Les cellules humaines sont soumises à des stress induisant des cassures double-brin de l’ADN principalement réparées par la voie NHEJ, où la kinase DNA-PKcs joue un rôle central. L’activité de DNA-PKcs, régulée par de nombreuses phosphorylations, est cruciale pour le maintien de l’intégrité génomique. Plus récemment, il a été montré que cette protéine était également modifiée par l’O-GlcNAcylation dans la lignée COS7. Sachant l’équilibre existant entre phosphorylation et O-GlcNAcylation, nous avons étudié le rôle de cette nouvelle MPT dans la régulation de l’activité de DNA- PKcs. Nous avons montré que DNA-PKcs est O-GlcNAcylée dans les cellules HeLa. Puis nous avons montré que la modulation de l’O-GlcNAcylation de DNA-PKcs impacte son autophosphorylation en Ser2056, suggérant l’existence d’une balance O-GlcNAcylation /phosphorylation, ainsi que la capacité des cellules à réparer les DSBs par la voie NHEJ. De plus, nos résultats nous laissent envisager que cette modification puisse jouer un rôle dans la stabilité de la protéine. DNA-PKcs est une cible potentielle dans les stratégies de lutte contre le cancer. Nous avons étudié l’impact d’un composé sur DNA-PKcs. Cette molécule provoque une réduction de la quantité et de l’activité de DNA-PKcs, impliquant son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome et menant à une sensibilisation des cellules à un traitement génotoxique. Dans ce contexte, nous avons développé une puce à anticorps pour évaluer le profil phosphoprotéique des voies de réparation de l’ADN et ainsi évaluer l’effet d’inhibiteurs de DNA-PKcs. L’ensemble de ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de la régulation de DNA-PKcs. / Human cells are subjected to stresses inducing DNA double-strand breaks mainly repaired by the NHEJ pathway, where the kinase DNA-PKcs plays a central role. The activity of DNA-PKcs, regulated by numerous phosphorylations, is crucial for the maintenance of genomic integrity. More recently, it has been shown that this protein is also modified by O-GlcNAcylation in the COS7 cell line. Knowing the balance between phosphorylation and O-GlcNAcylation, we studied the role of this new PTM in the regulation of DNA-PKcs activity. We have shown that DNA-PKcs is O-GlcNAcylated in HeLa cells. We then showed that the modulation of DNA-PKcs O-GlcNAcylation affects its autophosphorylation on Ser2056, suggesting an O-GlcNAcylation/phosphorylation balance, as well as the ability of cells to repair DSBs by NHEJ pathway. Moreover, our results allow us to consider that this modification may play a role in protein stability. DNA-PKcs is a potential target in anticancer strategies. We studied the impact of a chemical compound on DNA-PKcs activity. This molecule causes a reduction in the amount and activity of DNA-PKcs, through its ubiquitinylation and its degradation by the proteasome and leading to sensitization of the cells to genotoxic treatment. In this context, we have developed an antibody microarray to evaluate the phosphoprotein level of DNA repair pathways and thus estimate the effect of DNA-PKcs inhibitors. All these results contribute to a better understanding of the regulation of DNA-PKcs.

La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle appartenant au groupe des glycosylations. C’est une modification dynamique, analogue à la phosphorylation, dont la réversibilité est contrôlée par un couple d’enzymes, la O-GlcNAc transférase (OGT) et la O-GlcNAcase (OGA). Bien que les fonctions de la O-GlcNAcylation aient été étudiées à différents niveaux de régulation cellulaire, aucune étude n’a porté jusqu’ici sur sa localisation potentielle au niveau des radeaux lipidiques (rafts). Or, il a été récemment démontré que l’élévation des niveaux de O-GlcNAcylation participait activement au phénomène de résistance à l’insuline et un nombre important de preuves a également été apporté sur le rôle critique des microdomaines lipidiques dans ce phénomène de résistance. On sait également depuis peu qu’après stimulation par l'insuline, l’OGT est recrutée à la membrane plasmique par l'intermédiaire de son domaine PPO (PIP-binding activity of OGT), et que cette relocalisation inactive la voie de signalisation PI3-kinase/Akt par antagonisme vis-à-vis de la phosphorylation. Ces trois observations suggèrent que l’OGT puisse constituer un relai essentiel permettant de transmettre l’information portée par des stimuli externes au travers de la membrane plasmique, et plus particulièrement des rafts, par le biais d’une régulation des voies de signalisation. Au cours de ma thèse, nous avons adapté une technique permettant de purifier les microdomaines lipidiques, en procédant par une extraction par le détergent CHAPSO suivi d'une étape d'ultracentrifugation. Nos expériences ont montré pour la première fois la localisation de l’OGT et de protéines O-GlcNAcylées, parmi lesquelles nous avons identifié la chaîne bêta du récepteur de l'insuline et Hsp70, au niveau des microdomaines lipidiques. Le recrutement de ces éléments est contrôlé par l’insuline: nous avons en effet observé une association progressive de la glycosyltransférase aux microdomaines lipidiques après stimulation par cette hormone. Nous avons démontré que, en réponse à l'insuline, l’OGT est recrutée au niveau des lipides rafts, ce qui suggère une régulation négative de la voie PI3-Kinase/Akt par O-GlcNAcylation, au niveau des microdomaines lipidiques. Cette étude est la première suggérant une relation directe entre la O-GlcNAcylation des protéines associées aux rafts et la régulation de la signalisation cellulaire par l'insuline. En marge de ses travaux, nous avons mis en évidence l'existence de la O-GlcNAcylation chez les deux parasites apicomplexes Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum. Une approche biochimique et bioinformatique a également permis de prouver l'existence propre de l'OGT chez le toxoplasme. / The attachment of O-linked beta-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) to proteins is a post-translational modification belonging to the group of glycosylations. This is a dynamic modification, analogous to phosphorylation, which reversibility is controlled by a couple of enzymes, namely the O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Although the functions of O-GlcNAcylation have been studied at different levels of cell regulation, until now none study refers its potential location at the level of lipids microdomains (rafts). Nevertheless, it has been recently shown an elevation of the O-GlcNAcylation levels are actively involved in the phenomenon of insulin resistance and a significant number of publications also reports the critical role of lipid microdomains in this phenomenon of resistance. Little while ago, we know that after stimulation with insulin, the OGT is recruited to the plasma membrane through its PPO domain (PIP-binding activity of OGT), and that this relocation inactivates the PI3-kinase/Akt signaling pathway by exerting an antagonistic effect on its phosphorylation. These three observations suggest that OGT may play an essential role in signal transmission through its interaction with the plasma membrane and more particularly with the lipid microdomains. During my thesis, we first adapted a technique to purify lipid microdomains, using a method combining an extraction with the detergent CHAPSO followed by an ultracentrifugation. Our experiments show for the first time that OGT and some O-GlcNAcylated proteins, among which we identified the insulin receptor beta-chain and Hsp70, are located in lipid rafts. The recruitment of these elements is controlled by insulin: we indeed observed a progressive association of the glycosyltransferase to the lipid microdomains after stimulation by this hormone. We demonstrated that in response to insuline, the OGT is recruited to lipid rafts, suggesting a down-regulation of the PI3-Kinase/Akt pathway by O-GlcNAcylation at the level of the lipid microdomains. This study is the very first suggesting a direct relationship between the O-GlcNAcylation of the lipid rafts-associated proteins and the regulation of cell signaling by insulin. In margin of these works, we have brought to the fore O-GlcNAcylation in the two apicomplexan parasites Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum. A biochemical and bioinformatic study led us to prove that toxoplasma possesses its own OGT.

La sédentarité ou un alitement prolongé sont des situations ayant en commun une perturbation sensorimotrice (PSM), conduisant à une dégradation de la posture et la locomotion, dont l’origine est à la fois musculaire et nerveuse. Des études réalisées sur un modèle animal de PSM ont notamment montré des modifications biochimiques et morphologiques au niveau du cortex sensorimoteur. Cependant, les mécanismes sous-jacents ne sont tous pas élucidés. La O-GlcNAcylation, une glycosylation atypique, est une bonne candidate pour participer à cette neuroplasticité. Par interaction avec la phosphorylation, ces modifications post-traductionnelles sont impliquées dans des processus essentiels tels que l'activité synaptique ou la morphogenèse neuronale. L’objectif principal de cette thèse a été d’étudier les mécanismes moléculaires de la plasticité synaptique du cortex sensorimoteur et d’examiner l’implication potentielle de la O-GlcNAcylation au cours d’une période de PSM. Des changements d’activation et d’expression de protéines synaptiques ont été mis en évidence, montrant une diminution de la libération des neurotransmetteurs et une réduction de l’efficacité synaptique. La O-GlcNAcylation et la phosphorylation interviennent dans ces modifications en régulant finement l’activité de protéines spécifiques. La modulation des taux corticaux de O-GlcNAcylation permet de prévenir la réorganisation du cortex somesthésique, et prévient partiellement certaines altérations des performances sensorimotrices induite par une PSM. En conclusion, ces travaux montrent que la O-GlcNAcylation, en interaction avec la phosphorylation, participe activement à la plasticité synaptique induite par une PSM. / Sensorimotor perturbation (SMP) is frequently encountered in various situations, such as a sedentary lifestyle or prolonged bed rest. They all lead to postural and locomotor issues; whose origin is both muscular and nervous. Studies performed in a SMP animal model have shown changes in the sensorimotor cortex such as biochemical changes, somatotopic maps reorganization, morphological modifications of dendritic spines…. However, the underlying mechanisms are still unclear. O-GlcNAcylation, an atypical glycosylation, is a good candidate to participate in this neuroplasticity. By interplays with phosphorylation, these posttranslational modifications are both involved in essential cellular and physiological processes such as synaptic activity or neuronal morphogenesis. The main objective of this thesis was to study the molecular mechanisms of synaptic plasticity of the sensorimotor cortex and to examine the potential involvement of O-GlcNAcylation during a SMP period. We have shown that a period of SMP induces changes in activation and expression of synaptic proteins, leading to a decrease of neurotransmitters release and synaptic efficacy reduction. O-GlcNAcylation and phosphorylation appear to be involved in this synaptic plasticity by finely regulating the activity of specific synaptic proteins. Cortical modulation of O-GlcNAcylation level prevents somatosensory cortex reorganization, and prevents partially some alterations of sensorimotor performances induced by a SMP. In conclusion, all of these studies suggest that O-GlcNAcylation, in interaction with phosphorylation, participates actively in synaptic plasticity induced by SMP period.

Pas de résumé en français / One of the hallmarks of cancer cells is to exhibit increased uptake and consumption of glucose.3-5% of the glucose entering into the cell leads to a minor pathway of the glucose metabolismknown as the hexosamine biosynthetic pathway (HBP). UDP-N-acetylglucosamine is the endproduct of HBP and is used as substrate by OGT (O-GlcNAc transferase) to modify diverserange of nuclear and cytoplasmic proteins with a recently characterized post-translationalmodification called O-GlcNAcylation. It corresponds to the addition of sugar moiety O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) on serine or threonine residue of proteins. This process isantagonized by another enzyme called O-GlcNAcase (OGA). Recent studies indicated thepresence of increased O-GlcNAcylation level in several cancer cells. Moreover, inhibition ofOGT has been shown to reduce in vivo and in vitro tumor growth of breast cancer cells.However, the relationship between O-GlcNAcylation and the response to anti-cancer therapy hasnot been studied. Tamoxifen is the oldest and most prescribed selective-estrogen receptormodulator (SERM) for patients with estrogen receptor (ER)-positive breast cancer. Tamoxifen isknown to reduce tumor growth and invasion. Despite its beneficial effects de novo and acquiredresistance are great obstacles in its clinical effectiveness. We found that O-GlcNAc elevation inMCF-7 cells protected them from tamoxifen-induced cell death. Increased O-GlcNAc alsoincreased PI3-K/Akt signaling. However, the protective effect of PUGNAc+glucosamine fromtamoxifen-induced cell death is independent of PI3K/Akt pathway. Increased O-GlcNAcylationalso led to reduced ESR1 promoter activity and decreased expression of ERα at mRNA andprotein levels. The decrease in ERα expression is correlated with a reduced expression of twotamoxifen regulated genes i.e. early growth response 1 and p21 Waf1/Cip1. In conclusion, thisstudy showed for the first time the involvement of O-GlcNAcylation in reducing tamoxifen142sensitivity in MCF-7 cells. Thus, OGT can act as a novel therapeutic target for treatment oftamoxifen resistant cells.

Les démences séniles sont caractérisées, au niveau moléculaire, par l’agrégation de quelquesprotéines-clés. On peut donner comme exemple l’α-synucléine, dans la maladie de Parkinson,ou le peptide β-amyloïde et la protéine Tau, dans la maladie d’Alzheimer. Le mauvaisrepliement de ces protéines est souvent évoqué, même si elles n’adoptent pas une structurestable lorsqu’elles sont isolées en solution. La protéine Tau est une protéine neuronaleappartenant à la famille des protéines MAP (protéines associées aux microtubules). Saprincipale fonction est de stimuler la polymérisation de la tubuline en microtubules, assurantainsi le transport cytoplasmique au sein d’une cellule. Tau ainsi que des mutants de Tau ont étéimpliqués dans de nombreuses pathologies neurodégénératives regroupées sous le terme detauopathies, dont la plus connue est la maladie d’Alzheimer. Bien qu’aucune mutation de Taun’ait été décrite dans la maladie d’Alzheimer, Tau joue un rôle-clé dans cette pathologie. Elleest caractérisée par la présence d’agrégats fibrillaires de protéines Tau hyperphosphoryléesnommés PHF (Paired Helical Filaments) qui envahissent progressivement le cerveau. Cesobservations sont associées à un déséquilibre entre phosphorylation et déphosphorylation.Malgré les différentes études menées sur le sujet, le mécanisme d’agrégation n’est pas compriset plusieurs pistes sont envisagées, notamment l’implication des modifications posttraductionnelles.Nous avons déterminé le profil de modifications de la protéine Tau parspectroscopie RMN et étudier leur implication dans le processus d’agrégation parspectrophotométrie. Parmi les modifications covalentes existantes, nous avons étudiél’acétylation des résidus lysine et l'O-β-N-acétylglucosaminylation des résidus sérine etthréonine. La troisième est une modification conformationnelle qui consiste à stimulerl’échange conformationnel des prolines par des enzymes à activité peptidyl prolyl cis-transisomérase (PPIase). / Senile dementia are characterized by protein aggregation such as α-synuclein in Parkinsondisease or β-amyloid peptide and Tau protein in Alzheimer disease. Protein misfolding has beenevoked in the pathological processes even though these proteins do not adopt a stable threedimensionalstructure in solution. Tau protein belongs to the MAP (Microtubule-AssociatedProtein) family. It stimulates tubulin polymerization into microtubule allowing for cytoplasmictransport in cell. Tau and its mutated forms are found in neurodegenerative diseases,collectively referred to as tauopathy, the most famous being Alzheimer’s disease. Thesepathologies are characterized by fibrillary aggregates of hyperphosphorylated Tau namedPaired Helical Filaments (PHF) that invades gradually throughout the brain. These observationsare correlated with imbalance between phosphorylation and dephosphorylation in AD brains.Despites extensive studies, the aggregation mechanism is still not understood and severalpathways were considered, especially posttranslational modifications other thanphosphorylation. We have investigated the modifications of Tau protein by NMR spectroscopyand studied effect of these modifications on aggregation process by spectrophotometry. Amongcovalent modifications, we have studied lysine acetylation and Ser/Thr O-β-Nacétylglucosaminylation.The third investigated modification is the conformational switch ofproline residues catalyzed by a peptidyl prolyl cis trans isomerase.

Le cancer colorectal (CCR) est une pathologie dont les causes tiennent en partie d’un style de vie basé sur un régime alimentaire de type occidental et un mode de vie sédentaire. Cela implique par conséquent que le CCR soit associé à d’autres troubles métaboliques tels que l’obésité et le diabète. D’un consensus général on considère que le CCR est une maladie qui est mieux traitée si elle est dépistée relativement tôt ; malheureusement il n’existe toujours pas d’outils de diagnostic suffisamment fiables. A ce propos, différents types de glycosylation ont été proposés comme de potentiels biomarqueurs de cette maladie. Les travaux abordés dans cette thèse ont concerné l'influence de la O-GlcNAcylation (consistant en le transfert d'un seul monosaccharide de N-acétylglucosamine sur des résidus de sérine/thréonine de protéines cytoplasmiques, nucléaires et mitochondriales), sur la glycosylation complexe dans des lignées cellulaires coliques (HT29, HCT116 et CCD841CoN). La O-GlcNAcylation est intimement liée au statut nutritionnel, il est d’ailleurs proposé que son niveau soit plus élevé dans les pathologies métaboliques. Néanmoins il est clairement montré que les cellules et les tumeurs coliques expriment des niveaux plus élevés de O-GlcNAcylation. Plusieurs études ont montré que l’inhibition ou la délétion de la O-GlcNAc transférase (OGT), l’enzyme responsable des processus de O-GlcNAcylation, réduisait l'agressivité ou les propriétés associées au caractère tumoral dans différents modèles de cancer. Quelques études ont également montré que la sous-régulation de l’OGT se répercutait sur les glycosylations complexes : N- et O-glycanes, et glycosphingolipides (GSLs). La O-GlcNAcylation participe à des processus cellulaires clés tels que la transcription et la traduction. Dans une étude préliminaire, nous avons examiné les niveaux de transcrits de quatre-vingt-six glycosyltransférases et glycosidases dans des conditions de siOGT. Le siOGT a permis de constater que plusieurs de ces gènes étaient régulés positivement ou négativement, bien que parmi ces gènes seuls 10 étaient régulés négativement de manière significative. L'influence de l’OGT sur l’expression protéique de plusieurs glycosyltransférases a également été explorée. Nous avons ensuite utilisé plusieurs lectines en microscopie par fluorescence et en cytométrie en flux ainsi que la spectrométrie de masse (glycomique) afin d'élucider les structures complexes des glycanes et leur niveau d’expression dans les cellules coliques traitées par des siOGT. La diminution de O-GlcNAcylation n'a eu qu’un effet modéré sur les N- et O-glycanes globaux. Cependant, l'expression de plusieurs antigènes de surface a été modifiée par le siOGT. La E-cadhérine, un facteur majeur de la transition épithéliale-mésenchymateuse, a été régulée positivement dans les cellules HT29 traitées par le siOGT. De plus, les glycanes complexes portés par la E-cadhérine ont été eux-mêmes modifiés dans les cellules traitées par le siOGT. L'analyse MALDI des GSLs extraits de cellules HCT116 a révélé une altération significative de ces derniers dans les cellules siOGT, inversant le patron d’expression des GSLs décrits dans certaines cellules cancéreuses. Les GSLs des séries Globo, Gb3 et Gb4 ont été régulés à la hausse, tandis que les GSL gangliosidiques GM1a, GM2 et GD1a ont été régulés à la baisse. Cette étude démontre pour la toute première fois une relation entre la O-GlcNAcylation et les GSLs. Étant donné que les GSLs jouent un rôle important dans la reconnaissance cellulaire, la transduction du signal et d'autres propriétés de la surface cellulaire, ces observations pourraient expliquer en partir les changements phénotypiques liés au siOGT. De manière générale, une diminution de l’α2,3-sialylation est observée dans des conditions siOGT. Ces travaux sont les premiers à montrer un effet de la déplétion en OGT sur l’ensemble du glycome complexe, en particulier ceux s’exprimant à la surface des cellules. / Colorectal cancer (CRC) remains a major cause of health burden in Europe and in the western world. It is a disease of lifestyle with the western diet and a sedentary lifestyle widely implicated. This implicates CRC to be associated with other metabolic disorders like obesity and diabetes. The general consensus is that it is a disease that is hugely avoidable and treatable if detected early however reliable detection tools are still lacking. Glycosylation biomarkers have been proposed as potentially a new frontier against this disease. The work covered in this thesis pertains to the influence of O-GlcNAcylation (the transfer of a single N-acetyl glucosamine monosaccharide on serine/ threonine residues), on complex glycosylations in colon cells (HT29, HCT116 and CCD841CoN). O-GlcNAcylation is a nutrient sensor which conveys the metabolic state and indeed is aberrantly regulated in metabolic disease. CRC cells and tissues express higher levels of O-GlcNAcylation and an accompanying phenotype of high proliferation and aggressive tumours. There are numerous studies showing that silencing O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT), the enzyme that catalyses O-GlcNAcylation, decreases the aggressiveness or cancer-like properties in several cancer models. There is little evidence starting to accumulate that shows that in these siOGT cells or tissue there is also a change in other complex glycosylations (N-, O- or glycosphingolipids glycans). O-GlcNAcylation is known to participate in key cell processes like transcription and translation. In this preliminary work, we look at the transcriptomic expression of eighty-six glycosyl transferases and glycosidases gene transcripts when OGT is silenced. Silencing OGT resulted in several of these genes being upregulated or downregulated but only 10 genes were significantly downregulated. The translational influence of OGT on several glycosyl transferases was also explored. We used several techniques namely; fluorescent lectin microscopy, lectin aided FACS analysis and several mass spectrometry techniques (glycomics), to study the complex glycan structures and expression in siOGT colon cells. Silencing O-GlcNAcylation has little effect on the global N- and O-glycans as elucidated by glycomic profiling. However, cell surface expression of several glyco-antigens was altered in siOGT. E-cadherin, a major influencer of the epithelial-to-mesenchymal transition, is upregulated in siOGT transfected HT29 cells. Furthermore, the complex glycans it carries are altered in the process. This could in part explain some of the siOGT phenotypes noted in other studies. Using MALDI mass spectrometry analysis, in HCT116 cells we found that glycosphinogolipid (GSL) expression is altered significantly in siOGT HCT116 cells. There is a reversal of some known cancerous GSL patterns; Globo series, Gb3 and Gb4 GSLs were upregulated, while ganglioside GSLs GM1a, GM2 and GD1a are downregulated. This is the first time an association has been made between O-GlcNAcylation and GSLs. As GSLs play an important part in cell recognition, signal transduction and other cell surface properties this may be one of the key links with the siOGT phenotype. All together there is a decrease in several α2,3-sialylated glycans when OGT is silenced. For the first time in scientific literature we show the global glycan effect of silencing OGT on the expression of complex glycans particularly at the cell surface, adding several new findings.

La O-GlcNAcylation est une glycosylation dynamique et réversible sous le contrôle de la O-GlcNAc Transférase (OGT) qui transfère un résidu de GlcNAc sur les Ser/Thr de protéines intracellulaires, et de la O-GlcNAcase (OGA). Plusieurs travaux dont ceux de notre équipe ont montré l'importance de la dynamique de O-GlcNAcylation pour la progression normale du cycle cellulaire, et plus particulièrement de la mitose. L’objectif de mes travaux de thèse était de comprendre comment la balance O-GlcNAc participe au contrôle des étapes précoces du cycle cellulaire. J’ai d’abord montré dans différentes lignées cellulaires que l’entrée en phase S s’accompagne d’une baisse marquée du niveau de O-GlcNAc, corrélée à une augmentation de l’expression et de l’activité de l’OGA endogène. Par protéomique, 58 protéines cytosoliques et nucléaires différentiellement O-GlcNAcylées à la transition G1/S ont ensuite été identifiées dans les cellules MCF7 synchronisées. Ces protéines interviennent dans des processus cellulaires essentiels à la phase G1 dont la régulation de la transcription, de la traduction et de la mise en conformation des protéines, et de la réplication de l’ADN. Par immunoprécipitation, les variations O-GlcNAc dépendantes du cycle cellulaire ont été confirmées sur les protéines cytosoliques CK8, hnRNP K et Caprine 1, et sur les protéines nucléaires du complexe de pré-réplication, MCM-3, -4, -6, et -7. Ces travaux montrent donc que la transition G1/S est étroitement liée à la dynamique de O-GlcNAcylation et soulignent un rôle potentiel de cette glycosylation dans le contrôle de l’initiation de la réplication de l’ADN et par là même, dans le maintien de l'intégrité génomique. / O-GlcNAcylation is a highly dynamic and reversible glycosylation which is governed by O-GlcNAc Transferase (OGT) that transfers the N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue onto Ser/Thr of intracellular proteins, and O-GlcNAcase (OGA). Over the last decade, we and others have shown that dynamics of O-GlcNAcylation was important in regulating the cell cycle progression, and more particularly the mitosis events. The aim of my work was to explore how O-GlcNAc balance is implicated in the control of cellular proliferation by focusing on the early steps in the cell cycle. We highlighted in several cell lines that S-phase entry is associated with a marked decrease in the overall level of O-GlcNAcylated proteins, concordant with an increase in both the expression and activity of endogenous OGA. Then, using a proteomic approach we identified 58 cytoplasmic and nuclear proteins differentially O-GlcNAcylated between G0, G1 and S phases. These proteins are involved in key cellular functions that are essential for G1 and S progression, such as protein folding and translation, transcription or DNA replication. By immunoprecipitation, we further confirmed the cell cycle-dependent O-GlcNAc variations of CK8, hnRNP K, Caprin-1, and MCM -3, -4, -6, and -7 proteins which are part of the pre-replicative complex. To conclude, this study shows that there is a close link between the dynamics of O-GlcNAc and G1/S transition and provides a descriptive overview of differentially O-GlcNAcylated proteins at the G1/S transition, highlighting a potential role of O-GlcNAcylation in the initiation of DNA synthesis and therefore, in the maintenance of genome integrity.

Une mauvaise hygiène alimentaire et certains désordres métaboliques sont décrits depuis plusieurs années comme des facteurs de risque majeurs du cancer colorectal. Néanmoins, les mécanismes moléculaires reliant ces facteurs à la cancérisation colique et rectale restent mal compris. Pour tenter de comprendre la relation entre ces deux pathologies, nous nous sommes focalisés sur une voie de signalisation essentielle à l’initiation tumorale colique, la voie Wnt/β-caténine et particulièrement sur la β-caténine, protéine central de cette voie. Depuis près de 30 ans, un concept de nouveau « senseur métabolique » a fait son apparition avec la découverte de la O-GlcNAcylation des protéines. Cette découverte majeure a permis d’entrevoir de nouveaux modes de régulation des protéines intracellulaires, directement dépendante des changements en glucose extracellulaire, observés notamment lors de nombreux désordres métaboliques. Nous avons démontré que la O-GlcNAcylation engendrait la stabilisation de la β-caténine, en modifiant son extrémité N-terminale (S23, T40, T41 et T112). Cette stabilisation, associée à son interaction avec la O-GlcNAc Transférase, permet, via une activité transcriptionnelle accrue de la β-caténine, d’augmenter l’activité proliférative des cellules en culture. De plus, le régime alimentaire temporaire ou à long terme permet également d’augmenter de manière permanente la stabilité de la β-caténine. Cette stabilisation par O-GlcNAcylation de la β-caténine, dépendante du statut nutritionnel de la cellule, pourrait donc influencer la prolifération des cellules épithéliales coliques et s’ajouterait ainsi à la séquence de développement des cancers colorectaux. / For many years, feeding and metabolic disorders are described as key risk factors for colorectal cancer emerging. Nevertheless, molecular mechanisms connecting these factors to colorectal cancerization remain misunderstood. Trying to understand this relation, we focused on the Wnt/β-catenin pathway, the main signaling pathway involved in this process, and more particularly on β-catenin, the key protein of this pathway. Since 30 years now, a new “metabolic sensor” concept appears with protein’s O-GlcNAcylation discovery. This major progress let us foresee new way of intracellular proteins regulation, directly dependent on glucose rate change, a phenomenon observed in numerous metabolic disorders. We have demonstrated that O-GlcNAcylation leads to β-catenin stabilization, by modifying its N-terminal extremity (S23, T40, T41 and T112). This stabilization, associated with O-GlcNAc Transferase interaction, increases the proliferative state of cells, through an increase transcriptional activity of β-catenin. Moreover, temporary or long-term diets also increase permanently the stability of β-catenin. This stabilization, through β-catenin O-GlcNAcylation dependent of cell nutrient status, could impact onto epithelial cell proliferation and create a novel step in colorectal cancer sequence.

Un des acteurs essentiels de la réplication de l’ADN est le complexe MCM2-7. Ce complexe est composé de 6 protéines (MCM2 à MCM7) organisées en hexamères qui sont recrutés aux origines de réplication pendant la phase G1. Le complexe MCM2-7 possède une activité hélicase permettant la formation des fourches de réplication et le recrutement des ADN polymérases. L’arrimage à la chromatine et l’activité du complexe MCM2-7 doivent être finement contrôlés notamment par des interactions avec différents partenaires protéiques et par un ensemble de modifications post-traductionnelles (MPTs). Des travaux de l’équipe ont identifié la O-GlcNAcylation comme une nouvelle MPT sur certaines protéines MCM. C’est une glycosylation dynamique et réversible des protéines nucléocytoplasmiques et mitochondriales, gouvernée par la O-GlcNAc transférase (OGT) et la O-GlcNAcase (OGA). Lors de mes travaux de thèse j’ai cherché à comprendre le rôle de la O-GlcNAcylation sur le complexe MCM2-7 dans des lignées cellulaires humaines. J’ai démontré que toutes les MCM sont O-GlcNAcylées et que cette modification n’intervient que sur la fraction des MCM liées à l’ADN. Mes travaux montrent que l’OGT interagit avec certaines sous-unités MCM et que l’extinction de l’expression de l’OGT diminue la fixation à la chromatine des MCM2, 6 et 7. Enfin, la perturbation de la dynamique O-GlcNAc déstabilise les interactions entre les sous-unités MCM2/6, MCM4/7 et MCM4/6. L’ensemble de mes travaux montre que l’OGT est un nouveau partenaire du complexe MCM2-7 dans les cellules humaines, et suggère que l’homéostasie de O-GlcNAcylation pourrait réguler le maintien du complexe MCM2-7 à la chromatine. / The MCM2-7 complex is one of the major players for regulating the DNA replication. MCM2-7 contains six evolutionarily conserved subunits (MCM2 to MCM7) which bind together to form a hexameric complex. The MCM2-7 complex is progressively loaded onto chromatin to licence origins of replication during G1 phase, and forms the core of the replicative helicase necessary to fuel the unwinding of double-stranded DNA at the replication fork, allowing the loading of the DNA polymerases. The MCM2-7 helicase must be tightly regulated through interactions with specific protein partners and also by post-translational modifications (PTMs). In our team, O-GlcNAcylation has previously been identified as a new PTM of several MCM2-7 subunits. It is a dynamic and reversible glycosylation of nucleocytoplasmic and mitochondrial proteins, and is governed by O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). The aim of my thesis was to decipher the role of O-GlcNAcylation on the MCM2-7 complex in human cells. I show that each MCM subunit is O-GlcNAcylated mainly in the chromatin-bound protein fraction of cells. Moreover, my results show that OGT stably interacts with several MCM proteins and OGT down-regulation induces a decrease in the chromatin loading of MCM2, 6 and 7. Finally, I show that perturbation of O-GlcNAc cycling destabilizes interactions between MCM2/6, MCM4/7 and MCM4/6 subunits. To conclude, my results show that OGT is a new partner of the MCM2-7 replicative helicase complex in human cells, and suggest that O-GlcNAc homeostasis might be essential to ensure the maintenance of the MCM2-7 complex onto chromatin during DNA replication.

Après un repas, la glycolyse, la lipogenèse et particulièrement 2 enzymes sont sollicitées : la GlucoKinase (GK) et la Fatty Acid Synthase (FAS) augmentant la biosynthèse des acides gras (AG). Une autre voie du glucose conduit à la O-GlcNAc, glycosylation assurée par l’OGT et l’OGA. Au vu de la relation entre le glucose, la O-GlcNAc et le métabolisme glucido-lipidique, la O-GlcNAc contrôle probablement l'expression et l'activité de la GK et de la FAS. L’objectif a été de caractériser la O-GlcNAc des 2 enzymes et l’impact de la modification sur leurs propriétés. Les niveaux de O-GlcNAc, de GK et de FAS ont été mesurés dans différents modèles : des foies et des hépatocytes primaires de souris et des lignées cellulaires hépatiques cultivés dans des conditions de O-GlcNAc variables. Nous démontrons que la FAS et la GK sont O-GlcNAc en fonction des conditions nutritionnelles, en corrélation avec une meilleure stabilité de la protéine. Un lien existerait entre l’apport excessif de glucose, l’augmentation de O-GlcNAc et la production d’AG conduisant à la stéatose. Les perspectives sont l’étude de la régulation de la FAS par O-GlcNAc au cours du cycle cellulaire. La FAS est primordiale dans la biosynthèse d’AG, composants majeurs des membranes plasmiques. Par conséquent, elle est dérégulée en cas de prolifération cellulaire anormale, caractéristique des cellules cancéreuses. Ce défaut de prolifération est accompagné d’une augmentation de la FAS, de l’OGT et des protéines O-GlcNAc. Nos premiers résultats montrent que l’expression de la FAS varie au cours du cycle. L’OGT y joue probablement un rôle puisque son inhibition dérégule les variations de la FAS au cours du cycle cellulaire. / After a meal, the glycolysis, the lipogenesis and particularly two enzymes are activated: Glucokinase (GK) and Fatty Acid Synthase (FAS) causing an increase in fatty acid biosynthesis. Another pathway of glucose leads to O-GlcNAc, glycosylation catalysed by O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). In view of the relationship between glucose levels, O-GlcNAc and the glucido-lipidic metabolism, the O-GlcNAc would regulate the expression and activity of GK and FAS. The aim was to characterize O-GlcNAc of GK and FAS, and the impact of this modification on their properties. O-GlcNAc, GK and FAS levels were measured in various models: livers and primary hepatocytes of mouse and liver cell lines cultured in conditions that modulate O- GlcNAc levels.We demonstrated that FAS and GK are O-GlcNAc depending on nutritional conditions in correlation with a better stability of proteins. It must exist a link between an excessive intake of glucose, increased levels of O-GlcNAc and abundant fatty acid production leading to hepatic steatosis. In the perspectives, we focused on the regulation of FAS expression by O-GlcNAc during the cell cycle. Indeed, FAS plays a pivotal role in the biosynthesis of biological membranes fatty acids. Accordingly, FAS may be dysregulated in abnormal cell proliferation, a major characteristic of cancer cells. In addition, these cells exhibit an overall increase of OGT expression and O-GlcNAc protein. Our initial results suggest that FAS has a variable expression during cell cycle. In addition, OGT and O-GlcNAc may play a role since the use of an OGT inhibitor deregulate changes in the FAS expression in different phases of the cycle.