La cryoconservation du sperme a des avantages évidents pour l'industrie animale. Cependant, ce processus semble affecter les propriétés du sperme ainsi que son pouvoir fécondant. La présente thèse vise à étudier l'hypothèse que la congélation du sperme a un impact négatif sur son pouvoir fécondant. Cet impact pourrait être dû à des dommages à l'ADN causés par le stress oxydatif qui accompagne la congélation. Il pourrait aussi découler de l'altération d'autres paramètres fonctionnels suite au processus du congélation-décongélation. Le sperme ovin utilisé provenait de cinq béliers de race Dorset, logés au Centre d'expertise en production ovine du Québec (CEPOQ, La Pocatière, Qc, Canada). Le sperme bovin congelé provenait de 14 taureaux ayant un pouvoir fécondant connu par L'Alliance Boviteq (St-Hyacinthe, Qc, Canada). Immédiatement après la décongélation (0 h) et durant 24 h d'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle, les semences bovines et ovines ont été soumises au SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) et aux tests d'évaluation de qualité du sperme incluant les paramètres de motilité, de viabilité, l'état physiologique (patron de CTC), la peroxydation lipidiques ainsi que les niveaux cytosoliques du calcium. Le premier objectif a porté sur l'étude des effets de la cryoconservation et de l'incubation dans un milieu similaire au tractus génital femelle sur l'intégrité de l'ADN du sperme. Les résultats montrent une altération de l'intégrité de l'ADN juste après la décongélation et durant l'incubation dans le milieu SOF (synthetic oviductal fluid). Cette altération est plus significative dans la semence congelée, par rapport à la semence fraîche. De tels dommages à l'ADN du sperme ovin pourraient être dus au stress oxydatif. Pour tester cette hypothèse, la stabilité de l'ADN ainsi que la peroxydation lipidique (LPO) ont été évaluées dans le sperme de béliers frais et congelé, traité ou non avec du H2O2. Alors que la congélation n'a pas d'effet sur la LPO, le H202 (150 ou 300 uM) affecte l'intégrité de l'ADN après 24 h d'incubation. Également, et malgré la baisse de la motilité et l'augmentation du pourcentage de spermatozoïdes ayant un patron AR de réaction à l'acrosome à 1 h, ni la LPO ni la viabilité du sperme ont été affectées par le H2O2. Cette LPO était corrélée avec l'instabilité de l'ADN. Ces résultats montrent clairement que la cryoconservation facilite l'instabilité de l'ADN de la semence de bélier. Cet effet est, en partie, dû au stress oxydatif. Concernant les essais avec le sperme bovin, deux expériences ont été menées sur 14 taureaux (1 à 4 éjaculats/taureau) classés en deux groupes de haute ou de faible fertilité in vivo évaluée par le taux de non-retour en chaleurs des vaches inséminées. L'essai 1 portait sur l'étude des corrélations entre la stabilité de l'ADN du sperme du taureau et sa fertilité durant une incubation dans le Talp-BSA à 0 et à 7 h. L'essai 2 a porté sur l'étude des corrélations entre les niveaux cytosoliques de calcium du sperme bovin cryopréservé et la fertilité du taureau in vivo. Les résultats montrent que l'altération de l'ADN était significativement plus élevée chez le groupe de faible fertilité à 0 h. En revanche, les niveaux de calcium cytosolique ont été similaires à 0 h et réduites significativement chez les taureaux les plus fertiles à 7 h d'incubation dans le Talp-BSA. À la lumière de ces résultats, il découle que la réduction de la fertilité du taureau in vivo est due aux dommages à l'ADN du sperme cryoconservé. Également, la cytométrie en flux semble être un outil de choix permettant une analyse objective et rapide de plusieurs paramètres spermatiques d'un grand nombre de spermatozoïdes en même temps. Pour ces raisons, il est recommandé d'utiliser l'analyse de cytométrie en flux (y compris le test de l'intégrité de l'ADN) dans l'industrie de l'insémination artificielle afin d'évaluer la qualité du sperme et sa relation avec la fertilité masculine.

Adult Stem Cells (SCs) have been found in almost every organ. They are responsible for<p>homeostasis and tissue repair after injury. SCs reside and self-renew in the adult body<p>throughout the life of the organism. In rapid self-renewing organs, such as the skin, the<p>intestine and the blood, SCs divide many times during the life of the animal in order to sustain<p>the homeostatic needs of the tissue.<p>All cells of the body, including SCs, are constantly subjected to DNA assaults arising from<p>endogenous sources, such as reactive oxygen species (ROS) generated by cellular<p>metabolism, or exogenous assaults arising from the environment. The DNA damage response<p>(DDR) and DNA repair mechanisms protect cells from accumulating DNA damage by<p>inducing transient cell cycle arrest allowing DNA repair, triggering senescence or apoptosis.<p>DNA damages trigger the activation of the effectors of the DDR inducing a transient cell<p>cycle arrest, allowing DNA repair, or triggering a permanent arrest of the cell cycle or<p>apoptosis if damages are too extensive.<p>As skin is the outermost barrier of the body, epidermal cells, including SCs, are<p>continuously subjected to genotoxic stress, such as UV rays, ionizing radiation (IR) and<p>chemicals. The skin epidermis is composed of hair follicles (HFs), its associated sebaceous<p>gland (SG) and the surrounding inter-follicular epidermis (IFE). Different types of SCs<p>maintain the homeostasis of the skin; multipotent adult bulge SCs ensure the cyclic<p>regeneration of the HF and the repair of the epidermis after injury, while individual unipotent<p>SCs ensure homeostasis of the SG and the IFE.<p>In tissues with high cellular turnover, such as the epidermis, the numerous divisions that a<p>SC undergoes could result in the accumulation of replication-associated DNA damage. It has<p>been suggested that adult SCs may undergo asymmetric divisions in which the daughter SC<p>retains the older (thus “immortal”) DNA strand, while the daughter cell committed to<p>differentiation inherits the newly synthesized strand that may have incorporated replicationderived<p>mutations. The in vivo relevance of this mechanism is still a matter of intense debate.<p>We used multiple in vivo experimental approaches to investigate precisely how bulge SCssegregate their chromosomes during HF morphogenesis, SC activation and skin homeostasis.<p>Using pulse-chase experiments with two different uridine analogs together with DNAindependent<p>chromatin labelling, we showed that multipotent HF SCs segregate their<p>chromosomes randomly, and that the label-retention observed in the skin epidermis derives<p>solely from relative quiescence of skin SCs 1.<p>We investigated the in vivo response of multipotent adult HF bulge SCs to DNA damage<p>induced by IR. We showed that bulge SCs are profoundly resistant to DNA damage-induced<p>cell death compared to their more mature counterparts. Interestingly, we demonstrated that<p>resistance of bulge SCs to IR-induced apoptosis does not rely on their relative quiescence.<p>Moreover, we showed that DDR in SCs does not lead to premature senescence. We found that<p>two intrinsic cellular mechanisms participate in the resistance of bulge SCs to DNA damageinduced<p>cell death. Bulge SCs express higher level of the anti-apoptotic Bcl-2 and present<p>more transient activation of p53 due to a faster DNA repair activity mediated by a nonhomologous<p>end joining (NHEJ) mechanism. Since NHEJ is not error free, this property<p>might be a double-edged sword, supporting short-term survival of bulge SCs but impairing<p>long-term genomic integrity 2.<p>While we unveiled the relevance of DSBs repair by NHEJ in the skin epidermis, little is<p>known about the role of homologous recombination (HR) during the morphogenesis of the<p>skin epidermis. Brca1 is an essential protein for HR. Conditional deletion of Brca1 in the<p>developing epidermis leads to congenital alopecia accompanied by a decreased density of hair<p>placodes. The remaining HFs never produce mature hair and progressively degenerate due to<p>high levels of apoptosis. Multipotent adult HF bulge SCs cannot be detected in adult HF in<p>the Brca1 cKO epidermis. Brca1 deletion in the epidermis triggers p53 activation throughout<p>the epidermis, which activates apoptosis. Interestingly, IFE and the isthmus region of the HF<p>do not present any pathological phenotype by constitutive deletion of Brca1. Our results<p>demonstrated the critical role of Brca1 during HF morphogenesis. Future studies will be<p>required to understand the molecular mechanisms controlling this phenotype / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’H2O2, produit en grande quantité dans la thyroïde, est depuis longtemps suspecté de jouer un rôle dans la pathogenèse des nodules et des cancers thyroïdiens. En effet, dans une situation pathologique où la production d'H2O2 serait excessive ou lors d’un défaut de protection par les enzymes de détoxification, l’H2O2 pourrait devenir toxique. In vitro, des quantités modérées d’H2O2 sont capables de provoquer des dégâts à l'ADN similaires à ceux induits par une irradiation de 1 Gy et peuvent même provoquer des réarrangements RET/PTC trouvés dans la plupart des carcinomes papillaires de la thyroïde. <p>La première partie de ce travail visait à mieux comprendre les mécanismes de protections qui pourraient être impliqués dans la défense contre les effets néfastes de l’H2O2 ainsi que le rôle de l’H2O2 dans la cancérogenèse thyroïdienne. Nous avons utilisé des cultures primaires de thyrocytes humains et nous les avons comparées à des lignées cellulaires de diverses origines ainsi qu’à des cultures primaires de lymphocytes T. Les résultats obtenus après traitement à l’H2O2 ont été comparés à ceux obtenus après irradiation, agent carcinogène connu. <p>Nous avons montré, grâce à une méthode fluorimétrique, que le thyrocyte était capable de dégrader de façon très efficace l’H2O2.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui déplète la cellule en glutathion, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN (test des comètes) induites par l’H2O2 dans le thyrocyte ;ce qui suggère que la glutathion peroxydase (GPx) est impliquée dans la protection des thyrocytes en réponse à une agression par l’H2O2. Ceci a été confirmé par une augmentation de l'activité enzymatique de la GPx dans le thyrocyte une heure après une exposition à de l’H2O2 et pas après irradiation. <p>Une augmentation de l’expression de l’Hème oxygénase 1 (HMOX1) a été confirmée par RT-qPCR dans le thyrocyte après un traitement à l’H2O2. Ces résultats concordaient avec les résultats précédemment obtenus par microarray. <p>Les cinétiques de réparation de l'ADN ont montré que les dégâts à l'ADN étaient réparés plus lentement quand ils étaient provoqués par l’H2O2 que par l’irradiation. Les lymphocytes T sont incapables de réparer les dommages causés à l'ADN par l’H2O2. <p>Un pré-traitement des thyrocytes avec de l’H2O2 ralentit la réparation des dégâts à l’ADN induits par l’irradiation ce qui suggère une inhibition des enzymes de réparation en cas de stress oxydant. <p>La deuxième partie du travail a consisté à étudier la réaction de Fenton dans la thyroïde. En effet, un excès de fer libre a été suspecté d’être un facteur favorisant dans la génération de divers cancers dont le cancer thyroïdien. En présence d’H2O2, un excès de fer libre entraine la génération de radicaux hydroxyl, hautement réactifs (réaction de Fenton). <p>Nous avons mesuré les dégâts à l’ADN des thyrocytes pré-incubés avec des concentrations de FeSO4 compatibles avec la survie et traités avec l’H2O2. Une augmentation des dégâts à l’ADN et un ralentissement de leur réparation ont été observés dans les cellules. Les dégâts induits par l’irradiation n’étaient pas influencés par la présence de FeSO4. <p>Enfin, la troisième et dernière partie du travail a consisté à étudier les effets d’une irradiation causée par l’iode131 (I131) et de les comparer à ceux produits par une irradiation γ sur des thyrocytes humains en culture primaire ainsi que sur des lignées thyroïdiennes de rats (FRTL5 et PCCl3). L’irradiation par l’I131 produit moins de dégâts à l’ADN sur le thyrocyte, par le test des comètes, qu’une irradiation γ (Cs137) à doses irradiantes absorbées équivalentes. Un effet dose-réponse de l’irradiation par I’131 sur les lignées cellulaires (FRTL5 et PCCl3) est observé avec des activités radioactives faibles et des temps d’incubation courts.<p>En conclusion, le thyrocyte a développé plusieurs mécanismes de protection efficaces contre le stress oxydant, en particulier contre l’H2O2. Une augmentation du stress oxydant suite à un excès d’H2O2, de fer libre ou d’un défaut d’un des mécanismes de protection pourrait favoriser l'apparition de cancers sporadiques de la thyroïde.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La fumée de tabac contient plusieurs substances carcinogènes qui mènent à la formation constante de petites quantités de dommages à l'ADN dans les poumons des fumeurs ainsi que des non-fumeurs exposés à la fumée environnementale de tabac. La 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) est l'une de ces substances et elle semble plus particulièrement associée avec le développement des adénocarcinomes, la forme de cancer pulmonaire dont l'incidence progresse le plus rapidement ces dernières années. Dans les cellules pulmonaires, la NNK est bioactivée via des cytochromes P450 en intermédiaires réactifs capables de méthyler ou de pyridyloxobutyler l'ADN. Les dommages résultant de ces deux modes d'activation de la NNK peuvent être investigués séparément en utilisant des analogues qui génèrent sélectivement l'un ou l'autre type d'intermédiaires réactifs. Le test des comètes est une technique simple, très sensible et couramment utilisée pour étudier au niveau cellulaire les dommages à l'ADN qui sont peu fréquents. Les travaux présentés dans cette thèse montrent que certains des dommages résultant de l'activation de la NNK peuvent être investigués de manière spécifique à l'aide de cette technique, et ce à des fréquences de dommages qui se rapprochent de celles correspondant à une exposition réelle à la fumée de tabac. Parmi ces dommages, un type d'adduits encore inconnu associé à la pyridyloxobutylation de l'ADN a pu être mis indirectement en évidence. Il s'agit vraisemblablement de la forme formamidopyrimidine (fapy) d'une lésion primaire formée dans les cellules. La vitesse de réparation d'un type de dommage influe sur le risque qu'il a d'être impliqué dans la transformation maligne des cellules. La disparition des dommages dans le temps a pu être suivie avec le test des comètes afin d'investiguer la réparation dans des cellules capables ou pas de bioactiver la NNK. Le suivi post-traitement des dérivés fapy associés à la pyridyloxobutylation de l'ADN, a montré un phénotype ne dépendant pas du type cellulaire mais plutôt du statut de p53 dans les cellules. En effet, au lieu de diminuer après la fin du traitement, la fréquence des adduits fapy dans les fibroblastes augmente dans un premier temps et ce, seulement dans les cellules ayant une protéine p53 fonctionnelle. La nature de ce phénotype particulier n'est pas clairement identifiée, mais elle est vraisemblablement liée à la réparation des dommages à l'ADN. / Tobacco smoke contains several carcinogens that lead to the frequent formation of rare DNA damage in lungs of smokers. 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) is one of these substances that seems more particularly associated with the development of adenocarcinoma. During the last 30 years, the frequency of this lung cancer type has increased significantly. In lung cells, cytochromes P450 can bioactivate NNK into reactive species capable of either methylating or pyridyloxobutylating DNA. The use of analogs capable of generating only one type of NNK-associated reactive species allows to investigate methylation and pyridyloxobutylation separately. The comet assay is a simple and sensitive technique that is commonly used to investigate low frequency DNA damage at the cellular level. The work presented here show how some of the NNK-related DNA damage can be investigated specifically with this technique at damage frequencies that are relevant to a real exposure to cigarette smoke. One of the adduct type resulting of DNA pyridyloxobutylation that we studied here had never been demonstrated before. It corresponds likely to the formamidopyrimidine (fapy) form of a lesion primarily formed in cells. The repair rate of a damage type influences the probability that it has to be implicated in mutagenesis. The time course of different damage types was documented with the comet assay in order to investigate the repair of NNK-related damage in different cell types that can either bioactivate NNK or not. When the fapy adducts associated with pyridyloxobutylation were investigated post-treatment, their time course did not depend on the cell type but showed a p53-dependant phenotype. In fact, instead of decreasing because of repair, the frequency of these fapy adducts in fibroblasts first increased post-treatment and this increase seemed associated with p53 proficiency. The cause of this phenotype is not clearly elucidated but it should be related to DNA damage repair.

La fumée de tabac contient la nitrosamine 4-(méthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) qui serait impliquée dans la cancérogenèse pulmonaire. L'?-hydroxylation de la NNK génère deux métabolites réactifs qui mènent à la méthylation et à la pyridyloxobutylation de l'ADN, et qui peuvent être générés respectivement par la N-acétoxynitrosométhylméthylamine et par la 4-(acétoxyméthylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone. Nous avons observé que la fréquence et la distribution des dommages induits à l'ADN par la méthylation et la pyridyloxobutylation au niveau des gènes p53, ras et c-jun ne sont pas identiques. La fréquence et la distribution des dommages par la méthylation de l'ADN varient avec la classe et la structure chimique des agents méthylants. La pyridyloxobutylation de l'ADN induit des cassures monocaténaires caractérisées par un groupement hydroxyle à l'extrémité 5' et par un groupement bloquant à l'extrémité 3'. La formation de dommages causée par la NNK et la fréquence élevée de dommages à certaines positions nucléotidiques qui correspondent à des positions fréquemment mutées dans le cancer pulmonaire chez le fumeur constitueraient des arguments en faveur d'un rôle de la NNK dans la cancérogenèse pulmonaire associée à la fumée de tabac.

L'exposition aux contaminants de la chaîne alimentaire tels que le méthylmercure et les biphényles polychlorés (BPC) peut induire un stress oxydatif et des dommages à l'ADN, lesquels sont considérés comme des événements primaires dans la carcinogenèse. La population inuit est exposée à des doses élevées de ces contaminants de la chaîne alimentaire par leur alimentation traditionnelle qui comprend plusieurs espèces prédatrices appartenant à la chaîne alimentaire marine. Le but de notre étude était de mesurer à l'aide du test des comètes les cassures dans l'ADN de lymphocytes obtenus d'adultes de la population inuit du Nunavik ayant participé à l'Enquête sur la santé des Inuit en 2004. Nous voulions également examiner la relation entre les concentrations sanguines de mercure ou les concentrations plasmatiques de BPC et les bris à l'ADN lymphocytaire, en contrôlant pour les habitudes de vie, la nutrition et différents autres facteurs potentiellement confondants. Nous n'avons pas trouvé de relation entre le dommage à l'ADN des lymphocytes et les concentrations sanguines de mercure ou les concentrations plasmatiques de BPC. Nous avons par contre observé une corrélation statistiquement significative entre la consommation d'alcool chez les participants et le dommage à l'ADN. Les participants qui consommaient de l'alcool au moins une fois par semaine avaient un dommage à l'ADN lymphocytaire significativement plus élevé que ceux consommant de l'alcool moins d'une fois par semaine. De plus, l'âge des participants était négativement corrélé avec le dommage à l'ADN, ce qui pourrait refléter un effet protecteur d'un ensemble de facteurs chez les participants les plus âgés dont une plus grande consommation d'aliments traditionnels et des consommations plus faibles d'alcool et de tabac. Ces résultats suggèrent donc que la consommation d'alcool augmente le dommage basai à l'ADN chez cette population inuit, mais que ni le méthylmercure ni les BPC ne semblent avoir un effet significatif sur le dommage à l'ADN des lymphocytes dans cette population.