La O-GlcNAcylation est une glycosylation dynamique et réversible sous le contrôle de la O-GlcNAc Transférase (OGT) qui transfère un résidu de GlcNAc sur les Ser/Thr de protéines intracellulaires, et de la O-GlcNAcase (OGA). Plusieurs travaux dont ceux de notre équipe ont montré l'importance de la dynamique de O-GlcNAcylation pour la progression normale du cycle cellulaire, et plus particulièrement de la mitose. L’objectif de mes travaux de thèse était de comprendre comment la balance O-GlcNAc participe au contrôle des étapes précoces du cycle cellulaire. J’ai d’abord montré dans différentes lignées cellulaires que l’entrée en phase S s’accompagne d’une baisse marquée du niveau de O-GlcNAc, corrélée à une augmentation de l’expression et de l’activité de l’OGA endogène. Par protéomique, 58 protéines cytosoliques et nucléaires différentiellement O-GlcNAcylées à la transition G1/S ont ensuite été identifiées dans les cellules MCF7 synchronisées. Ces protéines interviennent dans des processus cellulaires essentiels à la phase G1 dont la régulation de la transcription, de la traduction et de la mise en conformation des protéines, et de la réplication de l’ADN. Par immunoprécipitation, les variations O-GlcNAc dépendantes du cycle cellulaire ont été confirmées sur les protéines cytosoliques CK8, hnRNP K et Caprine 1, et sur les protéines nucléaires du complexe de pré-réplication, MCM-3, -4, -6, et -7. Ces travaux montrent donc que la transition G1/S est étroitement liée à la dynamique de O-GlcNAcylation et soulignent un rôle potentiel de cette glycosylation dans le contrôle de l’initiation de la réplication de l’ADN et par là même, dans le maintien de l'intégrité génomique. / O-GlcNAcylation is a highly dynamic and reversible glycosylation which is governed by O-GlcNAc Transferase (OGT) that transfers the N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue onto Ser/Thr of intracellular proteins, and O-GlcNAcase (OGA). Over the last decade, we and others have shown that dynamics of O-GlcNAcylation was important in regulating the cell cycle progression, and more particularly the mitosis events. The aim of my work was to explore how O-GlcNAc balance is implicated in the control of cellular proliferation by focusing on the early steps in the cell cycle. We highlighted in several cell lines that S-phase entry is associated with a marked decrease in the overall level of O-GlcNAcylated proteins, concordant with an increase in both the expression and activity of endogenous OGA. Then, using a proteomic approach we identified 58 cytoplasmic and nuclear proteins differentially O-GlcNAcylated between G0, G1 and S phases. These proteins are involved in key cellular functions that are essential for G1 and S progression, such as protein folding and translation, transcription or DNA replication. By immunoprecipitation, we further confirmed the cell cycle-dependent O-GlcNAc variations of CK8, hnRNP K, Caprin-1, and MCM -3, -4, -6, and -7 proteins which are part of the pre-replicative complex. To conclude, this study shows that there is a close link between the dynamics of O-GlcNAc and G1/S transition and provides a descriptive overview of differentially O-GlcNAcylated proteins at the G1/S transition, highlighting a potential role of O-GlcNAcylation in the initiation of DNA synthesis and therefore, in the maintenance of genome integrity.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

STAUFEN1 (STAU1) est une protéine de liaison à l’acide ribonucléique (ARN) double brin jouant un rôle important dans le contrôle post-transcriptionnel de nombreux ARN messager (ARNm). Sa déplétion diminue la prolifération des cellules non cancéreuses en altérant les transitions G1/S et G2/M. En revanche, Ceci n’a aucun impact sur la prolifération des cellules tumorales. La déplétion de STAU1 module le niveau d’expression des transcrits et/ou des protéines impliquées dans la régulation des points de contrôle des transitions de phase. Notamment, STAU1 module le niveau d’expression de la protéine CDK4 ainsi que l’abondance de l’ARNm E2F1, deux régulateurs indispensables de la transition G1/S. Le transcrit de ces deux gènes possède un site de liaison à STAU1 ou STAU1 binding site (SBS) dans la région codante ou coding sequence (CDS) et dans la région non codante en 3’ (3’UTR), respectivement. Cependant, l’importance de la liaison de STAU1 à ces transcrits n’a pas encore été étudiée. Étonnamment, la sensibilité des cellules non tumorales et tumorales à l’expression de STAU1 est inversée lors de la surexpression de STAU1. En effet, sa surexpression altère l’entrée en mitose des cellules cancéreuses et diminue leur prolifération, alors qu’elle n’a aucun effet sur la prolifération des cellules non tumorales. Lors de la mitose, STAU1 s’associe au fuseau mitotique (FM), ce qui lui permet de localiser des ARNm et de contrôler leur séquestration et/ou leur traduction locale. Cependant, le mécanisme qui permet à STAU1 de lier le FM est encore inconnu. Pour ce mémoire, nous avons donc poursuivi deux objectifs. Le premier but est de comprendre la régulation post-transcriptionnelle médiée par STAU1 des transcrits essentiels à la transition G1/S chez les cellules non tumorales. Notre hypothèse est que STAU1 par sa liaison directe à ses transcrits cibles via le SBS module leur expression. Pour ce faire, des cellules de type sauvage ou déplétées en STAU1 étaient transfectées par des plasmides exprimant les transcrits de CDK4 et d’E2F1 contenant un SBS endogène ou muté de telle sorte qu’il ne reconnait plus STAU1. L’expression des protéines CDK4 et E2F1 est dosée par un essai luciférase ou un immunobuvardage de type western ou western blot (WB). Nous avons observé que STAU1 régule négativement et positivement l’expression endogène de CDK4 et d’E2F1, respectivement, ce qui contribue au passage de la transition G1/S, donc à la prolifération cellulaire non tumorale. Les essais luciférases ont confirmé le rôle de STAU1 dans la régulation positive d’E2F1 lorsque liée au SBS dans le 3’UTR du transcrit E2F1. Malheureusement, les plasmides utilisés pour l’expression de CDK4 se sont avérés non fonctionnels, ce qui nous a forcés à mettre de côté cette expérience. Le deuxième but est d’étudier les déterminants qui régulent la localisation de STAU1 au FM chez les cellules tumorales. Pour ce faire, la localisation de STAU1 ou des mutants au FM est détectée par WB à partir de préparations des FM purifiés. Nos données montrent que le déterminant est composé de plusieurs acides aminés (aa) situés entre le 26ème et 37ème aa du côté N-terminal de la protéine STAU1. En somme, nos résultats montrent les différents rôles de STAU1 dans les cellules tumorales vs cellules non tumorales. De ce fait, STAU1 pourrait être une cible thérapeutique spécifique potentielle dans le traitement du cancer. / STAUFEN1 (STAU1) is a double stranded RNA binding protein that plays an important role in the post-transcriptional control of many mRNAs. Its depletion decreases the proliferation of non-cancer cells by altering G1/S and G2/M transitions. In contrast, this has no impact on the proliferation of tumor cells. The decrease of STAU1 expression modulates the level of transcripts/proteins of several genes involved in phase transition checkpoints, including CDK4 and E2F1, two essential regulators in G1/S transition. In addition, CDK4 and E2F1 transcripts have a STAU1 binding site (SBS) in the coding sequence (CDS) and the non-coding region in 3’ (3’UTR), respectively. However, the molecular consequence of STAU1 association with the SBS is not yet studied. Surprisingly, the sensibility of non-cancer and cancer cells to STAU1 expression is reversed following STAU1 overexpression. Indeed, its overexpression alters the entry into mitosis of cancer cells and decreases their proliferation, while it has no effect on non-cancer cells. During mitosis, STAU1 associates with the mitotic spindle, which allows it to localize mRNAs and other non-coding RNAs. STAU1 likely controls their sequestration and/or local translation during mitosis. However, the molecular determinant involved in STAU1-spindle association is still not known. Therefore, for this master thesis, we had two objectives. The first goal is to understand the post-transcriptional regulation mediated by STAU1 on transcripts that are essential for G1/S transition in non-tumor cells. Our hypothesis is that STAU1, by its direct binding to the SBS of its target transcripts, modulates their expression. To do this, plasmids coding for CDK4 and E2F1 containing a wild-type or mutated SBS that does not recognized STAU1 were transfected in wild-type and STAU1-depleted cells. Expression of CDK4 and E2F1 was detected by dual luciferase assay and western blot (WB). Our results first indicate that STAU1 negatively and positively regulates the endogenous expression of CDK4 and E2F1, respectively, which contributes to the passage of G1/S transition, and therefore to the proliferation non-tumor cells. Then, the luciferase assays confirm the role of STAU1 in E2F1 expression, depending on STAU1 binding to E2F1 SBS in its 3’UTR. Unfortunately, the plasmids used for CDK4 expression turned out to be non-functional. The second goal is to identify the molecular determinants responsible for the localization of STAU1 to the mitotic spindle in tumor cells. To this end, the localization of STAU1 or of several mutants was measured by WB using purified spindle preparations. Our data show that the determinant is composed of several amino acids (aa) located between the 26th and 37th aa at the N-terminal end of STAU1. In summary, our results show the different roles of STAU1 in tumor and non-tumor cells. Therefore, STAU1 could be a potential specific therapeutic target in cancer treatments.

L’acétylation est une modification post-traductionnelle des protéines essentielles. Elle est impliquée dans bon nombre de processus cellulaires importants comme la régulation de la structure de la chromatine et le recrutement de protéines. Deux groupes d’enzymes, soient les lysines acétyltransférases et les lysines désacétylases, régulent cette modification, autant sur les histones que sur les autres protéines. Au cours des dernières années, de petites molécules inhibitrices des désacétylases ont été découvertes. Certaines d’entre elles semblent prometteuses contre diverses maladies telles le cancer. L’acide valproïque, un inhibiteur de deux des trois classes des désacétylases, a un effet antiprolifératif chez plusieurs organismes modèles. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à cet effet restent encore méconnus. Ce mémoire met en lumière l’effet pH dépendant de l’acide valproïque sur différentes voies cellulaires importantes chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Il démontre que ce composé a la capacité d’inhiber la transition entre les phases G1 et S par son action sur l’expression des cyclines de la phase G1. De plus, il inhibe l’activation de la kinase principale de la voie activée suite à un stress à la paroi cellulaire. L’acide valproïque occasionne également un arrêt dans la réplication de l’ADN sans y causer de dommage. Il s’agit là d’un effet unique qui, à notre connaissance, n’est pas observable avec d’autres agents qui inhibent la progression en phase S. / Acetylation is an essential post-translational modification involved in many important cellular processes such as regulation of chromatin structure and proteins interactions. Two enzyme families, lysine acetyltransferases and lysine deacetylases, allow proper regulation of this modification both on histones and non-histones proteins. In recent years, the discovery of small deacetylase inhibitors has led to promising novel therapy in the treatment against various diseases such as cancer. Valproic acid, a class I and II deacetylase inhibitor, has been shown to have antiproliferative effects in various models. However, the cellular mechanisms underlying this effect remain unknown. This thesis highlights the pH-dependent effects of VPA on numerous important cellular pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Our results demonstrate that VPA inhibits the transition from G1 to S phase of the cell cycle by its action on the expression of G1 cyclins. Moreover, VPA inhibits the activation of the main kinase involved in the cell wall integrity pathway. Furthermore, VPA exposure also leads to DNA replication arrest in a DNA damage-independent manner. This is a unique effect that, to our knowledge, is not observable with other agents that inhibit S phase progression.