La macro-autophagie est une voie catabolique conservée dans l’évolution permettant la dégradation des organites endommagés ou vieux, des protéines à longue durée de vie ou agrégées et des portions du cytosol pour le recyclage métabolique afin de maintenir l'homéostasie cellulaire. L'absence d'autophagie est fréquemment observée dans de nombreuses pathologies incluant les cancers et les maladies neurodégénératives. Beclin 1, un suppresseur de tumeur,est une protéine clé dans la régulation de l’autophagie et participe à la nucléation de l’autophagosome. Beclin 1 est une protéine “BH3-only” pouvant interagir avec le site de fixation au domaine BH3 présent dans la protéine Bcl-2 et ses homologues. Cette interaction inhibe l’autophagie. Certains agents pharmacologiques tels qu’ABT737, appelés«BH3 mimetics», occupent le site de fixation du domaine BH3 de façon compétitive pour perturber l'interaction inhibitrice entre Beclin 1 et Bcl-2/Bcl-XL. Ceci permet à Beclin 1 de maintenir l’activité classe IIIphosphatidylinositol-3-kinase de Vps34 pour la formation du phagophore. L'autophagie est un processus finement régulé par de nombreux complexes protéiques. Les senseurs de la charge énergétique comme l’AMP-dependant kinase(AMPK), la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR), la Sirtuin1 (SIRT1) ou les voies d’intégration du stress telles que celles impliquant l'inhibiteur des kinases NF-κB (IκBα) (IKK) et le suppresseur de tumeur p53, ont tous un impact majeur dans la régulation de l'autophagie. Dans de nombreux paradigmes de stimulation autophagique, ils semblent tous agir en amont de la dissociation Beclin 1-Bcl-2. Nos résultats révèlent qu’ABT737 stimule plusieurs voies pro-autophagiques pour obtenir une efficacité optimale. Ces résultats placent la SIRT1, AMPK / mTOR, HDM2et IKK en aval de la dissociation du complexe Beclin 1-Bcl-2. Cette étude démontre que les BH3-mimetics activent des voies multiples de stimulation de l’autophagie, peut-être en raison du degré élevé de connectivité qui existe entre les complexes protéiques de régulation de l’autophagie. Cela signifie qu’un effet spécifique sur l’interactome de Beclin 1 peut affecter d'autres voies dans le réseau du contrôle autophagique. Ces voies ne semblent pas suivre une hiérarchie linéaire, mais doivent être plutôt interconnectées dans un circuit complexe dans lequel la stimulation de l'autophagie par des déclencheurs physiologiques (tels que la carence en nutriments ou le stress des organites) induit un ensemble de changements intimement liés et impliqués dans une boucle de régulation positive qui constituerait un ensemble indissociable composant l’«autophagy switch». / Macro-autophagy is a conserved catabolic pathway that culminates in the degradation of old/damaged organelles,long-lived/aggregated proteins and portions of the cytosol for metabolic recycling to maintain cellular homeostasis.The absence of autophagy is frequently observed in many pathologies including cancers and neurodegenerative diseases. Beclin 1, a bona fide tumour suppressor, is the key autophagy regulatory protein that participates in autophagosome nucleation. Infect, Beclin 1 is a BH3-only protein that can interacts with the BH3 receptor domain contained within Bcl-2 and its homologues. This interaction functions as a inhibitory check on autophagy. Some pharmacological agents such as ABT737, referred to as ‘BH3 mimetics’, occupy the BH3-binding grooves to competitively disrupt the inhibitory interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-XL allowing Beclin 1 to maintain the class III phosphatidylinositol-3-kinase activity of Vps34 for the phagophore formation. Autophagy is a complex process that is regulated by multiple protein complexes beyond that organized around Beclin 1. The energy sensors including AMP-dependent kinase (AMPK), mammalian target of rapamycin (mTOR), Sirtuin1 (SIRT1) as well as stress-integrating pathways such as those involving the inhibitor of NF-κB (IκB) kinases (IKK) and the tumour suppressor protein p53, all have a major impact on the regulation of autophagy. In many paradigms of autophagic stimulation, they all seem to act upstream of the dissociation of Beclin 1-Bcl-2. Our results reveal that ABT737stimulate multiple pro-autophagic pathways to be optimally efficient. These results place SIRT1, AMPK/mTOR,HDM2 and IKK downstream of the dissociation of the Beclin 1-Bcl-2 complex. This study advocates that BH3mimetics trigger multiple autophagy-stimulatory pathways maybe due to the high degree of connectivity that exists among autophagy-regulatory protein complexes meaning that a specific effect on the Beclin 1-interactome might affect other nodes in the autophagy-controlling network. These pathways cannot follow a linear hierarchy and rather must be interconnected in a complex circuitry, in which stimulation of autophagy by physiological triggers (such as starvation or organelle stress) induce an ensemble of intimately linked changes that are coupled to each other in positive feed forward loops constituting an indissociable ensemble that composes the “autophagic switch”.

Bcl-2 family members are important regulators of apoptosis, and their tampered expression is often involved in oncogenesis. Of particular importance are the levels of Bcl-2 family members in forming lymphomas. We studied two groups of murine thymic T cell lymphomas derived from either Bcl-2 or Bax overexpression in order to predict their sensitivity and resistance to treatments. While the growth rate and histological characteristics were similar for both lymphoma groups, Bax-derived lymphomas failed to undergo cell cycle arrest following radiation treatment and had frequent p53 mutations. In contrast, Bcl-2-derived lymphomas often halted proliferation following radiation delivery and rarely had p53 mutations. Bax-derived lymphomas were uniformly sensitive to treatment with 2-deoxy-D-glucose (2DG) while all Bcl-2-derived lymphomas were resistant. This led us to hypothesize that the Bcl-2 family is involved in 2DG-induced cell death. Focusing on the mechanism of 2DG toxicity in Bax-derived lymphomas, our studies demonstrate the following: cell death involved the activation of proapoptotic Bax, was effectively blocked by anti-apoptotic Bcl-2, and was mediated, at least in part, by the BH3-only family member Bim. Based on these results, we explored whether a BH3 mimetic (ABT-737) could sensitize lymphomas to 2DG killing. Indeed, a combination of ABT-737 with 2DG enhanced killing in Bax-derived lymphomas and resensitized Bcl-2-overexpressing lymphomas to 2DG. Since both 2DG and BH3 mimetics are currently in clinical trials, understanding their killing mechanisms and optimal combinations are of potential clinical significance. The work in this dissertation demonstrates a novel role of Bcl-2 family member proteins in regulating 2DG toxicity and may predict response to 2DG treatment. The information found presents a new strategy of combining 2DG with BH3 mimetics to improve existing lymphoma therapies.

Les cancers de l’ovaire demeurant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles, il est donc indispensable de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance pour améliorer leur prise en charge. Les travaux antérieurs de l’Unité ont démontré que les protéines anti-apoptotiques Bcl-xL et Mcl-1 coopèrent pour protéger les cellules cancéreuses ovariennes contre l’apoptose et que leur inhibition concomitante conduit à la mort des cellules chimiorésistantes. A ce jour, seuls les inhibiteurs de Bcl-xL/Bcl-2 ont démontré une efficacité en clinique, en particulier l’ABT-263 (Navitoclax). En revanche, l’inhibition de Mcl-1 reste problématique dans un contexte clinique. La recherche d’outils pharmacologiques conduisant à l’inhibition ou à l’inactivation de Mcl-1, utilisables en clinique, reste donc un enjeu majeur, d’autant que cette protéine est désormais désignée comme une cible thérapeutique prioritaire dans de nombreuses localisations tumorales. C’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’est inscrit, l’objectif étant d’identifier et d’évaluer de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de Mcl-1 synthétisés par des équipes de chimistes. Dans cette optique, mon projet de thèse s’est scindé en deux parties : Dans une première étude, je me suis attachée à cribler in vitro des molécules appartenant à différentes familles chimiques (Oligopyridines dérivées du Pyridoclax, « Lead » de la première génération des oligopyridines précédemment identifié par notre équipe, ou analogues de MIM1) dans le but d’identifier de nouveaux inhibiteurs de Mcl-1 plus actifs que les molécules dont ils dérivent. Ce travail a permis d’identifier la MR31367, une molécule issue du Pyridoclax qui présente une activité pro-apoptotique plus forte que ce dernier sur plusieurs lignées tumorales ovariennes chimioresistantes. Nous avons également pu mettre en évidence sur ces mêmes modèles que plusieurs molécules issues de MIM1 exhibaient une activité pro-apoptotique amplifiée. Cette étude nous a également permi de mettre en évidence une relation structure activité permettant de classer ces molécules en inhibiteurs spécifiques de Mcl-1 et « dual-inhibiteur » de Mcl-1 et Bcl-xL. Dans une seconde étude, mon travail a consisté en l’évaluation préclinique du sel de Pyridoclax. Nous avons étudié l’effet de différentes doses de Pyridoclax administré par différentes voies d’administration, en agent seul ou en combinaison avec l’ABT-263 sur différents modèles tumoraux établis à partir des lignées chimiorésistantes de cancers ovariens. Nous avons ainsi pu mettre en évidence un effet anti-tumoral du Pyridoclax (20 mg/kg/j) administré par voie IV en agent seul sur des 2 modèles des 3 modèles de xénogreffes, et cela sans toxicité avérée. Ces résultats prometteurs ouvrent des perspectives intéressantes quant à l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques de Mcl-1 pour le traitement des cancers de l’ovaire / Ovarian cancer is the most leading cause of death from gynecologic malignancies because of its late diagnosis and its ability to develop chemoresistance to conventional therapies. It is now essential to develop new therapeutic strategies to overcome this chemoresistance and improve patient care. Our laboratory has demonstrated the overexpression of the Bcl-2 anti-apoptotic proteins Bcl-xL and Mcl-1 and their cooperation to protect ovarian cancer cells from apoptosis. Currently, the clinically relevant pharmacologic inhibition of Bcl-xL is available using ABT-263 (Navitoclax). However, selective direct Mcl-1 inhibition remained a challenge. This protein is one of the most important anti-apoptotic member which is expressed in multiple cancer types and is at the origin of the acquired resistance to chemotherapy and Bcl-2 family inhibitors (Navitoclax, Venetoclax). Thus, Mcl-1 inhibition represents a major challenge for the clinical success of the Bcl-2 family inhibitors. In this context, I was interested in identifying and evaluating new Mcl-1 inhibitors designed and synthetized by different chemistry research teams. My project was focused on two aspects. In the first part, we have evaluated the cytotoxic effect of different molecules derived from 2 Mcl-1 inhibitors, the Pyridoclax from the oligopyridine family and MIM1. The screening of 8 Noxa-mimetic molecules derived from Pyridoclax allowed us to identify MR31367, one of the most potent oligopyridine molecules that shows a stronger anti-apoptotic activity than Pyridoclax (15μM) and sensitizes different chemoresistant ovarian cancer cell lines (IGROV1-R10, SKOV-3 and A2780) to anti-Bcl-xL strategies (ABT-737, siRNA). Furthermore, we have evaluated the pro-apoptotic activity of 14 MIM1 derivative molecules using the same cellular model. This study has demonstrated that most of these derivatives have greater pro-apoptotic activity than MIM1. We have also established the structure-activity relationship leading to classify these molecules as “Mcl-1 inhibitors” or as “dual inhibitors” of Mcl-1 and Bcl-xL.The second part of my project was focused on the preclinical evaluation of Pyridoclax hydrochlorid. We have analyzed the antitumor activity of Pyridoclax hydrochlorid in several subcutaneous xenografts derived from human ovarian cancer cell lines (IGROV1-R10, SKOV-3 and A2780). Different routes of Pyridoclax hydrochlorid administration were tested (oral, IV and IT) and its antitumor effect was analyzed at different doses as single agent or in combination with ABT-263 (100mg/kg). This study highlighted an effective antitumor activity of 20mg/kg of Pyridoclax hydrochlorid administered intravenously as single agent in two of three xenograft models without any side effects. This results open up interesting perspectives for the clinical use of Mcl-1 inhibitors to improve the clinical management of ovarian cancer