Les rayons ultraviolets (UVR) font partie du spectre solaire et sont classés selon leur longueur d'onde en UVA (315 nm-400 nm), UVB (280 nm-315 nm) et UVC (100 nm-280 nm). Les UVA et une portion des UVB traversent la couche d'ozone et atteignent la surface terrestre, affectant la peau et les yeux. La peau se compose de l'épiderme, du derme et de l'hypoderme. Les UVR peuvent causer des dommages cellulaires et des dommages directs à l'ADN sous forme de dimères de pyrimidines (CPD et 6-4PP). Les dommages à l'ADN peuvent mener à la formation de mutations impliquées dans l'initiation et la progression des cancers de peau. La réparation des dommages à l'ADN couplée à l'arrêt du cycle cellulaire, ainsi que la mort cellulaire programmée sont des mécanismes de protection contre la transformation tumorale. En effet, la mort cellulaire régulée (RCD), permet de supprimer les cellules endommagées. Il existe de nombreuses voies de RCD, parmi lesquelles se trouve l'apoptose, la nécroptose, la ferroptose et la parthanatos. L'apoptose est connue pour être activée par les UVR, tandis que peu d'études examinent les voies non-apoptotiques initiées par les UVR. Cette thèse s'intéresse à l'étude des voies de RCD activées par les UVB dans les fibroblastes de derme humain (NHDF). En premier lieu, l'activation potentielle des voies non-apoptotiques de nécroptose, ferroptose et parthanatos par les UVB, a été étudiée, en plus de l'apoptose. L'investigation de ces voies a été réalisée à l'aide d'inhibiteurs pharmacologiques de la nécroptose, ferroptose, parthanatose et de l'apoptose, suite à une irradiation létale d'UVB. Nos résultats démontrent que seule l'apoptose est mesurable dans les NHDF exposés aux UVB, tandis que la nécroptose, ferroptose et parthanatos ne sont pas activées par les UVB, et ce, même suite à l'inhibition de l'apoptose. Ainsi, l'apoptose est la réponse principale des NHDF à une exposition létale d'UVB. En parallèle de la mort cellulaire, une déplétion du pool de NAD+ est observée dans les NHDF, dû en partie à l'activation de la protéine de parylation PARP1. Par la suite, la participation des protéines RIPK3 et MLKL dans la mort UV-induite a été étudiée. En effet, une précédente étude a mis en évidence une augmentation de la transcription de RIPK3 à la suite d'irradiations chroniques d'UVB, faisant de RIPK3 une protéine d'intérêt. RIPK3, sous forme phosphorylée, est connue pour être impliquée dans la nécroptose au côté de la protéine MLKL. Dans cette partie, la contribution de RIPK3 et de MLKL dans la mort UVB-induite des NHDF a été mise en évidence par déplétion partielle des protéines cibles. L'utilisation d'inhibiteurs de la nécroptose et l'étude des niveaux de phosphorylation de RIPK3 et MLKL démontre que cette implication est indépendante de leur activité nécroptotique. RIPK3 protège les NHDF de la mort UV-induite par un mécanisme indirect à l'apoptose, tandis que MLKL sensibilise les cellules à l'apoptose UV-induite. Enfin, le régime d'irradiation, soit l'exposition des cellules à une irradiation unique ou à des irradiations chroniques d'UVB, peut influencer la réponse cellulaire. En effet, la réparation des dommages à l'ADN des NHDF a été étudiée au sein du laboratoire et est modifiée selon le régime d'irradiation. Le rôle du régime d'irradiation, unique et chronique, sur la mort cellulaire induite par les rayons UVB dans les NHDF a donc aussi été étudiée. Pour ce faire, les cellules ont été prétraitées ou non par de faibles irradiations chroniques d'UVB (CLUV) puis ont été exposées à une dose létale d'UVB. Les résultats montrent que le régime d'irradiation chronique ne modifie pas la voie de mort activée par les UVB, qui reste apoptotique, et n'entraine pas de changement dans la proportion de cellules en voie de mort. Ainsi, la réponse de mort cellulaire des NHDF n'est pas modifiée par le régime d'irradiation UVB, contrairement à la réparation de l'ADN. Cette thèse établie que l'exposition des NHDF à une dose létale d'UVB induit l'activation de l'apoptose, sans activation des voies non-apoptotiques (nécroptose, ferroptose, parthanatos), et ce même suite à un régime d'irradiation CLUV. De plus, cette étude révèle deux nouveaux acteurs de la mort UV-induite des NHDF : RIPK3 et MLKL. Cette thèse présente des éléments nouveaux qui s'ajoutent à l'ensemble des connaissances et permettent une compréhension plus complète de la réponse cellulaire au stress génotoxique UVB. / Ultraviolet radiation (UVR) is part of the solar spectra. UVR are composed of UVA (315 nm-400 nm), UVB (280 nm-315 nm) and UVC (100 nm-280 nm). UVA and part of UVB reach the earth and affect our skin and eyes. Skin comprises epidermis, dermis and hypodermis layers. UVA and UVB lead to both cellular damage and direct DNA damage, mainly dipyrimidine dimers (CPD and 6-4PP). UV-induced DNA damage can be converted into skin cancer-driver mutations. DNA damage repair mechanisms and regulated cell death (RCD) are two mechanisms protecting cells from tumoral transformation. RCD, such as apoptosis, necroptosis, ferroptosis and parthanatos, remove damaged cells. UVR can induce apoptosis in skin cells, while little is known about non-apoptotic cell death following UVR. This thesis focuses on RCD pathways induced by UVB in normal human dermal fibroblasts (NHDF). First, possible activation of necroptosis, ferroptosis and parthanatos by UVB was investigated, as well as apoptosis, by use of pharmacologic inhibitors. Our results show that only apoptosis can be measured after UVB irradiation in NHDF, while no necroptosis, ferroptosis or parthanatos could be measured, with or without apoptosis inhibition. Apoptosis is thus a key response in NHDF exposed to a lethal UVB dose. Simultaneously with cell death, a drastic decrease in NAD+ was observed in irradiated NHDF, partly due to the activation of PARP1 polymerase. Secondly, the involvement of RIPK3 and MLKL proteins in UV-induced death was investigated. A previous study demonstrated an increase in RIPK3 transcription following chronic UVB irradiations, showing a potential involvement of RIPK3 in UV-induced cell response. Phosphorylated RIPK3 is known to be involved in necroptosis alongside phosphorylated MLKL. Using RIPK3 and MLKL knockdown, our results demonstrate RIPK3 and MLKL involvement in UVB-induced cell death. Use of necroptosis inhibitors plus the study of RIPK3 and MLKL phosphorylation confirmed that their roles are independent of their necroptotic activities. In fact, RIPK3 protects NHDF from UVB-induced cell death by a non-apoptotic mechanism, while MLKL sensitizes cells to UVB-induced apoptosis. Finally, irradiation regime, i.e. chronic irradiations versus unique irradiation, can influence the cellular response. Indeed, DNA damage repair has been studied in the laboratory and is modified by the irradiation regime in NHDF. Thus, we investigated the effect of chronic irradiations on UVB-induced cell death in NHDF. Cells were pre-treated or not with low chronic UVB doses (CLUV) and then exposed to a lethal UVB dose. The results show that with or without CLUV pre-treatment, UVB induced apoptosis with the same proportion of dying cells. Thus, NHDF cell death response is not altered by chronic expositions to UVB, unlike DNA repair. This thesis establishes that NHDF exposure to a lethal UVB dose induces the activation of apoptosis, without activation of non-apoptotic cell death pathways (necroptosis, ferroptosis, parthanatos), even after chronic irradiations (CLUV). In addition, two new actors of UVB-induced cell death, namely RIPK3 and MLKL, are presented here. This thesis presents new elements that help better understand the global cellular response to UVB genotoxic stress.

La protéine E4orf4 de l’adénovirus humain est membre d’une famille de facteurs tumoricides, qui induisent la mort cellulaire des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules normales. Il a été montré que dans les cellules transformées, E4orf4 induit un programme de mort cellulaire non apoptotique dépendante des kinases Src et d’une dérégulation de la dynamique d’actomyosine. Cette activité toxique d’E4orf4 est déterminée notamment par sa localisation intracellulaire : E4orf4 est initialement nucléaire, puis elle s’accumule graduellement dans le cytoplasme où elle initie un remodelage atypique du cytosquelette d’actine associé à la mort cellulaire. L’inhibition de l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4 empêche également le remodelage de l’actine, et vice versa. Il existe donc un lien fonctionnel entre la dynamique subcellulaire d’E4orf4, le remodelage du réseau d’actine, et l’activité toxique d’E4orf4 ; toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués demeurent peu compris. Les travaux présentés dans cette thèse avaient pour but d’identifier les effecteurs cellulaires contrôlant la localisation d’E4orf4 et d’étudier leur implication dans son activité tumoricide. Des analyses protéomiques ont identifié la protéine de polarité Par3 (PARD3) comme un partenaire d’E4orf4 requis pour l’induction de son activité toxique dépendante de l’actine. Les résultats suggèrent que Par3 et ses partenaires formant le complexe de polarité Par sont impliqués dans le remodelage d’un réseau périnucléaire d’actomyosine dans les cellules tumorales. Ce phénomène stimule la formation et la rupture de blebs de noyau, menant à des bris transitoires de l’enveloppe nucléaire et permettant l’accumulation cytoplasmique d’E4orf4. D’autre part, nous avons mis en évidence qu’E4orf4 stimule le recrutement du cochaperon BAG3 et de la machinerie autophagique aux sites de formation des blebs nucléaires. Les résultats suggèrent qu’une voie autophagique dépendante de BAG3 est induite en réponse à E4orf4 afin de faire face au stress mécanique, laquelle pourrait contribuer à maintenir l’intégrité et/ou à réparer l’enveloppe nucléaire après sa rupture. En outre, Par3 et BAG3 contribuent également au remodelage de l’enveloppe nucléaire induit par une diminution de sa rigidité par déplétion des lamines en absence d’E4orf4. Ces résultats suggèrent qu’ils participent à la régulation normale de la mécanique nucléaire dans les cellules cancéreuses. iv Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse appuient un rôle inconnu jusqu’alors pour Par3 et BAG3 dans la plasticité de l’enveloppe nucléaire, qui émerge comme un processus important de la biologie des cellules cancéreuses, contribuant notamment à la migration et à l’invasion tumorale. Cette voie de remodelage du noyau impliquant Par3 et BAG3 pourrait offrir de nouvelles opportunités pour le développement de thérapies moléculaires ciblées. / The human adenovirus E4orf4 protein is considered as a tumoricidal factor, as it induces cell death in tumor cells while exhibiting low toxicity in non-transformed cells. It was demonstrated that E4orf4 engages a non-apoptotic cell death program, which depends on Src-family kinases and perturbations of actomyosin dynamics. This toxic activity relies on E4orf4 localization dynamics: while E4orf4 is initially nuclear, it gradually accumulates in the cytoplasm where it initiates an atypical remodeling of the actin cytoskeleton associated with cell death. Inhibition of E4orf4’s cytoplasmic accumulation also inhibits actin remodeling, and vice versa. Thus, current data support a functional connection between E4orf4’s subcellular dynamics, actin remodeling, and E4orf4-induced cell death in tumor cells; however, the molecular mechanisms involved are misunderstood. The work presented in this thesis was aimed at identifying key cellular effectors that control E4orf4’s localization dynamics and interrogating their role in the regulation of E4orf4’s tumoricidal action. We identified the polarity protein Par3 (PARD3) as a binding partner of E4orf4 that is required for the induction of its actin-dependent toxic activity, using proteomic, biochemical and cellular approaches. The results suggest that Par3 and the other Par complex proteins are involved in E4orf4-induced remodeling of the perinuclear actin network in tumor cells. The resulting increase in perinuclear contractility stimulates the formation and rupture of nuclear blebs, leading to transient breaks in the nuclear envelope, cytoplasmic accumulation of E4orf4, and loss of nuclear compartmentalization. Moreover, we found that E4orf4 triggers the recruitment of the co-chaperone BAG3 and the autophagic machinery at nuclear blebs formation sites. The results suggest that a BAG3-dependent autophagy pathway is induced in response to E4orf4 to cope with mechanical stress, which could participate in maintaining the integrity and/or repairing the nuclear envelope after its rupture. Furthermore, Par3 and BAG3 also regulate nuclear envelope remodeling and integrity in cells depleted of lamins, suggesting that these E4orf4 targets may be bona fide regulators of nuclear mechanics in cancer cells. Thus, the results presented in this thesis support a so-far unappreciated role for Par3 and BAG3 in nuclear envelope plasticity, which emerges as a crucial process regulating cancer vi cell biology, notably during tumor cell migration and invasion. This nuclear remodeling pathway involving Par3 and BAG3 could offer new opportunities for the development of targeted molecular therapies.

La mort cellulaire programmée est un phénomène essentiel retrouvé chez pratiquement toutes les formes de vie. Chez les mammifères, l'apoptose est une forme de mort importante et très étudiée qui a beaucoup influencé l'étude de la mort cellulaire programmée chez les végétaux. Si la plupart des régulateurs et des effecteurs de l'apoptose animale ne sont pas retrouvés chez les plantes, la similarité de certaines caractéristiques morphologiques et biochimiques laisse croire que certains sentiers de régulation sont évolutivement conservés entre ces deux règnes. Dans ce travail, nous démontrons que les homologues végétaux de BI-1, l'un des rares régulateurs de l'apoptose retrouvé chez les plantes, sont très bien conservés structurellement; certaines caractéristiques déduites des BI-1 végétaux permettent de supposer un mode d'action dans la régulation de la mort. Aussi, nous montrons que les homologues végétaux de BI-1 inhibent l'apoptose induite par la surexpression de Bax chez les cellules humaines 293. Le développement et la caractérisation d'un modèle de mort cellulaire induite par Bax chez les végétaux ont aussi été entrepris. Dans un premier temps, l'expression transitoire de Bax murin par infiltration d'Agrobacterium dans des feuilles de tabac n'a pas causé de phénotype de mort. Par contre, des lignées stables de cellules de tabac BY-2 exprimant constitutivement Bax, seul ou en fusion avec les rapporteurs GFP ou GUS, présentent une mort cellulaire prématurée. La mort de ces cellules est accompagnée d'un changement de l'aspect des cultures, de la fragmentation de l'ADN génomique et de modifications morphologiques caractéristiques des cellules végétales en PCD. Ces lignées ont aussi une sensibilité accrue à la mort causée par un milieu de culture sans sucrose. L'ensemble de ces données, remis dans un contexte plus large, renforce l'idée de l'existence une forme de mort évolutivement ancienne à l'origine de toutes les formes de PCD retrouvées aujourd'hui.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Les mécanismes de mort cellulaire programmée (MCP), dont l'apoptose est le mieux caractérisé, assurent l'élimination des cellules qui sont potentiellement dangereuses pour l'organisme. Or, l'acquisition de lésions génétiques touchant des régulateurs clefs de l'apoptose contribue à la transformation cellulaire et à la résistance face à plusieurs thérapies anticancéreuses. Les travaux présentés dans cette thèse visent une meilleure compréhension des mécanismes alternatifs de MCP qui opèrent sélectivement dans les cellules cancéreuses. La protéine E4orf4 de 1'adenovirus humain active un tel mécanisme de MCP qui est indépendant des caspases et insensible à la surexpression de BCL-2. Au début de mon doctorat, les données indiquaient que l'activité toxique de E4orf4 reposait sur une modulation de l'activité des kinases de la famille Src (Src family kinases, SFKs) menant à des changements de la dynamique de l'actine régulés par les Rho GTPases. Notamment, il était établi que Cdc42 était activé par E4orf4 et stimulait la polymérisation de l'actine au niveau des endosomes de recyclage (ERs). En se basant sur ces données, l'objectif de cette thèse était d'étudier l'impact des changements de l'actine régulés par Cdc42 sur le trafic des ERs et les conséquences sur la dynamique des organelles impliquées dans la signalisation de la MCP. Mes résultats ont mis en évidence une voie de signalisation dépendante des SFKs Src et Yes, de Cdc42 et de Rabl la qui stimule le transport rétrograde des ERs au Golgi et inhibe le recyclage de cargos à la membrane plasmique. Une telle mobilisation des ERs au Golgi est associée à des changements de la dynamique du Golgi, lesquels sont requis pour la progression du signal de mort cellulaire et mènent à une fragmentation du Golgi. Ce processus a également été impliqué dans la mort cellulaire induite par la staurosporine en présence d'inhibiteurs de caspases, suggérant un rôle conservé dans les mécanismes alternatifs de mort cellulaire. Mes travaux ont aussi suggéré que les changements observés dans le transport endosomal et la dynamique du Golgi influence la dynamique des mitochondries en inhibant la fusion mitochondriale, laquelle est normalement requise pour le métabolisme énergétique et la survie cellulaire. En somme, mes travaux ont identifié une nouvelle voie de signalisation qui est activée en réponse au stress et qui est impliquée dans la communication inter-organelle via la mobilisation des ERs vers diverses organelles.

La mort cellulaire programmée (MCP) est un phénomène physiologique essentiel constaté chez les organismes vivants. Cette mort peut être induite par plusieurs stimuli comme les stress biotiques, abiotiques ou physiologiques. Une panoplie de molécules est impliquée dans la réception et la transduction des stimuli ainsi que dans la régulation et dans les activités associées à la mort cellulaire. Les régulateurs de la MCP chez les plantes sont moins connus que chez les animaux. Des travaux de recherches antécédents ont toutefois montré, chez plusieurs espèces végétales, l'existence de la protéine antiapoptotique BI-1 (abréviation anglaise pour Bax Inhibitor-1). Cette protéine inhibe ou restreint la mort cellulaire induite par la protéine Bax, une protéine, surtout connue dans le règne animal pour favoriser le suicide cellulaire. Localisée principalement au reticulum endoplasmique (RE), l'action de BI-1 pourrait se situer à ce niveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons, tout d'abord, identifié la séquence ERSE dans le promoteur de BI-1.Cette séquence, est connue comme étant un motif présent au niveau des promoteurs de plusieurs gènes notamment ceux liés aux stress du RE avec un rôle important dans l'expression de ces gènes lors d'un stress du RE. Nous avons aussi entrepris des études pour vérifier l'effet de la tunicamycine (TM), substance inductrice d'un stress du RE, et des UV-C, traitement pour l'expression de BI-1, dans les plantes de tabac et d'Arabidopsis transformées avec le promoteur intact et le promoteur muté. La mutation a été réalisée en supprimant le motif ERSE du promoteur. Les résultats montrent l'effet néfaste des traitements sur la croissance et la teneur en chlorophylle d'Arabidopsis et une augmentation du niveau d'expression de BI-1 et d'autres protéines de réponse au stress au niveau des plantes stressées. Nous avons également signalé une diminution de l'activité du promoteur de BI-1, voire même son inexistence en l'absence du motif ERSE. L'ensemble des résultats présentés conforte l'hypothèse d'une action de BI-1 au sein de la réponse au stress du RE.

L'apoptose, ou mort cellulaire programmée est un processus complexe génétiquement contrôlé, essentiel au développement de l'organisme. Il permet notamment le maintien de l'homéostasie tissulaire et l'élimination des cellules endommagées ou infectées. Les protéines de la famille des Bcl-2 (B-cell lymphoma), qui jouent un rôle important dans la régulation de l'apoptose, peuvent se classer en deux catégories selon leur fonction : les protéines proapoptotiques et les protéines anti-apoptotiques. Ces protéines interagissent et déterminent le devenir de la cellule en contrôlant la libération de facteurs apoptotiques depuis la mitochondrie. Les protéines anti-apoptotiques sont surexprimées dans de nombreux types de cancers et sont souvent associées à des phénomènes de résistance aux traitements conventionnels. Elles représentent donc une cible de choix pour l'élaboration de nouveaux traitements visant à rétablir l'apoptose dans les tumeurs. Nous nous sommes intéressés à la synthèse de trimères de quinoléines, inhibiteurs potentiels des protéines anti-apoptotiques. La première partie de ce travail est une étude bibliographique présentant les protéines de la famille des Bcl-2, leur mode d'action et les inhibiteurs décrits dans la littérature. Dans une deuxième partie, la synthèse des trimères envisagés est présentée. L'étape clé de la préparation de ces molécules est un couplage pallado-catalysé de type Suzuki, nécessitant la synthèse préalable de différents monomères diversement substitués. L'activité biologique de ces nouveaux composés est en cours d'évaluation, et les résultats obtenus nous permettront d'établir une première étude de relation structure-activité.

Les lymphocytes T qui expriment un TCR γδ (lymphocytes T γδ) sont des lymphocytes T non conventionnels qui reconnaissent des antigènes indépendamment du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité). Chez l'homme, la sous-population T Vγ9Vδ2, majoritaire dans le sang périphérique, joue un rôle important dans l'immunité antitumorale. Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 reconnaissent les cellules tumorales grâce à leur TCR et/ou leurs récepteurs NK. Le travail de thèse s'est focalisé sur l'un de ces récepteurs : CRTAM et le rôle de son interaction avec son ligand Necl-2 exprimé par des cellules tumorales. Nous avons montré que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés expriment CRTAM de manière transitoire. Afin d'étudier l'interaction CRTAM avec son ligand Necl-2, nous avons développé des modèles de cellules tumorales exprimant Necl-2 après transduction rétrovirale. Nous avons observé que l'interaction des lymphocytes T Vγ9Vδ2 avec des cellules tumorales Necl-2+ entraînait une diminution de l'expression de CRTAM à la surface des lymphocytes. De manière concomitante, les cellules tumorales Necl-2+ acquièrent CRTAM par un mécanisme de trogocytose. Contrairement aux lymphocytes T CD8 et les cellules NK, nous n'avons pas observé d'impact de l'interaction CRTAM/Necl-2+ sur la capacité cytotoxique et la sécrétion d'IFN-γ des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Par contre, cette interaction induit la mort des lymphocytes T Vγ9Vδ2 par un mécanisme de type autophagique. Nos résultats suggèrent que l'expression de Necl-2 par les cellules tumorales serait un mécanisme leur permettant d'échapper à une réponse des lymphocytes T Vγ9Vδ2.

La protéine E4orf4 de l'adénovirus humain induit la mort cellulaire de façon sélective dans les cellules transformées lorsqu'elle est exprimée en dehors de son contexte viral. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont permis d'identifier une cible majeure de E4orf4, les tyrosine kinases de la famille Src. L'association de E4orf4 à la tyrosine kinase Src entraîne des perturbations au niveau du cytosquelette d'actine, ce qui mène à l'activation d'un sentier alternatif de mort cellulaire physiologique à partir du cytoplasme (activité toxique cytoplasmique). Les travaux présentés dans cette thèse démontrent que E4orf4 est phosphorylée sur résidus tyrosine et que sa phosphorylation est requise pour son activité toxique cytoplasmique. Quatre résidus tyrosine (Y) phosphorylés ont été identifiées : Y26, Y42, Y59 et Y60. La phosphorylation de la tyrosine 42 et possiblement des tyrosines 26 et 59 est modulée par l'activité des kinases de la famille Src. Le développement d'anticorps polyclonaux phospho-spécifiques a permis de confirmer que les tyrosines 42 et 60 sont phosphorylées in vivo, dans les conditions où E4orf4 induit la mort cellulaire. L'anticorps anti-phospho-Y42 reconnaît également des substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4. Certains de ces substrats ont été isolés par immunoprécipitation à l'aide de cet anticorps et ont été identifiés par spectrométrie de masse de type LC-MS/MS. De plus, E4orf4 phosphorylée, Src et les substrats de Src dont la phosphorylation est stimulée par E4orf4 sont enrichis dans un compartiment vésiculaire juxtanucléaire à partir duquel le signal de mort semble initié. L'utilisation de mutants de E4orf4 montre que sa phosphorylation possède deux rôles majeurs. La phosphorylation de la tyrosine 42 potentialise l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 en stabilisant sa localisation cytoplasmique et membranaire et en favorisant sa phosphorylation sur d'autres sites. La tyrosine 26 et le site tyrosine 59/60 contribuent individuellement pour environ 50% de l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 et semblent permettre le recrutement de complexes signalétiques menant à l'induction de la mort cellulaire. Mes résultats suggèrent que la protéine adaptatrice Grb2, la tyrosine phosphatase Shp2, la kinase DNA-PK et l'ATPase p97-VCP s'associent à E4orf4. Le rôle potentiel de ces protéines dans l'activité toxique cytoplasmique de E4orf4 est discuté.

Kératines (K), protéines constitutives des filaments intermédiaires (FI) de l'épithélium, englobent une vingtaine de protéines du cytosquelette, exprimées différenti-ellement selon la différenciation et regroupées en deux catégories: type I (K9-20) et type II (Kl-8). Dans le foie, les FI des hépatocytes sont composés uniquement des K8 et Kl8, marqueurs typiques de l'épithélium simple. En raison de son métabolisme unique et de sa relation avec le tracrus gastro-intestinal, le foie constitue une cible majeure de la toxicité induite par les médicaments, les xénobiotiques et le stress oxydatif. La présente étude révèle que les hépatocytes de souris ainsi que les hépatomes H4IIE dépourvues de K8 (K8-null et shK8b respectivement) sont plus résistants que leurs homologues contenant la K8 (WT et H4ev respectivement), suite à un excès de H2O2. Les cellules meurent via les mitochondries en lien avec une activation et une localisation altérées de la PKCô dans les cellules shK8b. Même si le H2O2 modifie différentiellement les niveaux de glutathione (GSH) et des espèces reactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules H4ev versus shK8b, la réponse de mort est largement indépendante du niveau de GSH. En outre, nos résultats montrent que la différence dans le niveau de GSH provient d'une altération dans le métabolisme du glucose dans les cellules shK8b. Une stimulation du récepteur de l'insuline à la surface cellulaire déclenche préférentiellement une signalisation dépendante du glucose associée à l'activation de la voie PI3K/AKT, qui à son tour régule différentes activités métaboliques. Comparativement aux cellules H4ev, la stimulation par l'insuline des cellules shK8b présente une cinétique de production du glycogène plus rapide et plus élevée, associée à une signalisation préférentiellement liée à la voie G6P/mTOR/S6K. Par contre dans les hépatocytes, la cinétique différentielle de la production du glycogène en absence de K8 est maintenue, mais a lieu préférentiellement via la voie PI3K/AKT. D'une manière commune, ces altérations dans les voies de signalisation métaboliques amenées par la perte des FI de K8/K18 semblent être liées à une perturbation dans le transport membranaire du glucose à la surface. Ensemble, ces résultats fournissent la première évidence directe de la régulation par les FI de K8/K18 du métabolisme du glucose dépendent de l'insuline et de la mort cellulaire induite par les ROS dans les cellules hépatiques.

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.