inversant le patron d’expression des GSLs décrits dans certaines cellules cancéreuses. Les GSLs des séries Globo, Gb3 et Gb4 ont été régulés à la hausse, tandis que les GSL gangliosidiques GM1a, GM2 et GD1a ont été régulés à la baisse. Cette étude démontre pour la toute première fois une relation entre la O-GlcNAcylation et les GSLs. Étant donné que les GSLs jouent un rôle important dans la reconnaissance cellulaire, la transduction du signal et d'autres propriétés de la surface cellulaire, ces observations pourraient expliquer en partir les changements phénotypiques liés au siOGT. De manière générale, une diminution de l’α2,3-sialylation est observée dans des conditions siOGT. Ces travaux sont les premiers à montrer un effet de la déplétion en OGT sur l’ensemble du glycome complexe, en particulier ceux s’exprimant à la surface des cellules. / Colorectal cancer (CRC) remains a major cause of health burden in Europe and in the western world. It is a disease of lifestyle with the western diet and a sedentary lifestyle widely implicated. This implicates CRC to be associated with other metabolic disorders like obesity and diabetes. The general consensus is that it is a disease that is hugely avoidable and treatable if detected early however reliable detection tools are still lacking. Glycosylation biomarkers have been proposed as potentially a new frontier against this disease. The work covered in this thesis pertains to the influence of O-GlcNAcylation (the transfer of a single N-acetyl glucosamine monosaccharide on serine/ threonine residues), on complex glycosylations in colon cells (HT29, HCT116 and CCD841CoN). O-GlcNAcylation is a nutrient sensor which conveys the metabolic state and indeed is aberrantly regulated in metabolic disease. CRC cells and tissues express higher levels of O-GlcNAcylation and an accompanying phenotype of high proliferation and aggressive tumours. There are numerous studies showing that silencing O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT), the enzyme that catalyses O-GlcNAcylation, decreases the aggressiveness or cancer-like properties in several cancer models. There is little evidence starting to accumulate that shows that in these siOGT cells or tissue there is also a change in other complex glycosylations (N-, O- or glycosphingolipids glycans). O-GlcNAcylation is known to participate in key cell processes like transcription and translation. In this preliminary work, we look at the transcriptomic expression of eighty-six glycosyl transferases and glycosidases gene transcripts when OGT is silenced. Silencing OGT resulted in several of these genes being upregulated or downregulated but only 10 genes were significantly downregulated. The translational influence of OGT on several glycosyl transferases was also explored. We used several techniques namely; fluorescent lectin microscopy, lectin aided FACS analysis and several mass spectrometry techniques (glycomics), to study the complex glycan structures and expression in siOGT colon cells. Silencing O-GlcNAcylation has little effect on the global N- and O-glycans as elucidated by glycomic profiling. However, cell surface expression of several glyco-antigens was altered in siOGT. E-cadherin, a major influencer of the epithelial-to-mesenchymal transition, is upregulated in siOGT transfected HT29 cells. Furthermore, the complex glycans it carries are altered in the process. This could in part explain some of the siOGT phenotypes noted in other studies. Using MALDI mass spectrometry analysis, in HCT116 cells we found that glycosphinogolipid (GSL) expression is altered significantly in siOGT HCT116 cells. There is a reversal of some known cancerous GSL patterns; Globo series, Gb3 and Gb4 GSLs were upregulated, while ganglioside GSLs GM1a, GM2 and GD1a are downregulated. This is the first time an association has been made between O-GlcNAcylation and GSLs. As GSLs play an important part in cell recognition, signal transduction and other cell surface properties this may be one of the key links with the siOGT phenotype. All together there is a decrease in several α2,3-sialylated glycans when OGT is silenced. For the first time in scientific literature we show the global glycan effect of silencing OGT on the expression of complex glycans particularly at the cell surface, adding several new findings.

Les cellules cancéreuses acquièrent lors de la cancérogenèse des caractéristiques telles qu’une insensibilité aux signaux antiprolifératifs, une résistance à l‘apoptose et au stress réticulaire, l’acquisition d’un pouvoir invasif. De nombreux travaux montrent l’implication du calcium dans ces différentes caractéristiques. Selon des données récentes, les canaux de la famille TRP (Transient Receptor Potential) sont des acteurs clefs dans l'homéostasie calcique. Plusieurs travaux ont montré que les changements d’expression de certains canaux TRP pouvaient contribuer à la cancérisation, entre autres TRPV6 et TRPV2 dans les cancers de prostate et de vessie. Nous montrons ici que la vitamine D3, étudiée depuis longtemps dans le cadre de thérapie anticancéreuse pour ses pouvoirs anti-prolifératifs, peut aussi stimuler la prolifération des cellules prostatiques cancéreuses, en augmentant l’expression de TRPV6 et le Ca2+ entrant par ce canal. Ainsi, nos résultats remettent en cause l’utilisation de la vitamine D3 en thérapie. Nous montrons également que l’adrénomédulline (AM), connue pour être impliquée dans la progression tumorale vers les métastases, stimule la migration et l’invasion des cellules cancéreuses prostatiques et urothéliales. Cet effet nécessite la présence du canal TRPV2; l’AM agit en induisant la translocation à la membrane plasmique du canal TRPV2 et de ce fait en augmentant la [Ca2+]i. Enfin, nous mettons en évidence que dans des conditions de stress réticulaire dans les cellules prostatiques cancéreuses, le translocon est le canal de fuite calcique majoritaire du réticulum endoplasmique menant à la vidange des stocks réticulaires et à la mort cellulaire. / Cancer cells acquire during carcinogenesis some characteristics such as insensitivity to the antiproliferative signals, resistance to apoptosis and reticular stress, the acquisition of invasive capacity. Numerous studies show involvement of calcium (Ca2+) in these different characteristics. According to recent data, the TRP channels (Transient Receptor Potential) are key players in calcium homeostasis. Several recent works have shown that changes of expression of some TRP channels could contribute to carcinogenesis, among other TRPV6 and TRPV2 in prostate and bladder cancers. Here we show that vitamin D3, studied for many years in cancer therapy for its anti-proliferative capacity, could also stimulates prostate cancer cells proliferation, this effect being associated with overexpression of TRPV6 and the subsequent increase in the Ca2+ entering through this channel. Thus, our results challenge the use of vitamin D3 in prostate cancer therapy. We also show that adrenomedullin (AM), known to be involved in tumor progression to metastasis, stimulates migration and invasion of prostate and urothelial cancer cells. This effect requires the presence of TRPV2; AM acts by inducing TRPV2 translocation to plasmamembrane and the subsequent increase of [Ca2+]i. Finally, we highlight that under conditions of reticular stress in prostate cancer cells, the translocon represents the endoplasmic reticulum calcium leak channel leading to the emptying of reticular stocks and cell death.

La progression du cancer de la prostate s’accompagne d’une augmentation du nombre de cellules neuroendocrines, cellules qui expriment fortement les canaux calciques voltage-dépendants de type T Cav3.2. Ces canaux favorisent la sécrétion de phosphatase acide prostatique, marqueur des cellules épithéliales prostatiques, et d’autres facteurs mitogènes potentiellement responsables de la prolifération des cellules avoisinantes. L'objectif de cette thèse était de déterminer les protéines partenaires du canal Cav3.2 et leur(s) rôle(s) dans la tumorogenèse prostatique. Nous montrons que les canaux Cav3.2 sont couplés aux canaux potassiques BK dans les cellules cancéreuses prostatiques. Ces 2 types de canaux interviennent dans la prolifération cellulaire. De plus, nous montrons que la sous-unité accessoire α2δ2 des canaux calciques voltage-dépendants est exprimée plus fréquemment dans les tissus cancéreux prostatiques par rapport aux tissus sains, et que son expression augmente avec le grade du cancer. Par des études in vitro et in vivo, nous mettons en évidence son rôle promoteur de la croissance tumorale et de l’angiogenèse. Par ailleurs, nous montrons que Cav3.2 et α2δ2 peuvent s’associer dans un même complexe protéique et qu’α2δ2 est capable de moduler l’activité de ce canal. Cependant, nos travaux suggèrent également que le rôle de cette sous-unité dans la prolifération prostatique pourrait être indépendant de son association avec Cav3.2. En conclusion, ce travail amène à une meilleure compréhension de l’implication des canaux calciques de type T et de ses protéines associées dans le cancer de la prostate. / Prostate cancer progression leads to an androgen-refractory aggressive stage. This is associated with an increased number of neuroendocrine cells overexpressing Cav3.2 T-type calcium channels. Cav3.2 channels promote the secretion of prostatic acid phosphatase and other mitogenic factors responsible for the proliferation of epithelial cells. In order to determine the role of T-type channels and to understand their regulation during cancer progression, the aim of this work was to identify proteins that interact with Cav3.2 channels and their role in physiopathology. First, we demonstrate that Cav3.2 channels are coupled with BK channels in prostate cancer cells. We show that both channels are involved in proliferation. Moreover, we show that accessory α2δ2, γ4 and β4 subunits, putative partners of voltage-gated calcium channels, are expressed in prostate cancer cell lines and prostatic tissues. We show that the α2δ2 subunit is more frequently expressed in cancerous tissues than in healthy ones, and that its expression increases with cancer grade. We propose that the α2δ2 subunit may be used as a biomarker for prostate cancer diagnosis. Furthermore, using in vitro and in vivo studies, we highlight the promoting role of α2δ2 on tumor growth and angiogenesis. In addition, we show that Cav3.2 and α2δ2 can associate in a protein complex and that α2δ2 can modulate the activity of Cav3.2 channels. However, our study also suggests that the role of the α2δ2 subunit in prostate cell proliferation could be independent of its association with Cav3.2. In conclusion, this work leads to a better understanding of the role of T-type calcium channel and its partners in prostate cancer.

Plusieurs études ces dernières décennies suggèrent l’importance des canaux TRPs dont TRPM8 dans le développement et la dissémination du cancer de la prostate. Néanmoins, les différentes études menées sur ce canal sont contradictoires. L’objectif de ma thèse a été d’étudier le rôle précis de TRPM8 dans le cancer prostatique par des études in vivo afin d’évaluer l’impact de TRPM8 sur la croissance tumorale, la dissémination de ces cellules et la formation de métastases. De plus, nous avons approfondi les mécanismes moléculaires sous-jacents régulant l’effet anti-migratoire de TRPM8.Grâce à l’utilisation de nanocapsules lipidiques contenant un agoniste du canal TRPM8, nous avons confirmé par des études in vitro et in vivo un rôle inhibiteur de TRPM8 sur les capacités de migration et d’invasion des cellules cancéreuses prostatiques. De plus, nous avons également déterminer un rôle de TRPM8 sur la croissance tumorale grâce à l’utilisation de greffes orthotopiques dans des prostates murines. Nous avons également déterminé les mécanismes de régulation de la migration cellulaire par le canal TRPM8 et des protéines partenaires à ce canal. Dans ce cadre, nous avons défini et déterminé une régulation du canal TRPM8 par les androgènes modulant la migration cellulaire mais également les mécanismes sous-jacents de l’inhibition de la migration cellulaire induite par TRPM8 et impliquant la petite GTPase Rap1.L’ensemble de nos résultats démontrent un rôle antiprolifératif et anti-migratoire du canal TRPM8 sur les cellule cancéreuses prostatiques, suggérant ainsi une action protectrice de ce canal dans la dissémination des métastases prostatiques. / Several studies in recent decades suggest the importance of TRP channel including TRPM8 in the development and metastatic dissemination of prostate cancer. Nevertheless, the different studies conducted on this channel are contradictory. The aim of my thesis was to study the precise role of TRPM8 in prostate cancer by in vivo studies to study the impact of TRPM8 on tumor growth and metastatic dissemination. In addition, we determined the underlying molecular mechanisms regulating the anti-migratory effect of TRPM8.Due to the use of lipid nanocapsules containing a TRPM8 channel agonist, we have confirmed by in vitro and in vivo studies an inhibitory role of TRPM8 on the migration and invasion capacities of prostatic cancer cells. In addition, we also determined an inhibitory role of TRPM8 on tumor growth through the use of orthotopic grafts in murine prostates. We also determined the regulatory mechanisms of cell migration by TRPM8 channel and its partner proteins. In this context, we defined and determined a regulation of the TRPM8 channel by androgens modulating cell migration. Moreover, we determined also the mechanisms underlying the inhibition of TRPM8-induced cell migration involving the small Rap1 GTPase.All of my results demonstrate an anti-proliferative and anti-migratory role of the TRPM8 channel on prostatic cancer cells, suggesting a protective action of this channel in the dissemination of prostatic metastases.

Le système immunitaire reconnait les cellules tumorales mais il est régulé par plusieurs facteurs tels les cellules T Régulatrices (Tregs). La galectine (Gal)-9 est une lectine aux propriétés immunosuppressives exprimée par les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires dont les Tregs. Nous avons cherché à confirmer le rôle fonctionnel de la Gal-9 dans les Tregs. Puis nous avons testé la capacité d’un anticorps anti-Gal-9 (GalNab1) à bloquer les fonctions suppressives de la Gal-9 ou des Tregs et son effet anti-tumorale. Nous avons prouvé que les Tregs expriment et secrètent abondamment la Gal-9. GalNab1 antagonise l’effet de la Gal-9 recombinante (r) sur les PBMCs et inhibe les fonctions suppressives des Tregs. Le blocage de la rGal-9 en culture favorise la croissance des Th1 sans induire de cytotoxicité et bloque les fonctions des exosomesGal-9+ dérivés de Carcinome du Nasopharynx (CNP). In-vivo, dans un modèle de souris SCID humanisé, GalNab1 limite la croissance du CNP. Le CNP est associé au virus d’Epstein-Barr (EBV) dont il exprime plusieurs protéines. L’utilisation d’une stratégie de vaccination peptidique ciblant les lymphocytes TCD4+ Th1 est envisagée. Six peptides dérivés des antigènes de latence II d’EBV et promiscuous pour HLA-II ont été sélectionnés et assemblés en cocktail, dont la capacité à induire une sécrétion d’IFN-γ par les PBMCs a été validé. Des lignées Th1 spécifiques du cocktail présentent une forte capacité cytotoxique vis-à-vis de lignées de CNP tout en résistant aux effets des exosomes tumoraux autologues. In-vivo, le cocktail permet de maîtriser la croissance tumorale, et ex-vivo, de réactiver la réponse T mémoire chez les patients. / The immune system can recognize and eliminate cancer cells but is held back by inhibitory factors such as Regulatory T cells (Tregs). Gal-9 is a β-galactoside binding lectin with immunosuppressive capabilities expressed by cancer cells and immune cells including Tregs. NPC is a malignant epithelial cancer which is almost always associated with Epstein Bar Virus (EBV) and expresses several viral proteins. Numerous vaccines targeting different EBV peptides had limited success in clinical trials. First part: we aimed to confirm the role of Gal-9 in human Treg function. Then we tested the capabilities of an anti-human-Gal-9 antibody (mAb) to block Gal-9 suppressive function and its effect on Treg function and the anti-tumoral response. We proved that Gal-9 is expressed and secreted by Tregs at a high level. The mAb antagonized the function of recombinant rGal-9 on PBMCs. Moreover, the mAb inhibited the immuno-suppressive function of Tregs. Gal-9 blocking in PBMC culture promoted a Th1 response without inducing toxicity. We used the mAb to inhibit hNPC derived exosomes. In-vivo, the mAb limited the growth of hNPC tumors in humanized SCID mice. Second part: CD4+ T cell response is essential in managing NPC. The use of a CD4+ T cell response inducing peptide cocktail vaccination strategy was tested here. 6 HLA II promiscuous peptides derived from the 3 EBV latency II antigens were generated. These peptides induced IFNγ secretion by PBMCs. Generated peptide-specific CD4+ T cell lines showed highly cytotoxicity against NPC cell lines and resistance to hNPC exosomes. Invivo, the cocktail restrained tumor growth. Exvivo, it reactivated NPC patients’ memory T cells.