Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2018-2019 / L’organisation du génome eucaryote sous forme de chromatine est intimement liée à la régulation de nombreux processus cellulaires. Le contexte chromatinien joue un rôle central dans les voies de réponse cellulaires aux dommages à l’ADN. NuA4 est un complexe histone-acétyltransférase (HAT) très conservé formé de nombreuses sous-unités, responsable de l’acétylation des histones H4 et H2A au sein des nucléosomes. Il joue un rôle important dans l’expression des gènes mais aussi dans la réparation efficace des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN. Bien qu’il ait été montré que NuA4 est rapidement recruté sur la chromatine autour des CDBs, le mécanisme précis de ce recrutement et le rôle joué par NuA4 à ce niveau restent mal compris. Mon projet de doctorat se concentre sur l’étude du mécanisme de recrutement de NuA4 et sur les conséquences de ce recrutement. Au moyen d’approches in vitro et in vivo, nous avons montré que NuA4 est recruté au niveau d’une CDB par le complexe MRX et se propage en suivant la résection de l’ADN. Après son recrutement et sa propagation, NuA4 participe à la réponse aux dommages en acétylant les nucléosomes pour faciliter leur retrait. De plus, NuA4 acétyle des facteurs-clés de la réponse aux dommages à l’ADN, tels que RPA et Sae2, pour réguler leur dynamique et leurs fonctions. En étudiant l’implication de NuA4 lors de phases spécifiques de la réponse aux dommages, nous avons découvert que le complexe est impliqué dans différentes étapes de la réparation par recombinaison homologue, dont la résection et la formation de D-loops, en coopération avec une autre HAT, Gcn5/SAGA. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans cette thèse décrivent les fonctions complexes de NuA4 dans les voies de réponse aux dommages à l’ADN et permettent de mieux comprendre comment la chromatine et sa régulation orchestrent les processus cellulaires lors de la réparation de l’ADN. / The organization of the eukaryotic cell genome into chromatin structure is intricately linked to the regulation of many cellular processes. DNA damage response (DDR) takes place in the context of chromatin and the latter plays a central role in the regulation of cellular DDR pathways. The NuA4 histone acetyltransferase (HAT) is a highly conserved multi-subunit complex responsible for acetylation of nucleosomal histone H4 and H2A. It is important for gene expression but also the efficient repair of DNA double-strand breaks (DSBs). Although it was shown that NuA4 is rapidly recruited to chromatin surrounding a DSB, the specific mechanism of this recruitment and NuA4 function after its recruitment remains unknown. My PhD project focuses on investigating NuA4 recruitment mechanism and the functional consequences of this recruitment. Taking advantage of in vitro and in vivo approaches, we found that NuA4 is recruited by the MRX complex to a DSB site and spreads along with DNA resection. After recruitment and spreading, NuA4 participates in DDR through acetylation of nucleosomes to assist their removal. In addition, NuA4 also acetylates key DDR factors, such as RPA and Sae2, to regulate their dynamics and functions. By dissecting NuA4 involvement in specific DDR steps, we found that the complex is involved in different stages of homologous recombination (HR) repair, including resection and D-loop formation, during which it cooperates with another HAT, Gcn5/SAGA. Altogether, the data presented in this thesis delineate the intricate functions of NuA4 in DDR pathways and extend our understanding on how chromatin and its regulation orchestrate chromatin-based cellular processes during DNA repair

L’exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) solaires est un facteur de risque puisqu’ils induisent des dommages sur l’ADN responsables des mutations signatures retrouvées dans les cancers cutanés. Les principaux dommages induits sont les dimères cyclobutiliques de pyrimidine (CPD) et les photoproduits 6-4 de pyrimidine pyrimidone (6-4 PP). Étant très mutagènes, la cellule a mis en place des mécanismes de protection afin d’éliminer le dommage avant la survenue de mutations. La voie de réponse au dommage (DDR) est activée suite à une agression aux UV afin de détecter et signaler le dommage à la voie signalétique appropriée (réparation, mort cellulaire). La voie DDR est bien définie après une exposition à une dose unique d’UV, mais les conséquences d’une irradiation chronique aux UV (CLUV) et sa pré-stimulation précédant une dose unique sont méconnues. Nos résultats attestent que la CLUV impacte différemment le cycle cellulaire et la voie de réparation comparée à une dose unique d’UV. De même, elle induit des changements transcriptomiques et protéomiques affectant différentes voies de la DDR. Nous avons aussi démontré que la pré-stimulation par la CLUV améliore la réparation des CPD bien que le traitement CLUV induise des CPD résiduels. Cette augmentation de réparation est confirmée par l’augmentation du niveau de DDB2 et XPC au niveau de la chromatine, deux protéines essentielles dans la reconnaissance du dommage induit par les UV. Finalement, nos analyses confirment la persistance et la tolérance des CPD résiduels dans le génome s’accumulant préférentiellement dans l’hétérochromatine et semblent favoriser l’instabilité chromosomique. Ces données permettent de démontrer les conséquences d’un conditionnement cellulaire sur la modulation de différents mécanismes cellulaires, apportant indéniablement un apport dans la compréhension de la néoplasie induite par les UV. / Ultraviolet (UV) solar exposure is a risk factor for humans since they are responsible for skin cancer induction. UV is a genotoxic agent compromising DNA integrity, resulting in modifications of its structure by pyrimidine dimerization. This dimerization induces conformational changes, which are the consequence of DNA distortion. The two main types of UV-induced DNA damage are the cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and the 6-4 pyrimidine pyrimidone (6-4 PP). Both are involved in mutagenesis by the induction of signature mutations found in cutaneous cancers. Therefore, it is important to understand the fate of these damage and their consequences on the genome. However, cells have protection mechanisms to eliminate damage before their conversion into mutations. These mechanisms allow the activation of the DNA damage response pathway (DDR) in order to detect and signal the damage using the appropriate signalling pathway. Depending on the severity and the amount of DNA damage, cells will repair them or simply eliminate the cell with damaged DNA using the appropriate cell death pathway. While the activation and cellular consequences of these pathways has been well studied after a single UV dose, in real life, we are more exposed to repeated chronic low UV doses (CLUV). Likewise, we do not know the influence of cell conditioning on the different DDR responses, i.e., are cells able to improve their cellular stress response after a pre-stimulation by a CLUV? Thus, we have studied the differences in the activation and regulation of the DDR pathway after a single UV irradiation, a CLUV treatment, and a pre-stimulation by the CLUV treatment followed by a single UV irradiation. We have analyzed more extensively the nucleotide excision repair (NER) pathway, which is activated after UV-induced DNA damage. First, we have developed a chronic irradiation protocol to study its impact on the main DDR mechanisms but also to understand the potential changes induced by such a treatment. Our results demonstrate that CLUV differently affects cell cycle and NER compared to a single UV dose. Furthermore, CLUV induces both transcriptomic and proteomic changes, highlighting the importance to determine the consequences associated with a CLUV irradiation. Our results confirm that the DDR response can be modulated depending on the type of UV protocol used. Subsequently, we were particularly interested in the NER pathway, which is the main mechanism activated after the damage signalling. We have shown that the CLUV treatment induced CPD that are not repaired, but that CLUV pre-stimulation improve the NER efficiency of newly formed CPD which is up to 6 times faster compared to cells receiving only a single UV dose. We then studied the protein levels of DDB2 and XPC, two proteins involved in the DNA damage recognition in the NER pathway. We have quantified their regulation following a CLUV treatment. Our analysis shows that DDB2 and XPC are 2 to 3 times more abundant at the chromatin after a CLUV treatment, suggesting an adaptive potential of the NER pathway. Finally, the consequences of the residual CPD induced by the CLUV treatment have been studied and our analysis shows that they are tolerated in the genome since cells are able to divide even in their presence. These residuals damage are preferentially found at heterochromatin level and at the TT dipyrimidine site, but seem to promote chromosomal instability as we found an increase of sister chromatid exchange. Our results shed some light of key element regarding cell conditioning by the CLUV treatment as well as the potential adaptive cellular mechanisms involved. Finally, this thesis brings new information in the understanding and the modulation of the DDR pathway according to the use of UV regimen.

L'ADN topoisomérase II (TOP2) joue un rôle critique dans les processus métaboliques de l'ADN. Elle catalyse le passage d'un segment d'ADN intact à travers un second via une cassure double brin transitoire. L'objectif de cette étude in vitro était de déterminer le rôle des distorsions de structure et . de la torsion superhélicoïdale comme déterminants potentiels des clivages induits par les TOP2a humaine (hTOP2a) et TOP2 de drosophile (DmTOP2). Nous avons utilisé un plasmide (pBS-SAR) contenant un segment de SAR du gène interféron-~ 1 humain comme substrat. La spécificité des sites de clivage induits par les TOP2 a été analysée par extension-ligation-mediated-PCR (ELMPCR). Cette technique détecte des cassures d'ADN dépourvues d'extrémité 5' -phosphate, telles que les extrémités bloquées produites par les TOP2. Des cinétiques de relaxation ont révélé que la hTOP2a était au moins 10 fois plus active sur le SAR que sur l'ADN plasmidique. Nous avons montré qu'en présence d'étoposide et d'un rapport enzyme:DNA bas, la hTOP2a induit deux clivages forts dans le plasmide surenroulé mais aucun dans le plasmide relaxé. Ceux-ci ont été localisés en bordure de zones dont l'hypersensibilité à la bléomycine et la nucléase SIest accentuée par la torsion, suggérant que la reconnaissance d'une altération de structure induite par superhélicité est requise pour un clivage TOP2 efficace, dans ces conditions. Avec un rapport enzyme:ADN élevé, les patrons de clivage du pBS-SAR surenroulé par hTOP2a et DmTOP2 étaient similaires. Par contre, la reconnaissance de particularités intrinsèques à la structure de l'ADN linéaire semble suffire au clivage induit par hTOP2a mais non DmTOP2. En absence d'étoposide, et en présence d'ATPyS substituant l'ATP, la DmTOP2 et la hTOP2a clivent l'ADN dans les zones du SAR qui sont intrinsèquement hypersensibles à la nucléase SI et au KMn04, à des sites distincts des principaux clivages induits par étoposide. En conclusion, nos résultats supportent un modèle dans lequel des distorsions intrinsèques à la structure primaire du SAR, qui peuvent être accentuées par des altérations de structure induites par torsion superhélicoïdale, conjointement avec les interactions drogue-enzyme, agissent comme signaux de reconnaissance des sites de clivage des TOP2, et possiblement comme catalyseurs de la réaction de clivage.

Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / L'instabilité génomique est considérée comme l'une des « caractéristiques du cancer ». Au cours des dernières décennies, divers processus de réparation de l'information génétique ont été découverts, nous permettant de mieux comprendre comment la dérégulation de ces processus peuvent conduire au développement du cancer. Notre groupe de recherche s'intéresse particulièrement au processus de réparation des cassures double-brin (DSBs) de l'ADN, la forme la plus nocive de dommages à l'ADN. La jonction d'extrémités non homologues canonique (c-NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) sont les principales voies de réparation des DSBs. Afin d'enclencher la réparation des DSBs, les cellules régulent soigneusement le choix entre ces deux processus de réparation. Le processus de résection de l'ADN facilite le choix entre ces voies de réparation. La résection de l'ADN est caractérisée par la dégradation de l'ADN pour créer un long substrat d'ADNsb favorisant la réparation par HR. En revanche, l'inhibition de la résection de l'ADN favorise la réparation des DSB par la voie c-NHEJ. Les mutations de perte de fonction des protéines impliquées dans la facilitation de la résection de l'ADN conduisent souvent à des troubles génétiques et au développement de cancers. Le développement du cancer a souvent été associé à des mutations de BRCA1, une protéine impliquée dans la résection de l'ADN et le processus de réparation des RH. La létalité synthétique est devenue un concept important dans la réparation de l'ADN et la recherche sur le cancer. Il décrit le phénomène par lequel l'inactivation simultanée de deux événements conduit à la létalité cellulaire, même si chaque événement individuellement est toléré. Le traitement contre le cancer basé sur la létalité synthétique le plus efficace qui ait été développé jusqu'à présent utilise les inhibiteurs de PARP (PARPi). PARP-1 dans une protéine impliquée dans divers processus cellulaires, dont la régulation de la réparation de l'ADN. Il a été constaté que l'inhibition de PARP-1 est synthétiquement létale avec un déficit en HR. Les tumeurs déficientes en HR, sont sensibles aux PARPi alors que leurs homologues cellulaires normaux HR-compétents tolèrent le traitement. Cependant, bien qu'il s'agisse d'une option de traitement prometteuse, de nombreux patients développent encore une résistance aux PARPi. Une façon par laquelle les tumeurs déficientes en BRCA1 développent une résistance à PARPi est la réactivation de la résection de l'ADN. En l'absence de BRCA1 fonctionnel, les inhibiteurs de la résection de l'ADN empêchent l'utilisation de HR pour la réparation des DSBs. Des mutations de perte de fonction dans ces inhibiteurs de la résection de l'ADN entraînent la réactivation de la résection de l'ADN et de la HR. Par conséquent, il est important de comprendre la relation entre les protéines qui facilitent la résection de l'ADN et celles qui l'inhibent. Avec cette compréhension, de meilleures approches pour atténuer le développement de la résistance peuvent être développées. Dans cette thèse, nous approfondissons la relation entre l'inhibition de la résection de l'ADN et le développement de la résistance aux PARPi. Nous discutons du processus de résection de l'ADN et de la façon dont divers inhibiteurs de la résection de l'ADN fonctionnent pour inhiber la réparation par RH. Nous décrivons une méthode pour développer de nouveaux inhibiteurs chimiques qui peuvent être utilisés pour cibler MRE11, une composante importante de la machinerie de résection de l'ADN. De plus, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de la résection de l'ADN, DYNLL1, et caractérisons son rôle dans l'inhibition de la résection de l'ADN. Enfin, nous contribuons davantage à la compréhension du mécanisme d'action d'un inhibiteur connu de la résection de l'ADN, RIF1. En outre, nous identifions une nouvelle interaction synthétique létale entre RIF1 et MRE11 qui pourrait être avantageuse dans le développement d'un nouveau traitement contre le cancer avec un défaut dans l'une ou l'autre des protéines. En résumé, nous décrivons de nouveaux mécanismes d'action pour la régulation négative de la résection de l'ADN impliquant DYNLL1 et RIF1. De plus, ces résultats placent MRE11 au cœur de la régulation de la résection de l'ADN, soulignant l'importance du développement de nouveaux inhibiteurs chimiques qui le ciblent. / Genomic instability is considered to be one of the "Hallmarks of Cancer". In recent decades, research on the topic has uncovered various DNA repair processes that cells use to maintain genome stability. This has also given us a better understanding of how errors from and dysregulation of these processes can lead to cancer development. Our research group is particularly interested in the repair process for DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful form of DNA damage. Canonical Non-Homologous End-Joining (c-NHEJ) and Homologous (HR) Recombination are the major DSB repair pathways. In order to facilitate proper DSB repair, cells carefully regulate the choice between these two repair processes. One manner in which cells facilitate the choice between these two pathways is through the process of DNA resection. DNA resection is the degradation of DNA following DSB induction to create a long ssDNA substrate that favours HR repair. In contrast, inhibition of DNA resection favours DSB repair through the c-NHEJ pathway. Loss-of-function mutations of proteins involved in facilitating DNA resection often lead to genetic disorders and cancer development. Cancer development has often been associated with mutations in BRCA1, a protein involved in the DNA resection and HR repair process. Synthetic lethality has become an important concept in DNA repair and cancer research. It describes the phenomenon wherein the simultaneous occurrence of two events leads to unviability or lethality, in this case of the cell, even though each event individually is tolerated. In cancer research, this has been taken advantage of when developing novel treatments particularly in cancer types with a frequently occurring mutation. The most successful synthetic lethality-based cancer treatment that has been developed thus far has been PARP inhibitors (PARPi). PARP-1 in a protein involved in various cellular processes, including the regulation of DNA repair. It was found that PARP-1 inhibition is synthetically lethal with a deficiency in HR. It was found that HR-deficient tumours, especially those with a loss-of-function mutations in BRCA1, are sensitive to PARPi treatment whereas their HR-proficient normal cell counterparts tolerated the treatment. In the clinic, this meant that patients with cancers that are BRCA1-deficient can be effectively treated with PARPi. However, although a promising treatment option, many of the patients still develop PARPi resistance requiring the need for other treatment options. It has been found that one manner in which BRCA1-deficient tumours develop PARPi-resistance is through the reactivation of DNA resection. In the absence of functional BRCA1, DNA resection inhibitors prevent the use of HR for the repair of DSBs. One of the ways these tumours develop PARPi-resistance is by developing loss-of-function mutations in these DNA resection inhibitors. These mutations lead to the reactivation of DNA resection and HR. Therefore, it is important to understand the relationship between proteins that facilitate DNA resection and those that inhibit it. With this understanding, better approaches for mitigating development of resistance can be developed. To further understand the relationship between DNA resection inhibition and PARPi-resistance development, we discuss what is known in the literature about the DNA resection process and how various DNA resection inhibitors work in order to inhibit HR repair. We describe a method for developing novel chemical inhibitors that can be used to target DNA repair proteins using MRE11--an important component of the DNA resection machinery--as an example. Furthermore, we identify a novel DNA resection inhibitor, DYNLL1, and characterize its role in DNA resection inhibition. Lastly, we contribute further to the understanding of the mechanism of action of a known DNA resection inhibitor, RIF1. Furthermore, we identify a novel synthetic lethal interaction between RIF1 and MRE11 that could be advantageous in the development of novel cancer treatment with defect in either protein. In summary, we describe novel mechanisms of action for the negative regulation of DNA resection involving DYNLL1 and RIF1. Furthermore, these results put MRE11 at the heart of DNA resection regulation highlighting the importance of development of novel chemical candidates that target it.

Les cassures double-brin de l'ADN, lorsque incorrectement réparées, peuvent avoir des conséquences fatales telles que des délétions et des réarrangements chromosomiques, favorisant la carcinogenèse. La poly(ADP-ribosyl)ation réalisée par la protéine poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) est l'une des premières modifications post-traductionnelles qui se produisent en réponse aux dommages à l'ADN. La PARP-1 utilise la nicotinamide pour générer un polymère chargé négativement, nommé poly(ADP-ribose) polymère (PAR), lequel est attaché en majorité à la PARP-1 elle-même ainsi qu'à d'autres protéines cibles. Le PAR a récemment été reconnu comme un signal de recrutement pour certaines protéines de réparation aux sites de dommages à l'ADN, mais un débat est en cours quant au rôle précis de la PARP-1 et du PAR dans la réponse aux dommages de l'ADN. Au cours de mon projet de doctorat, nous avons pu confirmer que les protéines qui se retrouvent en complexe avec le PAR immédiatement après les dommages à l'ADN sont principalement des facteurs de réparation. Étonnamment, les complexes protéiques associés au PAR pendant la période de récupération suite aux dommages sont enrichis en facteurs de liaison à l'ARN. Toutefois, la protéine liant l'ARN la plus abondante que nous avons détectée dans l'interactome du PAR, soit NONO, ne suit pas cette dernière cinétique puisqu'elle est fortement enrichie immédiatement après les dommages à l'ADN. Notre étude subséquente de NONO dans la réponse aux cassures double-brin de l'ADN a étonnamment révélé une implication directe de celle-ci par le mécanismede réparation de jonction des extrémités non-homologues. En plus, nous avons constaté que NONO se lie fortement et spécifiquement au PAR via son motif 1 de la reconnaissance de l'ARN, soulignant la compétition entre les PAR et l'ARN pour le même site de liaison. Fait intéressant, le recrutement in vivo de NONO aux sites de dommages de l'ADN dépend entièrement du PAR et nécessite le motif 1 de la reconnaissance de l'ARN. En conclusion, nos résultats établissent NONO comme une nouvelle protéine impliquée dans la réponse aux cassures double-brin de l'ADN et plus généralement démontrent un autre niveau de complexité supplémentaire dans l'interdépendance de la biologie de l'ARN et la réparation de l'ADN. / DNA double-strand breaks are potentially lethal lesions, which if not repaired correctly, can have harmful consequences such as carcinogenesis promoted by chromosome deletions and rearrangements. Poly(ADP-ribosyl)ation carried out by poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is one of the first posttranslational modifications occurring in response to DNA damage. In brief, PARP-1 uses nicotinamide to generate a negatively charged polymer called poly(ADP-ribose) polymer (PAR), that can be attached to acceptor proteins, which is to a large extent PARP-1 itself. PAR has recently been recognized as a recruitment signal for key DNA repair proteins to sites of DNA damage but the precise role of PARP-1 and its catalytic product PAR in the DNA damage response are still a matter of ongoing debate. Throughout my doctoral work, we confirmed that the proteins in complex with PAR promptly after DNA damage are mostly DNA repair proteins, whereas during the period of recovery from DNA damage, the PAR interactome is highly enriched with RNA processing factors. Interestingly, one of the most abundant RNA-binding proteins detected in the PAR interactome, namely NONO, did not follow these kinetics as it was highly enriched immediately after DNA damage in the DNA repair protein complexes centered on PAR. Our subsequent investigation of NONO in the DNA damage response to double-strand breaks strikingly revealed a direct implication for NONO in repair by nonhomologous end joining (NHEJ). Moreover, we found that NONO strongly and specifically binds to PAR through its RNA-recognition motif 1 (RRM1), highlighting competition between PAR and RNA for the same binding site. Remarkably, the in vivo recruitment of NONO to DNA damage sites completely depends on PAR and requires the RRM1 motif. In conclusion, our results establish NONO as a new protein implicated in the DNA damage response to double-strand break and in broader terms add another layer of complexity to the cross-talk between RNA-biology and DNA repair.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie récessive rare associée à un défaut dans la voie de réparation des cassures double-brin de l’ADN causées par des agents pontants (voie de l’AF). Ces agents pontant l’ADN créent un lien covalent entre les deux brins et bloquent les polymérases lors de la réplication ou de la transcription. Mon projet s’intéresse à une protéine importante de la voie de l’AF : FANCI. Celle-ci est décrite comme agissant de pair avec la protéine FANCD2 pour recruter la machinerie de réparation de l’ADN. Nous posons l’hypothèse que FANCI a un rôle important lors du développement, lors de la méiose et est impliquée dans la résistance des cellules aux aldéhydes. Suite à la création d’un modèle murin déplété en FANCI, nous avons effectué des essais comportementaux de mémoire ou d’anxiété pour caractériser le modèle plus en profondeur. Ensuite, des résultats de coupes histologiques de gonades ont mené à la confirmation de la stérilité des souris KO. Plus spécifiquement, un étalage de chromosomes méiotiques et une immunofluorescence ont été effectués pour vérifier la localisation de FANCI sur ces derniers. De plus, le traitement à la mitomycine C (agent pontant) de cellules embryoniques conférant une instabilité génomique, nous avons voulu tester l’effet d’une source endogène, les aldéhydes, sur des cellules déplétées en FANCI. Nous avons observé les foyers des protéines 53BP1 et γ-H2AX pour vérifier l’accumulation de cassures double-brin. Les essais comportementaux montrent une tendance non significative. Une co-localisation de FANCI avec le marqueur de résection RPA est observée. De plus, la déplétion de FANCI rend les cellules résistantes aux aldéhydes. Les foyers 53BP1 et γ-H2AX montrent qu’une petite population de ces mêmes cellules a un nombre très élevé de dommages à l’ADN alors que d’autres ont un niveau de dommages similaire au contrôle. / Fanconi anemia (FA) is a rare recessive disease associated with a defect in the pathway of DNA double strand breaks repair (FA pathway). These double stranded breaks are caused by crosslinking agents by creating a covalent bond between the two opposite strands and blocking polymerases during DNA replication or transcription. My project’s principal interest is a major protein it this pathway : the FANCI protein. It is described as acting together with FANCD2 protein to recruit DNA repair machinery. We hypothesised that FANCI has an important role in development, in meiosis and that it is implicated in cells’ aldehydes resistance. After the creation of a mouse model depleted in FANCI, with did anxiety and memory behavior tests to deeply characterize our mouse model. Also, results of gonad histologic cuts confirmed mouse sterility. More specifically, we did a meiotic spread and immunofluorescence to see FANCI on meiotic chromosomes. We also treated embryonic fibroblasts with mitomycin C, an exogenous crosslinking agent, and then wanted to check with an endogenous source, like aldehydes, on FANCI depleted human cells. We also observed 53BP1 and γ-H2AX foci formation to check for double strand break accumulation. Behavior tests do not show any significative tendancy. We observe a colocalization between FANCI and the resection marker RPA. Moreover, FANCI depletion gives an aldehyde resistance to cells. 53BP1 and γ-H2AX foci show a population of cells with a very high level of foci and others that have the same amount of foci as the control cells.

Les rayons ultraviolets (UV) sont les principaux responsables de l’initiation des cancers cutanée, car ils induisent différents dommages à l’ADN, dont les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ces dommages sont principalement induits par les UVB et sont responsables de la formation des mutations trouvées les cancers cutanés non mélanocytiques. Nos résultats ont démontré qu’une irradiation chronique à de faibles doses de rayons UVB (CLUV) induit la formation de CPD, qui persistent dans le temps. Ces dommages résiduels s’accumulent dans le génome et ne semblent pas être réparés. Nous nous sommes donc intéressés à ces dommages résiduels et à leur impact dans le génome. Premièrement, la distribution post-irradiation des CPD résiduels a été observée pour des fibroblastes dermiques humains soumis à une irradiation CLUV (75 J/m² aux 12h, durant 7,5 jours). Ces analyses ont démontré que les CPD résiduels sont tolérés et dilués dans le génome lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, la localisation des CPD résiduels a été observée pour les cellules irradiées avec une CLUV et pour les cellules irradiées avec une dose unique et aigüe (400 J/m²). La quantification des CPD résiduels a permis d’observer que pour les cellules irradiées avec une CLUV, environ deux fois plus de CPD résiduels sont présents dans l’hétérochromatine par rapport à l’euchromatine. Pour les cellules irradiées avec une dose aigüe, les CPD sont répartis également entre les deux fractions de la chromatine. Ces résultats suggèrent que l’état de compaction de la chromatine a un impact sur l’accumulation et la réparation des CPD. Troisièmement, la fréquence de chaque type dipyrimidinique de CPD résiduels a été déterminée par la technique de LC-MS/MS. Une proportion plus faible de CPD contenant des cytosines a été observée dans les cellules irradiées avec la CLUV par rapport aux cellules irradiées avec la dose aigüe. De plus, l’analyse a démontré que les photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP) étaient presque complètement absents des dommages résiduels. Finalement, afin d’observer l’impact des CPD résiduels sur la stabilité génomique, la quantité d’échanges de chromatides sœurs (SCE) a été comparée pour les cellules irradiées par la CLUV et les cellules non irradiées. La quantité de SCE observée était plus élevée dans les cellules irradiées que dans les cellules non irradiées. Globalement, nous avons observés que les CPD résiduels, majoritairement de type TT, s’accumulent principalement dans l’hétérochromatine, où ils sont tolérés. Ces dommages sont dilués dans le génome au fil des divisions cellulaires, en causant une augmentation de l’instabilité génomique. Globalement, mon projet a permis de mieux comprendre l’impact des CPD résiduels induits par une irradiation chronique dans l’initiation de la cancérogenèse cutanée. / Ultraviolet (UV) rays are known to be the main initiator of skin cancer, as they induce different types of DNA damage, including cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). CPD are mostly produced by UVB rays and are the predominant premutagenic DNA damage responsible for non-melanoma skin cancers. While most CPD are repaired by the nucleotide excision repair (NER) pathway, some remain unrepaired and persist in the genome. We recently observed those residual CPD after exposure of human fibroblasts cells to chronic low dose of UVB (CLUV). Then, we aimed to observe the distribution of residual CPD occurring in dividing cells submitted to CLUV irradiation. Human dermal fibroblasts were irradiated with CLUV (75 J/m² every 12h for 7.5 days). Our results showed that residual CPD are tolerated and diluted in the genome by DNA replication. Then, localization of CLUV-induced residual CPD was observed and compared with residual CPD induced by a single and acute UVB irradiation (400 J/m²). Euchromatin and heterochromatin fraction were isolated and the amount of CPD was quantified in each fraction. The quantification showed that residual CPD accumulate mostly in the heterochromatin fraction of the genome, where the amount of CPD was two times greater than in the euchromatin. This suggests that DNA compaction has an impact on CPD accumulation and repair. Then, we measured the frequency of the different types of residual CPD by LC-MS/MS technique. A lower proportion of cytosine containing CPD was found in CLUV irradiated cells than in acute irradiated cells. The quantification of the different types of 6-4 photoproducts (6-4 PP) demonstrated that they were almost all absent after a CLUV irradiation, in the residual damage. Finally, genomic instability was investigated in CLUV irradiated cells by measuring the amount of SCE induced after the irradiation. A higher number of SCE was observed in CLUV-irradiated cells than in control cells, suggesting that residual CPD are responsible for an increase of genomic instability. Overall, we observed that residual CPD, mostly TT-CPD, accumulate in the heterochromatin where they are tolerated. These CPD are diluted during cellular division but they are causing genomic instability. Finally, my project aimed to characterise residual CPD induced by chronic irradiation and to gain more knowledge on their impact in skin carcinogenesis initiation.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / De toutes les lésions qui menacent l'intégrité du génome, les cassures double-brin (CDBs) de l'ADN sont l'une des plus délétères, puisque toute cassure mal réparée suffit à induire des mutations et des translocations chromosomiques pouvant mener au cancer. La recombinaison homologue (RH) est un processus permettant aux cellules de réparer les CDBs de façon fidèle sans créer de mutations. Chez les eucaryotes supérieurs, ce mode de réparation repose en grande partie sur les fonctions catalytiques de la recombinase RAD51 et des évidences génétiques démontrent que ses paralogues, RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 et XRCC3, sont également des acteurs clés dans ce processus. Jusqu'à présent, les paralogues de RAD51 n'ont été que très peu caractérisés sur le plan cellulaire et moléculaire si bien que leurs fonctions précises demeurent mal définies. Dans cette étude, nous apportons des évidences implicant les paralogues de RAD51 humains dans les étapes précoces de la RH. Plus précisément, nous démontrons que le paralogue RAD51C interagit avec la recombinase RAD51 et qu'il est requis pour l'assemblage de cette dernière en foyers de réparation. De plus, nous établissons par des immunoprécipitations de chromatine que les paralogues sont recrutés à proximité d'une CDB unique en phase S-G2 du cycle cellulaire et nous montrons par immunofluorescence que RAD51C s'y accumule en foyers, une signature des enzymes de réparation. Par ailleurs, nous avons découvert que les paralogues de RAD51 jouent un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire. Tandis que l'inhibition par ARN interférence de RAD51B ou RAD51C provoque un arrêt prolongé en G2-M, celle de XRCC3 favorise l'entrée en mitose par le phénomène d'adaptation. La microscopie en temps réel a démontré que la perte de XRCC3 engendre un délai mitotique qui s'accompagne d'une fréquence élevée d'anomalies de centrosomes et de défauts de ségrégation chromosomique (micronoyaux et ponts anaphases). Des phénotypes mitotiques comparables sont obtenus suivant la depletion de la résolvase GEN1. Conséquemment, nous proposons qu'une fonction tardive de XRCC3 et de GEN1 dans la RH, soit au niveau de la résolution des jonctions de Holliday, puisse être à l'origine de ces aberrations mitotiques. L'ensemble de ces données permet d'éclaircir les fonctions distinctes et communes des paralogues de RAD51 lors de la RH ainsi que leur rôle dans le maintien de la stabilité du génome en mitose.

Les cassures double-brin (CDBs) de l’ADN sont généralement néfastes pour la cellule, toutefois il existe une exception importante à cette règle. Chez la levure et les autres eucaryotes, Spo11 (ou Rec12 chez S. pombe) est décrit comme étant capable de créer des CDBs, bris de l’ADN nécessaire à l’initiation de la recombinaison méiotique. Des analyses génétiques et bioinformatiques ont démontré que les homologues de Spo11 lient l'ADN double-brin sous la forme d’un dimère. Leur activité topoisomérase permet d’ailleurs de cliver l’ADN pour générer des intermédiaires ADN-protéine transitoires et covalents. Cependant, cette observation a été mise en doute par les biochimistes, mais aussi par le fait qu'il est extrêmement difficile de purifier les protéines Spo11 dans des conditions natives. Pour mieux comprendre comment Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) génère des CDBs, nous avons établi un protocole de purification par triple affinité et effectué des essais in vitro permettant de montrer le rôle de Spo11 dans la formation de CDBs. Nous avons également purifié Rec12 - Y98F (mutant catalytique) et Rec12 - G202E (mutant de liaison à l'ADN). La protéine Rec12 s’avère être capable de catalyser la formation de CDBs de l'ADN superenroulé alors que les mutants Rec12-Y98F et Rec12-G202E sont inactivés. En accord avec l'accumulation de Spo11 aux CDBs durant la méiose, nous observons que Rec12 possède plusieurs sites de liaison à l’ADN préférant l'ADN 5'-protubérant à l'ADN 3’-protubérant. Nous avons également analysé biochimiquement le mécanisme par lequel Rec12 est enlevé des CDBs par la nucléase Rad32 (Mre11). Certains des résultats présentés ont été confirmés à l'aide Spo11 humain et de S. cerevisiae. Le rôle des activités endo- et exonuclease du complexe MRE11 - RAD50 - NBS1 (MRN) dans la régulation de la voie de réparation des CDBs par l’utilisation d’inhibiteurs (endo ou exo) spécifiques à la structure de MRE11 sera discuté. En somme, nos résultats démontrent que Rec12 est responsable de la formation de CDBs et que cette activité est régulée par plusieurs domaines de liaison à l'ADN. Cette étude représente une première analyse de la fonction biochimique de Spo11 chez la levure et l’humain dans des conditions natives. / Double-strand breaks are generally harmful to the cell, although there is an important exception to this rule. In yeast and other eukaryotes, Spo11 (or S. pombe Rec12) is known to create double-strand DNA breaks (DSBs), which are important to initiate meiotic recombination. Genetic and bioinformatic analyses proposed that Spo11 homologues bind double-strand DNA as a dimer and cleave the DNA by a topoisomerase-like reaction to generate transient, covalent protein-DNA intermediates. However, this view has been challenged by biochemists, but also by the fact that it is extremely difficult to purify proteins Spo11 under native conditions. To understand how Schizosaccharomyces pombe Spo11 (Rec12) generates double-strand breaks, we established a protocol for triple affinity purification. We performed in vitro assays, reminiscent of the function of Spo11 in DSB formation. The resulting purified Rec12 was pure as judged by Sypro staining. We also purified Rec12-Y98F (catalytic mutant) and Rec12-G202E (DNA binding mutant). Purified Rec12 catalysed double-strand break formation on supercoiled DNA whereas Rec12-Y98F and Rec12–G202E were inactivated. Rec12 showed activity on supercoiled DNA but not in short double-stranded DNA oligonucleotides. We mapped the possible DNA binding motifs on Rec12. Using purified mutants, we biochemically confirmed that Rec12 contains multiple DNA binding sites. Rec12 binds 5’-tailed DNA but not 3’-tailed DNA, which is reminiscent of the accumulation of Spo11 on meiotic DNA double-strand breaks. We also analyzed biochemically how Rec12 is removed from DSBs by the Rad32 (Mre11) nuclease to produce single-strand overhang that can undergo DNA recombination. Some of the results presented were also confirmed using human and S. cerevisiae Spo11. We also discuss how endo- and exonuclease activities of MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) complex regulates double-strand break repair pathway choice. By using structure-based designed MRE11 endo- or exonuclease inhibitors we represented here specific nuclease roles in DSB repair. Altogether, our results indicate that Rec12 is responsible for the formation of double-strand breaks, an activity that is regulated by multiple DNA binding sites. This study represents a first glimpse of the biochemical function of yeast or human Spo11 under native conditions.

L’hypertension artérielle pulmonaire (PAH) est une condition clinique rare caractérisée par une augmentation progressive de la résistance vasculaire pulmonaire menant à une défaillance cardiaque droite. Sur le plan histologique, plusieurs processus coexistent au sein des artères pulmonaires, notamment de l’inflammation, une vasoconstriction et un remodelage vasculaire. Ce dernier est principalement la conséquence d’une prolifération incontrôlée des cellules musculaires lisses (PASMC) résidentes et d’une résistance à l’apoptose de celles-ci. À ce titre, la PAH présente de fortes similitudes avec le cancer. En dépit d’une augmentation des connaissances des mécanismes physiopathologiques et des progrès dans la prise en charge des patients, cette maladie demeure toujours incurable avec un taux de survie de 60% à 5 ans. Il est donc nécessaire de trouver de nouvelles avenues thérapeutiques pour ces patients. Plusieurs stress environnementaux sont présents dans la PAH, notamment l'inflammation, le stress de cisaillement et la pseudo-hypoxie. Malgré ces conditions favorisant les dommages à l’ADN, les cellules vasculaires sont prolifératives et résistantes à l’apoptose. Par des études translationnelles basées sur des tissus humains, nous avons mis en évidence le rôle du dommage à l’ADN et des mécanismes épigénétiques dans la physiopathologie de la PAH. De par ses similitudes avec le cancer, nous nous sommes d’abord intéressés à la poly(ADPribose) polymérase 1 (PARP-1), une enzyme clé dans les processus de réparation de l’ADN et dans le contrôle de la survie cellulaire. Dans le chapitre 2, nous montrons que les poumons, les artères pulmonaires et les PASMC isolées de patients atteints de PAH présentent davantage de dommages à l’ADN et une surexpression de PARP-1. De manière intéressante, nous avons montré que PARP-1 pouvait réguler des facteurs de transcription impliqués dans la pathogénèse de la PAH tels que HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1- alpha) et NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). La surexpression de PARP-1 entraînait également la diminution d’expression du microARN miR-204, un autre acteur clé de la maladie. L’effet thérapeutique des inhibiteurs de PARP-1 a été évalué dans deux modèles animaux de la PAH. L’administration de ces inhibiteurs a diminué le remodelage vasculaire pulmonaire et amélioré les paramètres hémodynamiques. De plus, l’inhibiteur pharmacologique de PARP-1 était plus efficace que les traitements de première ligne offerts aux patients atteints de PAH. Dans le chapitre 3, nous avons étudié les mécanismes par lesquels PARP-1 était surexprimé dans la PAH. En se basant sur des études dans le cancer et sur des prédictions bio-informatiques, nous nous sommes intéressé au microARN miR-223. Nous avons démontré que miR-223 est diminué au niveau vasculaire pulmonaire et dans les PASMC isolées de patients atteints de PAH. Par une approche bidirectionnelle, nous avons mis en évidence qu’une augmentation de HIF-1α diminue l’expression de miR-223 et que la diminution de miR-223 entraîne une augmentation de PARP-1, ce qui favorise la réparation des dommages à l’ADN. Nous avons montré que la diminution de miR-223 était également associée à une augmentation de la prolifération des PASMC et de la résistance à l’apoptose de celles-ci. Dans un modèle animal de la maladie, nous avons montré que l’augmentation ectopique de miR-223, à l’aide de mimic, permettait d’améliorer les paramètres hémodynamiques pulmonaires et cardiaques. Dans le chapitre 4, nous avons étudié un mécanisme épigénétique en aval de PARP-1 et miR-204. Nous avons montré que le lecteur épigénétique BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) était surexprimé dans les tissus pulmonaires de patients atteints de PAH. Les lecteurs épigénétiques se lient aux queues acétylées des histones afin de favoriser la transcription de différents gènes. Dans la PAH, nous avons mis en évidence que BRD4 régule l’expression d’oncogènes impliqués dans la physiopathologie de la maladie, tels que p21, NFAT, Bcl-2 et Survivin. BRD4 régule également le métabolisme mitochondrial des PASMC. Nous avons montré que l’inhibition de BRD4 permettait de diminuer la prolifération, d’augmenter l’apoptose et de restaurer l’activité mitochondriale des PASMC. L’utilisation d’inhibiteurs de BRD4 dans un modèle de rat atteints de PAH a permis de mettre en évidence le potentiel thérapeutique de l’inhibition de ce lecteur épigénétique dans la PAH. En conclusion, ces études ont permis de mettre en lumière de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la physiopathologie de la PAH et d’ouvrir la porte à de nouvelles avenues thérapeutiques dans le traitement de cette maladie toujours incurable. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare clinical condition characterized by a progressive increase in pulmonary vascular resistance leading to right heart failure and death. Histologically, several processes coexist within the pulmonary arteries, including inflammation, vasoconstriction and vascular remodeling. Remodeling of the pulmonary vessel is due to abnormal and uncontrolled growth of resident pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). As such, PAH exhibits some cancer-like characteristics. In spite of recent progress in understanding the pathophysiological mechanisms involved in disease development and progression, as well as major improvements in symptomatic treatments, no substantial modification in the fatal course of this disease has been achieved. The mean survival rate is about 60% 5 years after diagnosis. Therefore, the identification of new targets has become mandatory. PAH is associated with sustained inflammation, oxidative stress, shear stress and pseudo-hypoxia, all known to promote DNA damage. Despite these unfavorable environmental conditions, PAH PASMC exhibit increased proliferation and resistance to apoptosis. Using a translational approach, we highlighted the role for DNA damage signaling and epigenetic mechanisms in the pathophysiology of PAH. Since PAH shares many hallmarks with cancer, we first studied Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), a key enzyme in DNA repair mechanisms and in cell survival in the pathophysiology of PAH. In Chapter 2, we demonstrate that PAH is associated with sustained DNA damage leading to PARP-1 activation. Interestingly, we showed that PARP-1 overexpression triggers the expression and activation of transcription factors known to be implicated in PAH progression, such as HIF-1α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) and NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). Overexpression of PARP-1 alsoresulted in decreased expression of microRNA miR-204, another key player in the disease. In animal studies, administration of a clinically available PARP-1 inhibitor decreased PAH in two experimental rat models. In addition, PARP-1 inhibitor was more effective than the first-line treatments offered to patients with PAH. In Chapter 3, we investigated the mechanisms by which PARP-1 was overexpressed in PAH. In silico analyses and studies in cancer demonstrated that miR-223 downregulation triggers PARP-1 overexpression. We provided evidence that miR-223 is downregulated in human PAH lungs, distal pulmonary arteries, and isolated PASMC. Furthermore, using a gain and loss of function approach, we showed that increased HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1α), which is observed in PAH, triggers this decrease in miR-223 expression and subsequent overexpression of PARP-1 allowing PAH-PASMC proliferation and resistance to apoptosis. We also demonstrated that restoring the expression of miR-223, by using a mimic, allowed to improve pulmonary and cardiac hemodynamic parameters. In Chapter 4, we investigated epigenetic mechanisms downstream of PARP-1 and miR- 204. Interestingly, the epigenetic reader BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) is a predicted target of miR-204 and has binding sites on NFAT’s promoter region. In our study, we showed that BRD4 is upregulated in lungs, distal pulmonary arteries and PASMC of PAH patients. Epigenetic readers bind to acetylated histone tails to promote gene transcription. In PAH, we demonstrated that BRD4 increases the expression of oncogenes involved in PAH pathogenesis, such as NFAT, Bcl-2, p21 and Survivin. BRD4 also regulates mitochondrial metabolism of PASMC. Blocking this oncogenic signature led to decreased proliferation and increased apoptosis of PAH-PASMC in a BRD4-dependant manner. In addition, pharmacological or molecular inhibition of BRD4 reversed established PAH in a rat model of the disease. In conclusion, these studies showed a key role for DNA damage signaling and epigenetic mechanisms in PAH pathophysiology. Our studies also offer new therapeutic perspectives for patients with PAH.