La mort cellulaire programmée est un phénomène essentiel retrouvé chez pratiquement toutes les formes de vie. Chez les mammifères, l'apoptose est une forme de mort importante et très étudiée qui a beaucoup influencé l'étude de la mort cellulaire programmée chez les végétaux. Si la plupart des régulateurs et des effecteurs de l'apoptose animale ne sont pas retrouvés chez les plantes, la similarité de certaines caractéristiques morphologiques et biochimiques laisse croire que certains sentiers de régulation sont évolutivement conservés entre ces deux règnes. Dans ce travail, nous démontrons que les homologues végétaux de BI-1, l'un des rares régulateurs de l'apoptose retrouvé chez les plantes, sont très bien conservés structurellement; certaines caractéristiques déduites des BI-1 végétaux permettent de supposer un mode d'action dans la régulation de la mort. Aussi, nous montrons que les homologues végétaux de BI-1 inhibent l'apoptose induite par la surexpression de Bax chez les cellules humaines 293. Le développement et la caractérisation d'un modèle de mort cellulaire induite par Bax chez les végétaux ont aussi été entrepris. Dans un premier temps, l'expression transitoire de Bax murin par infiltration d'Agrobacterium dans des feuilles de tabac n'a pas causé de phénotype de mort. Par contre, des lignées stables de cellules de tabac BY-2 exprimant constitutivement Bax, seul ou en fusion avec les rapporteurs GFP ou GUS, présentent une mort cellulaire prématurée. La mort de ces cellules est accompagnée d'un changement de l'aspect des cultures, de la fragmentation de l'ADN génomique et de modifications morphologiques caractéristiques des cellules végétales en PCD. Ces lignées ont aussi une sensibilité accrue à la mort causée par un milieu de culture sans sucrose. L'ensemble de ces données, remis dans un contexte plus large, renforce l'idée de l'existence une forme de mort évolutivement ancienne à l'origine de toutes les formes de PCD retrouvées aujourd'hui.

La mort cellulaire programmée est un processus par lequel les cellules participent activement à leur propre mort. Ce mécanisme est très important au niveau du développement et de la survie de tous les organismes et est régulé par une panoplie de protéines. Parmi les protéines régulatrices figurent la protéine ±Bax Inhibitor-1¿ que l'on retrouve autant chez les cellules animales que végétales. Cette protéine est surtout connue et identifiée par son effet inhibiteur de l'action de la protéine Bax, protéine principalement retrouvée dans les cellules animales qui, lorsque surexprimée, active la mort cellulaire. L'analyse des séquences d'acides aminés de BI-1 provenant de cinq différentes espèces de plantes suggère l'existence de sept domaines transmembranaires avec la présence de résidus chargés dans certains domaines ce qui laisse supposer des interactions avec d'autres molécules. / D'un autre côté, le haut niveau de conservation de l'extrémité C-terminale à travers l'évolution dénote son importance fonctionnelle potentielle. Suite à ces constatations, l'étude de la relation entre la structure et la fonction de la protéine BI-1 a été entreprise afin d'identifier des sites potentiellement importants dans la séquence de la protéine BI-1 qui lui permet de contrer l'action de Bax. Nous avons démontré, par délétion graduelle de l'extrémité C-terminale, que cette région est importante pour la fonction de BI-1. Cette extrémité délètée, d'aussi peu que quatre acides aminés, modifie la fonction de la protéine et une délétion de onze acides aminés abolit complètement son effet cytoprotecteur. Nous avons aussi établi, par mutagenèse dirigée, que deux acides aminés chargés sur quatre dans le septième domaine transmembranaire sont importants pour la fonction de BI-1. Finalement, nous avons proposé, suite à l'étude par mutagenèse aléatoire, l'importance possible du cinquième domaine transmembranaire dans la fonction de la protéine BI-1. Nous pouvons donc conclure que la capacité de BI-1 à inhiber l'effet létal de Bax dépend de sa structure.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2004-2005 / La mort cellulaire programmée (PCD) est un processus physiologique ou pathologique permettant l’élimination sélective de cellules devenues inutiles, endommagées ou infectées pour le maintien de l’intégrité ou l’adaptation (fitness) de l’organisme ou de la population cellulaire. Chez les végétaux, les mécanismes moléculaires régulant la PCD ne sont pas encore élucidés, mais la découverte que la protéine humaine anti-PCD Bax Inhibitor-1 (BI-1) est conservée chez les plantes, pourtant dépourvues de la protéine pro-PCD Bax, en a fait un candidat fort prometteur pour l’élucidation de sentiers de mort évolutivement conservés. En ce sens, cette thèse décrit la caractérisation d’orthologues de BI-1 isolés de Brassica napus (BnBI-1) et de Nicotiana tabacum (NtBI-1). Nous avons déterminé par des analyses informatiques et des études d’expression que BI-1 est une protéine membranaire intégrale possédant sept domaines transmembranaires putatifs et localisée au réticulum endoplasmique. Des essais fonctionnels dans des cellules humaines HEK 293 ont révélé que des orthologues végétaux de BI-1 peuvent inhiber la PCD (apoptose) induite par Bax dans ces cellules. Par ailleurs, des lignées cellulaires de tabac présentant des niveaux inférieurs de la protéine NtBI-1 grâce à l’expression d’un ARNm antisens entament un programme précoce de PCD suite à une déficience en carbone, démontrant ainsi le rôle anti-PCD intrinsèque de BI-1 dans des cellules végétales. Nous avons également découvert que la protéine NtBI-1 est surexprimée en présence de cytokinines (CK) dans des cultures cellulaires de tabac, et ce à des concentrations coïncidant avec l’établissement d’une réponse de stress, un phénomène impliquant des mécanismes de régulation post-transcriptionnels. La réponse cellulaire envers les CK comprend également un influx rapide de Ca2+ de l’apoplaste vers le cytosol. Cet influx est partiellement impliqué dans l’induction de la PCD mais non dans la signalisation menant à la surexpression de BI-1. L’ensemble de nos résultats indique que BI-1 est bel et bien un régulateur négatif de la PCD végétale, qui agirait au sein d’un sentier de mort évolutivement conservé. L’augmentation de l’accumulation de la protéine NtBI-1 lors de la réponse de stress envers les CK pourrait contribuer à la survie des cellules et laisse supposer que la protéine est impliquée dans l’activité anti-sénescence des CK. BI-1 s’insère dans un sentier où son niveau d’expression influence la capacité cellulaire à résister aux stress générés entre autres par une disette en carbone, et ce potentiellement via la modulation de l’homéostasie du Ca2+ intracellulaire. / Programmed cell death (PCD) is a physiological or pathological process allowing the selective elimination of useless, damaged or infected cells with the aim of maintaining the integrity or fitness of the remaining organism or cell population. In plants, molecular mechanisms regulating PCD are not yet elucidated, but the identification of functional plant orthologs of the human anti-PCD protein Bax Inhibitor-1 (BI-1), given that the pro-PCD protein Bax is absent in the plant kingdom, revealed the potential of BI-1 as an evolutionary conserved cell death regulator. Accordingly, this thesis describes the characterization of BI-1 orthologs isolated from Brassica napus (BnBI-1) and Nicotiana tabacum (NtBI-1). While combining bioinformatics analysis and localization studies using a fusion between BnBI-1 and the green fluorescent protein, we determined that BI-1 is an integral membrane protein provided with seven putative transmembrane domains localized at the endoplasmic reticulum. We also proceeded to functional assays in human HEK 293 cells, and we demonstrated that plant BI-1 orthologs can inhibit Bax-induced PCD (apoptosis) in these mammalian cells. On the other hand, we demonstrated that tobacco cell lines expressing lower levels of the NtBI-1 protein via an antisens mRNA induced an early PCD program under carbon starvation. We also discovered the up-regulation of NtBI-1 when cultured cells were grown in the presence of cytokinins (CKs), which correlated with the establishment of a stress response. The phenomenon involved post-transcriptional regulatory mechanisms of the BI-1 protein accumulation. Cellular response to CKs also involved a rapid influx of Ca2+ from the apoplast to the cytosol and this influx is partly involved in PCD induction but not in signaling leading to BI-1 modulation. Taken together, our data indicate that BI-1 is a negative regulator of plant PCD that would act in an evolutionary conserved death pathway. NtBI-1 protein over-accumulation in the stress response to CKs could contribute to cell survival and suggests the involvement of the protein in the senescence-delay activities of CKs. BI-1 is part of a pathway where its expression level influence cellular ability to resist to carbon starvation- or senescence-induced stresses, potentially via modulation of intracellular Ca2+ homeostasis.

La macro-autophagie est une voie catabolique conservée dans l’évolution permettant la dégradation des organites endommagés ou vieux, des protéines à longue durée de vie ou agrégées et des portions du cytosol pour le recyclage métabolique afin de maintenir l'homéostasie cellulaire. L'absence d'autophagie est fréquemment observée dans de nombreuses pathologies incluant les cancers et les maladies neurodégénératives. Beclin 1, un suppresseur de tumeur,est une protéine clé dans la régulation de l’autophagie et participe à la nucléation de l’autophagosome. Beclin 1 est une protéine “BH3-only” pouvant interagir avec le site de fixation au domaine BH3 présent dans la protéine Bcl-2 et ses homologues. Cette interaction inhibe l’autophagie. Certains agents pharmacologiques tels qu’ABT737, appelés«BH3 mimetics», occupent le site de fixation du domaine BH3 de façon compétitive pour perturber l'interaction inhibitrice entre Beclin 1 et Bcl-2/Bcl-XL. Ceci permet à Beclin 1 de maintenir l’activité classe IIIphosphatidylinositol-3-kinase de Vps34 pour la formation du phagophore. L'autophagie est un processus finement régulé par de nombreux complexes protéiques. Les senseurs de la charge énergétique comme l’AMP-dependant kinase(AMPK), la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR), la Sirtuin1 (SIRT1) ou les voies d’intégration du stress telles que celles impliquant l'inhibiteur des kinases NF-κB (IκBα) (IKK) et le suppresseur de tumeur p53, ont tous un impact majeur dans la régulation de l'autophagie. Dans de nombreux paradigmes de stimulation autophagique, ils semblent tous agir en amont de la dissociation Beclin 1-Bcl-2. Nos résultats révèlent qu’ABT737 stimule plusieurs voies pro-autophagiques pour obtenir une efficacité optimale. Ces résultats placent la SIRT1, AMPK / mTOR, HDM2et IKK en aval de la dissociation du complexe Beclin 1-Bcl-2. Cette étude démontre que les BH3-mimetics activent des voies multiples de stimulation de l’autophagie, peut-être en raison du degré élevé de connectivité qui existe entre les complexes protéiques de régulation de l’autophagie. Cela signifie qu’un effet spécifique sur l’interactome de Beclin 1 peut affecter d'autres voies dans le réseau du contrôle autophagique. Ces voies ne semblent pas suivre une hiérarchie linéaire, mais doivent être plutôt interconnectées dans un circuit complexe dans lequel la stimulation de l'autophagie par des déclencheurs physiologiques (tels que la carence en nutriments ou le stress des organites) induit un ensemble de changements intimement liés et impliqués dans une boucle de régulation positive qui constituerait un ensemble indissociable composant l’«autophagy switch». / Macro-autophagy is a conserved catabolic pathway that culminates in the degradation of old/damaged organelles,long-lived/aggregated proteins and portions of the cytosol for metabolic recycling to maintain cellular homeostasis.The absence of autophagy is frequently observed in many pathologies including cancers and neurodegenerative diseases. Beclin 1, a bona fide tumour suppressor, is the key autophagy regulatory protein that participates in autophagosome nucleation. Infect, Beclin 1 is a BH3-only protein that can interacts with the BH3 receptor domain contained within Bcl-2 and its homologues. This interaction functions as a inhibitory check on autophagy. Some pharmacological agents such as ABT737, referred to as ‘BH3 mimetics’, occupy the BH3-binding grooves to competitively disrupt the inhibitory interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-XL allowing Beclin 1 to maintain the class III phosphatidylinositol-3-kinase activity of Vps34 for the phagophore formation. Autophagy is a complex process that is regulated by multiple protein complexes beyond that organized around Beclin 1. The energy sensors including AMP-dependent kinase (AMPK), mammalian target of rapamycin (mTOR), Sirtuin1 (SIRT1) as well as stress-integrating pathways such as those involving the inhibitor of NF-κB (IκB) kinases (IKK) and the tumour suppressor protein p53, all have a major impact on the regulation of autophagy. In many paradigms of autophagic stimulation, they all seem to act upstream of the dissociation of Beclin 1-Bcl-2. Our results reveal that ABT737stimulate multiple pro-autophagic pathways to be optimally efficient. These results place SIRT1, AMPK/mTOR,HDM2 and IKK downstream of the dissociation of the Beclin 1-Bcl-2 complex. This study advocates that BH3mimetics trigger multiple autophagy-stimulatory pathways maybe due to the high degree of connectivity that exists among autophagy-regulatory protein complexes meaning that a specific effect on the Beclin 1-interactome might affect other nodes in the autophagy-controlling network. These pathways cannot follow a linear hierarchy and rather must be interconnected in a complex circuitry, in which stimulation of autophagy by physiological triggers (such as starvation or organelle stress) induce an ensemble of intimately linked changes that are coupled to each other in positive feed forward loops constituting an indissociable ensemble that composes the “autophagic switch”.

Les protéines de la famille Bcl-2 sont les principaux régulateurs de la mort cellulaire par apoptose. Au sein de cette famille, la protéine Bcl-xL appartient au sous-groupe des anti-apoptotiques et contribue à maintenir la survie cellulaire. Cependant, des données récentes suggèrent que les membres de la famille Bcl-2, et en particulier Bcl-xL, ont également d'autres fonctions.Dans le contexte pathologique du cancer du sein, la surexpression du gène Bcl-x n'affecterait pas la taille de la tumeur initiale mais favoriserait plutôt l'invasion ganglionnaire et la formation de métastases. La capacité des tumeurs à former des métastases repose notamment sur le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses, et de ce fait nous avons cherché à savoir si Bcl-xL pouvait contrôler ces processus. En lien avec les données cliniques, nous montrons que la perte d'expression de Bcl-xL réduit la capacité migratoire de cellules cancéreuses mammaires. De plus, le contrôle de la migration exercé par Bcl-xL est indépendant de son activité anti-apoptotique. Ainsi, l'inhibition de la poche hydrophobe de Bcl-xL par des composés BH3-mimétiques n'a pas d'effet sur la migration des cellules. Nous avons alors recherché le mécanisme par lequel Bcl-xL agit sur la migration. Nous observons que la fraction mitochondriale de Bcl-xL régule la migration cellulaire, et non la protéine localisée au réticulum endoplasmique. Au niveau de la mitochondrie, nous proposons que Bcl-xL contrôle la migration par l'intermédiaire de son domaine BH4, domaine modulant l'activité du canal mitochondrial VDAC / Proteins of the Bcl-2 family are the main regulators of apoptosis. Among the family, the Bcl-xL protein belongs to the anti-apoptotic subgroup and favors cell survival. However, increasing evidence suggest that Bcl-2 proteins, and in particular Bcl-xL, exert other functions in the cells.In the pathological context of breast cancer, Bcl-x gene overexpression seems to have only little impact on primary tumor growth but instead increases lymph nodes invasion and metastasis. Metastasis formation mainly relies on tumor cells’ ability to migrate and invade surrounding tissues. Therefore, we wondered wether Bcl-xL could control these processes.In line with clinical data, we show that Bcl-xL complete or partial loss of expression reduces cell migration of mammary cancer cell lines. Furthermore, we find that Bcl-xL control of cell migration is independent of its anti-apoptotic activity. Indeed, treatments with BH3-mimetics that bind to and inhibit Bcl-xL hydrophobic pocket have no effect on cell migration. Since Bcl-xL regulation of cell migration seems to be independent of interactions with other Bcl-2 family members, we investigated alternative mechanisms. We observe that mitochondrial Bcl-xL, but not the ER-targeted Bcl-xL, is involved in cell migration. At the mitochondria, we propose that Bcl-xL controls cell migration through its BH4 domain, by modulating the activity of mitochondrial VDAC channel

La formation de cancers est liée à des dérèglements de la progression du cycle cellulaire ou de l'apoptose. L'identification des acteurs cellulaires mis en jeu dans la maladie et l'élucidation des mécanismes responsables de ces dysfonctionnements sont à la base de nouveaux traitements anticancéreux. Ainsi, en vue du développement de thérapies ciblées, les kinases Pim et les protéines anti-apoptotiques de la famille des Bcl-2, surexprimées dans de nombreux types de cancers et associées à des phénomènes de chimiorésistance, constituent des cibles pertinentes. Les kinases Pim (Pim-1,-2 et -3) sont une famille de sérine / thréonine kinases qui jouent un rôle fondamental dans les processus de survie, de prolifération ou de différenciation cellulaire. Bien qu'elles possèdent un substrat commun avec les autres protéines kinases, l'ATP, des différences structurales permettent de les différencier et de les inhiber sélectivement. En tenant compte de ces spécificités, nous nous sommes intéressés à la synthèse de nouveaux inhibiteurs sélectifs des kinases Pim, compétitifs de l'ATP. Parmi les autres agents impliqués dans la formation de tumeurs, les protéines de la famille des Bcl-2, responsables du phénomène d'apoptose ou mort cellulaire programmée, font l'objet d'un domaine d'étude récent. Elles se classent en deux familles selon leur fonction : les protéines pro-apoptotiques et les protéines anti-apoptotiques dont la surexpression est observée dans de nombreux cancers. Nous avons poursuivi l'étude de relations structure-activité initiée au laboratoire à partir de trimères d'alkoxyquinoléines, inhibiteurs micromolaires des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-xL, en préparant de nouveaux analogues.

La formation de cancers est liée à des dérèglements de la progression du cycle cellulaire ou de l’apoptose. L’identification des acteurs cellulaires mis en jeu dans la maladie et l’élucidation des mécanismes responsables de ces dysfonctionnements sont à la base de nouveaux traitements anticancéreux. Ainsi, en vue du développement de thérapies ciblées, les kinases Pim et les protéines anti-apoptotiques de la famille des Bcl-2, surexprimées dans de nombreux types de cancers et associées à des phénomènes de chimiorésistance, constituent des cibles pertinentes. Les kinases Pim (Pim-1,-2 et -3) sont une famille de sérine / thréonine kinases qui jouent un rôle fondamental dans les processus de survie, de prolifération ou de différenciation cellulaire. Bien qu’elles possèdent un substrat commun avec les autres protéines kinases, l’ATP, des différences structurales permettent de les différencier et de les inhiber sélectivement. En tenant compte de ces spécificités, nous nous sommes intéressés à la synthèse de nouveaux inhibiteurs sélectifs des kinases Pim, compétitifs de l’ATP. Parmi les autres agents impliqués dans la formation de tumeurs, les protéines de la famille des Bcl-2, responsables du phénomène d’apoptose ou mort cellulaire programmée, font l’objet d’un domaine d’étude récent. Elles se classent en deux familles selon leur fonction : les protéines pro-apoptotiques et les protéines anti-apoptotiques dont la surexpression est observée dans de nombreux cancers. Nous avons poursuivi l’étude de relations structure-activité initiée au laboratoire à partir de trimères d’alkoxyquinoléines, inhibiteurs micromolaires des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-xL, en préparant de nouveaux analogues. / Cancer development is associated with dysfunctions in cell cycle progression or apoptosis. The identification of cellular agents involved in this disease, and the elucidation of mechanisms responsible for these dysfunctions provide the basis for the development of novel anti-cancer drugs.Thus, Pim kinases and Bcl-2 anti-apoptotic proteins which are overexpressed in many malignancies and contribute significantly to chemoresistance are of great interest for the development of targeted cancer therapy. Pim kinases (Pim-1,-2 and -3) belong to a family of serine / threonine kinases which play a key role in cell survival, proliferation and differenciation. Although all protein kinases share ATP as a common substrate, the structure of the ATP-binding pocket of Pim kinases is unique and offers an opportunity for a selective inhibition. Taking account of these specificities, we were interested in the synthesis of novel selective ATP competitive Pim kinase inhibitors. Among the other agents involved in tumorigenesis, Bcl-2 family proteins, which govern apoptosis (or programmed cell death), are subject of a recent interest. These proteins are divided in two classes depending on their function : pro-apoptotic and anti-apoptotic members that are overexpressed in a variety of cancers. In a preliminary work in the laboratory, alkoxyquinoline trimers have demonstrated micromolar inhibition against antiapoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL. Therefore, we carried on this structure-activity relationship study with the synthesis of novel analogues.

L'apoptose, ou « mort cellulaire programmée », joue un rôle clé dans de nombreux processus biologiques. Les protéines de la famille Bcl-2, dont l'expression est souvent altérée dans les cellules tumorales, sont les principaux régulateurs de l'apoptose. Parmi cette famille, la fonction exacte du répresseur apoptotique Nrh, aussi appelé BCL2L10 ou Bcl-B, reste à ce jour mal comprise. Bien que son expression ne soit pas détectable dans la plupart des tissus sains, on retrouve des niveaux élevés de Nrh corrélés à un mauvais pronostique dans les cancers du sein et de la prostate. Nous avons mis au jour un nouveau mécanisme selon lequel Nrz, l'orthologue de Nrh chez le poisson zèbre, interagit avec le domaine de liaison du ligand IP3 du canal calcique IP3R1. Il s'est avéré que la régulation négative des flux calciques par Nrz est critique lors du développement embryonnaire du poisson zèbre. Grâce à ces nouvelles données, nous avons cherché à comprendre la fonction de Nrh chez l'Homme, dans un contexte pathologique. Nous avons montré que Nrh interagit via son domaine BH4 avec le domaine de liaison du ligand du récepteur IP3R1 humain pour réguler l'homéostasie calcique et la mort cellulaire. Cette interaction définit Nrh comme la seule protéine de la famille Bcl-2 à réguler négativement la mort cellulaire exclusivement au niveau du réticulum endoplasmique. Pour aller plus loin, nous avons montré que la dissociation du complexe Nrh/IP3Rs sensibilise des cellules tumorales mammaires à l'action d'agents chimiothérapeutiques. Pour finir, nos résultats apportent une explication moléculaire sur la contribution de Nrh dans la résistance aux thérapies anti-tumorales / Apoptosis, also called “Programmed Cell Death”, plays a key role in many biological processes and pathologies. The B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) proteins, whose expression is often altered in tumor cells, are the main regulators of apoptosis.Among this family, the actual physiological function of the human apoptosis inhibitor Nrh, also referred to as BCL2L10 or Bcl-B, remains elusive. Although in most healthy tissues the Nrh protein is nearly undetectable, clinical studies have shown that Nrh expression is correlated with poor prognosis in breast and prostate carcinomas. We have shed light on a novel mechanism by which Nrz, the zebrafish ortholog of Nrh, was found to interact with the Ligand Binding Domain (LBD) of the Inositol-1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) type-I Ca2+ channel. Indeed, the regulation of IP3Rs-mediated Ca2+ signaling by Nrz was shown to be critical during zebrafish embryogenesis. We used the knowledge gained with the zebrafish model to investigate Nrh function in cancer. We showed that Nrh interacts with the LBD of IP3Rs via its BH4 (Bcl-2 Homology 4) domain, which is critical to regulate intracellular Ca2+ trafficking and cell death. Actually, this interaction seems to be unique among the Bcl-2 family, and sets Nrh as the only Bcl-2 homolog to negatively regulate apoptosis by acting exclusively at the Endoplasmic Reticulum. Furthermore, we showed that disruption of the Nrh/IP3Rs complex primes Nrh-dependent cells to apoptotic cell death and enhances chemotherapy efficiency in breast cancer cell lines.Lastly our results bring a new insight to the role of Nrh regarding chemotherapy resistance