La protéine multi-adaptatrice GAB1 (GRB2-associated binder-1) est essentielle pour transmettre la signalisation et les réponses biologiques du récepteur tyrosine kinase MET activé par son ligand, l’HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor), et joue un rôle positif dans de nombreuses autres voies de signalisation cellulaires. Son implication majeure dans la signalisation HGF/SF-MET s’explique par le fait que GAB1 est un partenaire direct de MET, notamment via un domaine d’interaction spécifique avec la partie C-terminale de MET, tandis que GAB1 est un acteur moléculaire indirect pour d’autres récepteurs, y compris certains portant également une activité tyrosine kinase. Au cours de ma thèse, nous avons documenté par des approches d’extinction de l’expression de GAB1 (siRNA) dans divers types cellulaires, son rôle indispensable dans la signalisation HGF/SF-MET, à la fois pour l’induction des voies Ras/ERK et PI3K/Akt. Ces résultats sont en accord avec les travaux permettant de conclure que GAB1 amplifie la signalisation HGF/SF-MET. De manière originale, nous avons montré que GAB1 joue également un rôle important dans des conditions conduisant à l’inactivation de la signalisation HGF/SF-MET. D’une part, nous avons établi que suite à l’activation de MET par l’HGF/SF, le récepteur induit la dégradation de GAB1 par le système ubiquitine-protéasome et que ce processus participe activement à la régulation négative de l’activation de la voie Ras/ERK. D’autre part, nous avons démontré que GAB1, comme MET, est une cible fonctionnelle des caspases activées lors de stress apoptogènes. Lors d’un stress modéré, des clivages caspases-dépendants de GAB1 conduisent à la génération d’un fragment stable, p35-GAB1, contenant le domaine d’interaction avec MET et présentant une activité anti-apoptotique liée notamment à sa capacité à maintenir l’activation de la voie de survie PI3K/Akt. Lors de stress extrêmes ou prolongés, il est possible que p35-GAB1 présente une activité pro-apoptotique. Nous avons donc mis en évidence que GAB1 occupe une place primordiale dans la signalisation HGF/SF-MET à la fois pour transmettre et pour réguler en retour ces signaux de transduction en fonction du contexte cellulaire.Pour conclure, il est clair que la signalisation HGF/SF-MET joue un rôle physiologique essentiel et sa dérégulation est associée à la progression tumorale et métastatique de nombreux cancers. En accord avec notre démonstration de la contribution majeure de GAB1 dans tous les aspects de la signalisation HGF/SF-MET, il est envisageable que GAB1 puisse contribuer à la tumorigenèse dépendante de l’activation du récepteur MET et représenter, de ce fait, une cible d’intérêt pour de nouvelles approches thérapeutiques anti-cancéreuses. / The docking protein GAB1 (GRB2-associated binder-1) is essential for transmitting signals and biological responses of the MET receptor tyrosine kinase activated by its ligand, HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor), and plays a positive role in many other cell signaling pathways. Its major involvement in HGF/SF-MET signaling can be explained by the fact that GAB1 is a direct partner of MET, in particular through a specific interaction domain with the C-terminus of MET, while GAB1 is an indirect molecular player for other receptors, including some of them with intrinsic tyrosine kinase activity.During my thesis work, we have documented through RNA interference-mediated extinction of GAB1 expression in various cell types, its crucial role in HGF/SF-MET signaling, both for the induction of Ras/ERK and PI3K/Akt pathways. These results are consistent with other data supporting the conclusion that GAB1 amplifies HGF/SF-MET signaling. In an original way, we have shown that GAB1 also plays an important role in conditions leading to the inactivation of HGF/SF-MET signaling. First, we demonstrated that, following its activation by HGF/SF, MET receptor induces GAB1 ubiquitin-proteasome-mediated degradation and that this process is actively involved in the down-regulation of Ras/ERK pathway downstream of MET. Furthermore, in line with our previous demonstrations that the MET receptor is a functional target of caspases, we established that GAB1 is also degraded and cleaved by caspases in response to stress. Under mild stress conditions, caspase-dependent cleavages of GAB1 lead to the generation of a stable fragment, p35-GAB1, containing the MET binding domain and exhibiting anti-apoptotic functions due to its ability to maintain activation of the PI3K/Akt survival pathway. In case of extreme or prolonged stress, it is possible that p35-GAB1 shows a pro-apoptotic activity. We have therefore highlighted that GAB1 plays a key role in HGF/SF-MET signaling for both transmit and feedback regulate signal transduction, depending on cellular context.Finally, it is clear that HGF/SF-MET signaling plays an essential physiological role and its deregulation is associated with tumor progression and metastasis of many cancers. According to our demonstration of the major contribution of GAB1 in all aspects of HGF/SF-MET signaling, it is possible that GAB1 may contribute to MET receptor activation-dependent tumorigenesis and thus, represent a target of interest for new anti-cancer therapeutic approaches.

Une mauvaise hygiène alimentaire et certains désordres métaboliques sont décrits depuis plusieurs années comme des facteurs de risque majeurs du cancer colorectal. Néanmoins, les mécanismes moléculaires reliant ces facteurs à la cancérisation colique et rectale restent mal compris. Pour tenter de comprendre la relation entre ces deux pathologies, nous nous sommes focalisés sur une voie de signalisation essentielle à l’initiation tumorale colique, la voie Wnt/β-caténine et particulièrement sur la β-caténine, protéine central de cette voie. Depuis près de 30 ans, un concept de nouveau « senseur métabolique » a fait son apparition avec la découverte de la O-GlcNAcylation des protéines. Cette découverte majeure a permis d’entrevoir de nouveaux modes de régulation des protéines intracellulaires, directement dépendante des changements en glucose extracellulaire, observés notamment lors de nombreux désordres métaboliques. Nous avons démontré que la O-GlcNAcylation engendrait la stabilisation de la β-caténine, en modifiant son extrémité N-terminale (S23, T40, T41 et T112). Cette stabilisation, associée à son interaction avec la O-GlcNAc Transférase, permet, via une activité transcriptionnelle accrue de la β-caténine, d’augmenter l’activité proliférative des cellules en culture. De plus, le régime alimentaire temporaire ou à long terme permet également d’augmenter de manière permanente la stabilité de la β-caténine. Cette stabilisation par O-GlcNAcylation de la β-caténine, dépendante du statut nutritionnel de la cellule, pourrait donc influencer la prolifération des cellules épithéliales coliques et s’ajouterait ainsi à la séquence de développement des cancers colorectaux. / For many years, feeding and metabolic disorders are described as key risk factors for colorectal cancer emerging. Nevertheless, molecular mechanisms connecting these factors to colorectal cancerization remain misunderstood. Trying to understand this relation, we focused on the Wnt/β-catenin pathway, the main signaling pathway involved in this process, and more particularly on β-catenin, the key protein of this pathway. Since 30 years now, a new “metabolic sensor” concept appears with protein’s O-GlcNAcylation discovery. This major progress let us foresee new way of intracellular proteins regulation, directly dependent on glucose rate change, a phenomenon observed in numerous metabolic disorders. We have demonstrated that O-GlcNAcylation leads to β-catenin stabilization, by modifying its N-terminal extremity (S23, T40, T41 and T112). This stabilization, associated with O-GlcNAc Transferase interaction, increases the proliferative state of cells, through an increase transcriptional activity of β-catenin. Moreover, temporary or long-term diets also increase permanently the stability of β-catenin. This stabilization, through β-catenin O-GlcNAcylation dependent of cell nutrient status, could impact onto epithelial cell proliferation and create a novel step in colorectal cancer sequence.

HIF1α et HIF2α sont des protéines largement impliquées dans le développement de pathologies posant des problèmes majeurs de santé publique, comme le cancer. Leur activité, qui est régulée prioritairement par leur stabilité via le système ubiquitine-protéasome, coordonne de nombreux processus cellulaires susceptibles de favoriser le développement de ces maladies. Un enjeu récent de la recherche thérapeutique est d’identifier des partenaires protéiques pouvant réguler les protéines HIFα, afin de mettre au point des thérapies ciblées. Les protéines de choc thermique (HSPs) sont une classe de protéines dont une des fonctions essentielles est de réguler l’homéostasie protéique dans la cellule, en interagissant avec le protéasome. Certaines d’entre elles, HSP27 et HSP90, ont la faculté de pouvoir réguler spécifiquement la stabilité de nombreuses protéines souvent elles-mêmes impliquées dans l’apparition de ces pathologies. L’objectif de ce travail était de savoir si ces deux HSPs peuvent contrôler la stabilité de la protéine HIF2α. Nos résultats suggèrent qu’HSP27 pourrait stimuler la dégradation de HIF2α en favorisant son ubiquitination. Ce résultat est surprenant, en raison du rôle connu d’HSP27 dans la progression tumorale. Il est donc nécessaire de le confirmer et d’en préciser les processus biologiques sous-jacents. D’autre part, nos autres résultats semblent confirmer qu’HIF2α est une protéine cliente d’HSP90. De plus, nous montrons pour la première fois que l’inhibition d’HSP90 par le 17-DMAG diminue la production de VEGF dépendante de HIF2α. Des travaux récents suggèrent qu’HIF2α a un rôle prédominant dans la progression tumorale, et peut constituer une cible globale de choix dans plusieurs types de cancer. Il conviendrait d’évaluer la capacité des inhibiteurs d’HSP90 à supprimer des fonctions de HIF2α nouvellement décrites, comme son rôle dans la maintenance des cellules souches cancéreuses. / Both HIF1α and HIF2α proteins are highly involved in the development of pathologies, such as cancers, which are prime public health issues. These proteins are primarily controlled at the protein level by ubiquitin-dependant degradation, and regulate numerous cellular processes which are likely to favor the development of these diseases. A recent issue in therapeutic research is to identify partners that might regulate the expression and the activity of the HIFα proteins, with the aim to elaborate targeted therapies. Heat shock proteins (HSPs) form a family of proteins whose main function is to regulate protein homeostasis in cells, which they achieve through interaction with the ubiquitin-proteasome pathway. HSP27 and HSP90 are able to specifically control the stability of certain client proteins involved in those pathologies. In the present work, we sought to determine whether these HSPs could regulate the expression of the HIF2α protein. Our results suggest that HSP27 may induce ubiquitin and proteasome-dependant degradation of HIF2α, which is quite intriguing given the well-known role of HSP27 in tumor promotion. This needs to be confirmed and the underlying biological significance of such a regulation remains to be defined. Our results also may confirm that HIF2α is an HSP90 client protein. Moreover, we show for the first time that inhibition of HSP90 by 17-DMAG decreases the HIF2α-dependant VEGF production. Recent studies emphasize HIF2α as a major promoter of tumor progression, and suggest that HIF2α may constitute an attractive global target in several cancer types. Therefore, the ability of HSP90 inhibitors to disrupt newly described HIF2α functions, such as cancer stem cell maintenance, should be evaluated.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.

HIF1α et HIF2α sont des protéines largement impliquées dans le développement de pathologies posant des problèmes majeurs de santé publique, comme le cancer. Leur activité, qui est régulée prioritairement par leur stabilité via le système ubiquitine-protéasome, coordonne de nombreux processus cellulaires susceptibles de favoriser le développement de ces maladies. Un enjeu récent de la recherche thérapeutique est d'identifier des partenaires protéiques pouvant réguler les protéines HIFα, afin de mettre au point des thérapies ciblées. Les protéines de choc thermique (HSPs) sont une classe de protéines dont une des fonctions essentielles est de réguler l'homéostasie protéique dans la cellule, en interagissant avec le protéasome. Certaines d'entre elles, HSP27 et HSP90, ont la faculté de pouvoir réguler spécifiquement la stabilité de nombreuses protéines souvent elles-mêmes impliquées dans l'apparition de ces pathologies. L'objectif de ce travail était de savoir si ces deux HSPs peuvent contrôler la stabilité de la protéine HIF2α. Nos résultats suggèrent qu'HSP27 pourrait stimuler la dégradation de HIF2α en favorisant son ubiquitination. Ce résultat est surprenant, en raison du rôle connu d'HSP27 dans la progression tumorale. Il est donc nécessaire de le confirmer et d'en préciser les processus biologiques sous-jacents. D'autre part, nos autres résultats semblent confirmer qu'HIF2α est une protéine cliente d'HSP90. De plus, nous montrons pour la première fois que l'inhibition d'HSP90 par le 17-DMAG diminue la production de VEGF dépendante de HIF2α. Des travaux récents suggèrent qu'HIF2α a un rôle prédominant dans la progression tumorale, et peut constituer une cible globale de choix dans plusieurs types de cancer. Il conviendrait d'évaluer la capacité des inhibiteurs d'HSP90 à supprimer des fonctions de HIF2α nouvellement décrites, comme son rôle dans la maintenance des cellules souches cancéreuses.

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36. / BRCA1 is a tumour suppressor involved in transcription, DNA repair and maintenance of genomic stability. Indeed, BRCA1 mutation carriers have an exceptionally higher risk of breast and ovarian cancers. BRCA1 is mainly known for its role in homologous recombination repair (HR) by recruiting HR proteins to chromatin upon double strand break (DSBs) formation, e.g., following treatment with ionizing irradiation (IR). However, the function of BRCA1 in other DNA repair pathways such as nucleotide excision repair (NER) or base excision repair (BER) is still obscure. It is thus of fundamental and clinical importance to investigate BRCA1 function following exposure to diverse genotoxic agents. Using human cultured cell, we observed that BRCA1 is downregulated by the proteasome upon treatment with MMS or UV, but not with IR. Moreover, this downregulation prevents Rad51 recruitment to chromatin following exposure to MMS. Given that DNA damage induced by UV and MMS trigger NER and BER pathways respectively, this implies that HR could be inhibited in order to prevent competition between independent DNA repair pathways. We also found that BRCA1 downregulation is reversible and the recovery of BRCA1 levels correlates with the reappearance of BRCA1 and Rad51 on chromatin. This implies that the HR has been reactivated at the late stage of DNA damage for the repair of double strand breaks generated by replication fork collapse. Since BRCA1 stability is highly regulated by ubiquitination and is downregulated following MMS treatment, one would expect that a deubiquitinase is responsible for relieving this downregulation to promote the reactivation of the HR pathway. To characterize this aspect further, we conducted DUB RNAi screens in which a particular DUB is depleted and the localization of BRCA1 and other related proteins were observed. According to a preliminary screen, a few DUBs (BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1, and USP36) were identified as potential regulators of the stability and localization of BRCA1 and proteins involved in homologous recombination.