Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) représente 4% de tous les cancers chez la femme et est la première cause de décès parmi les tumeurs gynécologiques. Dans la plupart part des cas le CEO est diagnostiqué dans les stades avancés de la maladie. Le traitement repose sur la chirurgie cytoréductive suivie de la chimiothérapie combinant les dérivés de platine et de taxanes avec un taux de réponse de plus de 80%, cependant, la plupart part des patientes font une récidive par l’émergence de la résistance. Les bases moléculaires du déclenchement et de la progression du cancer de l’ovaire sont encore mal connues empêchant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques et de diagnostique. Au cours d’un cancer, l’hyperméthylation des ilots CpG de certains promoteurs géniques conduit souvent à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. L’hypométhylation des ilots CpG de certains promoteurs est également impliquée dans la réactivation des proto-oncogènes et des gènes pro-métastatiques. Cependant l’hypométhlation de l’ADN dans le cancer de l’ovaire est très peu étudiée. En utilisant la méthode d’immunoprécipitation de l'ADN méthylée combinée à une analyse sur puce (MeDIP-chip), nous avons trouvé que l’hyperméthylation de l'ADN se produit dans les stades précoces du cancer ovarien, tandis que les stades avancés de la maladie sont liés à l’hypométhylation de l’ADN des oncogènes impliqués dans la progression de la tumeur, l’invasion/métastase et probablement dans la chimiorésistance. Cette approche épigénomique a conduit à l’identification de nouveaux oncogènes hypométhylés dans le CEO. Dans cette étude, RUNX2 est identifié comme un gène hypométhylé dans les cellules post-chimiothérapeutiques et GALNT3 et BCAT1 sont parmi les gènes hypométhylés identifiés particulièrement dans le CEO de type séreux. L’analyse fonctionnelle de ces trois gènes montre qu’ils sont associés à la prolifération (y compris le contrôle du cycle cellulaire pour GALNT3 et BCAT1), de la migration et de l'invasion cellulaire dans le CEO séreux, suggérant qu’ils ont un fort potentiel oncogène dans la progression de la tumeur et pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques au niveau du CEO. / Epithelial ovarian cancer (EOC) accounts for 4% of all cancers in women and is the leading cause of death from gynecologic malignancies. Most of EOC cases are diagnosed at advanced stage, which is associated with poor outcome. Despite the good initial response to chemotherapy, recurrence occurs in the majority of patients, resulting in chemotherapy resistance leading to a fatal disease. The molecular basis of EOC initiation and progression is still poorly understood, thus hindering the development of new diagnostic and therapeutic strategies for more effective EOC treatment. In cancer, the hypermethylation of gene promoter CpG islands leads to inactivation of tumor suppressor genes, and CpG islands hypomethylation is associated with proto-oncogenes and pro-metastasis genes. Similar to all malignancies, aberrant DNA methylation occurs in EOC. However, DNA hypomethylation in ovarian cancer is very briefly studied. Using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) coupled to CpG island tiling arrays, we found that DNA hypermethylation occurred in less invasive/early stages of ovarian tumorigenesis, while advanced disease was associated with DNA hypomethylation of a number of oncogenes, implicated in cancer progression, invasion/metastasis and probably chemoresistance. This epigenomic approach has led to the identification of a number of novel oncogenes hypomethylated in EOC. In this thesis study, RUNX2 gene was identified as hypomethyleted gene in post-chemotherapy primary cells cultures and GALNT3 gene and BCAT1 gene were among the genes identified to be notably hypomethylated in serous EOC tumors. Subsequent functional analyses of these three genes demonstrated that they were associated with EOC cell proliferation (including cell cycle control for GALNT3 and BCAT1), migration and invasion, suggesting that they have strong oncogenic potential in serous EOC progression and that they might be novel EOC therapeutic targets.

Le cancer de l’ovaire représente 4% de tous les cancers chez la femme et est la première cause de décès parmi les tumeurs gynécologiques en occident. Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) représente 90% de toutes les tumeurs de l’ovaire. Malgré les avancées médicales et chirurgicales, le taux de survie à long terme demeure décevant en raison de la nature asymptomatique de la maladie. Le traitement repose sur la chirurgie cytoréductive suivie de la chimiothérapie combinant les dérivés de platine et de taxanes avec un taux de réponse de plus de 80%. Cependant, la des patientes font une récidive par l’émergence de la résistance à ces drogues conventionnelles. Les bases moléculaires du déclenchement et de la progression du cancer de l’ovaire sont encore méconnues. Au cours d’un cancer, l’hyperméthylation des ilots CpG de certains promoteurs géniques conduit souvent à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. Parallèlement, l’hypométhylation des ilots CpG de certains promoteurs est également impliquée dans la réactivation des proto-oncogènes et des gènes pro-métastatiques. La technologie des micropuces à ADN est grandement utilisée au niveau de la recherche sur le cancer, y compris celles portant sur les mécanismes et les biomarqueurs associés à la progression et à la chimiorésistance dans les cancers ovariens. Dans ce travail de thèse, nous avons évalué le profil de méthylation abberante dans les différents grades des tumeurs de CEO de type séreux par rapport aux tissus normaux de l’ovaire, et dans les cellules primaires post-chimiothérapeutiques par rapport aux cellules primaires pré-chimiothérapeutiques de l’ovaire de deux patientes. Nos résultats ont montré que l’hyperméthylation est un événement très précoce de la carcinogenèse avec suppression des gènes ayant un rôle protecteur. Alors que l’hypométhylation massive est associée à la phase avancée de la maladie avec la surexpression des gènes impliqués dans l’invasion et la métastase. Découlant de ces études, RUNX1 et RUNX2 ont été identifiés comme des gènes hypométhylés dans les cellules post-chimiothérapeutiques. Les études fonctionnelles ont montré que ces deux gènes sont associés à la prolifération, la migration et l’invasion cellulaire dans le CEO. Cependant, ces effets similaires sont exercés par des mécanismes moléculaires différents. / Ovarian cancer accounts for 4% of all cancers in women and is the leading cause of death among Gynecologic tumours in the western countries. The epithelial ovarian cancer (EOC), which represents 90% of all ovarian tumors. Despite advances in medical and surgical treatment, long term survival rate remains disappointing due to the asymptomatic nature of the disease. The treatment uses cytoreductive surgery followed by chemotherapy combining derivatives of platinum and taxanes with a response rate of over 80%. However, the most part of the patients have a recurrence by the emergence of resistance to these conventional drugs. The molecular basis of the initiation and progression of ovarian cancer are still unknown. During cancer, hypermethylation of gene promoter CpG islands often leads to inactivation of some tumor suppressor genes. At the same time, CpG islands hypomethylation is also associated to reactivation of proto-oncogenes and pro-metastatiques genes. The microarray technology has been successfully used in cancer research, including studies on mechanisms and biomarkers linked to ovarian cancer progression and chemoresistance. In this study, we have evaluated the aberrant DNA methylation profile in tumour grades of serous type EOC compared to normal ovarian tissue, and primary cells culture prior to and post chemotherapy (CT) treatment from 2 EOC patients. Our results showed that hypermethylation is an early event in carcinogenesis with down-regulation of genes having a protective role. While massive hypomethylation is associated with advanced serous EOC with upregulation of genes involved in cell invasion and metastasis. From these studies, we identified RUNX1 and RUNX2 as hypomethylated genes in post-chemotherapy primary cells culture. Sebsequent functional analyses pointed to RUNX1 and RUNX2 association with EOC cell proliferation (including cell cycle control for RUNX1), migration and invasion. However, RUNX1 and RUNX2 display overlapping functions in EOC dissemination, these nevertheless employ distinct molecular mechanisms, specific for each gene. Our data are indicative of strong oncogenic potential of both transcription factors in EOC progression.

INTRODUCTION : Les femmes souffrant d'un cancer du sein (CS) ont un risque accru de développer un second cancer du sein controlatéral (CSC). Ce risque est 3 à 5 fois plus élevé que le risque de développer un premier cancer par des femmes de la population générale. La méthylation de l'ADN est connue pour être impliquée dans le développement du cancer, et des changements dans le profil de méthylation des cellules tumorales mammaires ont déjà été observés. OBJECTIF : Nos objectifs étaient d’étudier les changements de la méthylation globale de l'ADN dans les tissus mammaires normaux ainsi qu’identifier les sites spécifiques différentiellement méthylés qui étaient associés à une augmentation du risque de CSC. MÉTHODES : Il s’agit d’une étude cas-témoins (1:1) nichée dans une cohorte de 1242 femmes avec CS. Les cas (n=20) ont été diagnostiqués avec un CSC pendant leur suivi, mais pas les témoins (n=20). Les cas étaient appariés aux témoins pour les facteurs de risque de CSC tels que l'année de chirurgie, l'âge, l’histoire familiale de CS et le traitement. L’ADN a été extrait des tissus mammaires normaux (pour minimiser l’effet de champs) à plus de 1 cm de la tumeur enrobés en paraffine et la méthylation a été mesurée par Illumina Infinium 450K. RÉSULTATS : L’hypométhylation globale de l’ADN a été associée à une diminution de risque de CSC avec un rapport de cotes et intervalle de confiance à 95% = 0,714 (0,227-2,251), mais cette association n’était pas significative. De plus, une hypométhylation non significative dans les régions 3’UTR et intergéniques a été observée chez les cas par rapport aux témoins. Nous avons noté aussi une hyperméthylation des gènes ELOVL6, DACT2, LHX2, GABRA5 et OSBP2 qui peut être associée au risque de développer un CSC. CONCLUSION : L'hypométhylation à l'échelle de l'épigénome de l'ADN à partir des tissus mammaires normaux adjacents à la tumeur peut être prédictive du risque de CSC. De plus, l’hyperméthylation de certains gènes spécifiques dans les tissus mammaires normaux peut possiblement être utile en tant que biomarqueur clinique du CSC si nos résultats étaient validés dans une cohorte plus grande / INTRODUCTION: Women with breast cancer (BC) have an increased risk of developing a contralateral breast cancer (CBC). This risk is 3 to 5 times higher than the risk of developing primary breast cancer by women in the general population. The methylation of DNA is known to be involved in the development of cancer, and changes in methylation profile in breast tumor cells have already been observed. OBJECTIVE: Our aims are to identify changes in global DNA methylation as well as the differentially methylated sites that are associated with an increased risk of developing CBC. METHODS: This is a case-control study (1:1) nested in a cohort of 1242 women. Cases (n = 20) were diagnosed with CBC during follow-up but not Controls (n = 20). Cases were matched to controls for CSC risk factors such as year of surgery, age, family history of BC, and the treatment. The DNA was extracted from normal breast tissue (to minimize field effect) more than 1 cm from the paraffin-embedded tumor and the methylation was measured by Illumina Infinium 450K. RESULTS: Global DNA hypomethylation was associated with a decreased risk of CBC with an odd ratios and a confidence interval at 95% = 0.714 (0.227-2.251), but this association was not significant. In addition, non-significant hypomethylation in 3'UTR and intergenic regions was observed in cases compared with controls. We have also found hypermethylation of the ELOVL6, DACT2, LHX2, GABRA5 and OSBP2 genes that may be associated with the risk of developing CBC. CONCLUSION: Global DNA hypomethylation from adjacent normal tissues may be predictive of the risk of CBC. In addition, hypermethylation of specific genes such as CCDC108, ELOVL6, DACT2, LHX2, GABRA5 and OSBP2 in normal breast tissues may therefore be useful as a clinical biomarker of CBC if our results were validated in a larger cohort.

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic- that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3- EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Chez les mammifères, le passage d’une génération à une autre nécessite la reprogrammation du génome. Cette reprogrammation nécessite la déméthylation de l’ADN parternel et maternel ainsi que celle des lysines des histones suite à la fécondation. Des familles d’enzymes ont récemment été associées à ces processus : les déaminases, notamment Aicda (activation-induced cytosine deaminase), et les Tet (Ten-eleven translocation) désoxygénase, Tet1, Tet2 et Tet3. Plusieurs déméthylases des lysines des histones (KDM) ont été identifiées au cours des dernières années mais très peu d’informations sont disponibles à leur sujet, particulièrement en ce qui a trait à l’embryon bovin. Notre étude s’est attardée à dresser un profil d’expression spatiotemporel de ces familles d’enzymes lors des différents stades embryonnaires précoces chez la vache. Nous suggérons que Tet3 participe activement à la déméthylation de l’ADN, possiblement assisté par Tet2, mais sans Tet1 ni Aicda. Nous montrons également que KDM3A, KDM4A, KDM4C et KDM5B sont présents à des stades et à des endroits précis de l’embryon suggérant ainsi un rôle dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces informations ouvrent la voie à de nouvelles recherches afin de comprendre les modifications de l’épigénome et de réduire les anomalies épigénétiques rencontrées chez les animaux issus de certains protocoles de reproduction assistée. / In mammals, the transition from one generation to the next requires genomic reprogramming. Such epigenetic change is mediated by paternal and maternal DNA demethylation as well as histone lysines demethylation after fertilization, which is a poorly understood process. Some family of enzymes have recently been associated to those process: the deaminases, like Aicda (activation-induced cytosine deaminase), and Tet (Ten-eleven translocation) dioxygenases, Tet1, Tet2 and Tet3. Many lysine specific histone demethylases (KDM) have been identified in the past few years but little is known about their roles in mammalian embryo. The objective of this study was to develop of a spatiotemporal expression profile of those proteins at different preimplantation stage of bovine embryo. We suggest an active participation of Tet3 in DNA methylation, possibly supported by Tet2 but without Tet1 or Aicda. We also demonstrate the presence and specific localization of KDM3A, KDM4A, KDM4C and KDM5B which may suggest a role during the different embryonic stages. This information opens up the possibilities for further research in order to reduce epigenetic abnormalities associated to assisted reproduction technologies.

Les bases moléculaires de l’initiation et de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) sont pauvrement comprises. Un élément pathogénique clé dans le cancer est l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, fréquemment due à l’hyperméthylation de leur région promotrice. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche épigénomique pour trouver des gènes hyperméthylés dans le COE. Nous avons employé un agent déméthylant, 5-aza-dC, pour réactiver les gènes hyperméthylés dans quatre lignées cellulaires du COE (SKOV3, OVCAR3, TOV112 et TOV21). Nous avons trouvé plusieurs cibles potentielles d’hyperméthylation qui pourraient jouer un rôle fonctionnel dans la suppression tumorale, l’apoptose ou la réparation de l’ADN. Nous avons évalué leur statut de méthylation par MSP (methylation-specific PCR) et BSP (bisulfite-sequencing PCR) avec des échantillons normaux et tumoraux et deux lignées cellulaires du COE. Parmi ces cibles, le gène DOK1 a démontré une évidence de méthylation de la région promotrice des échantillons tumoraux comparativement à celle de ceux qui sont normaux. Des clones surexprimant et d’autres sous-exprimant DOK1 ont été construits et validés. Son rôle potentiel dans la prolifération cellulaire, dans la sensibilité au taxol et au cisplatin, et dans le cycle cellulaire a été évalué par des études fonctionnelles et une légère implication a été détectée dans ces fonctions. Les changements d’expressions globales reliés à l’expression de ce gène ont également été analysés par la technologie de micropuces de l’ADN. Nos données montrent que DOK1 est touché par une hyperméthylation de sa région promotrice potentielle dans les tumeurs du COE. Par contre, cette hyperméthylation ne semble pas influencer son niveau d'expression. Au contraire, son expression augmente dans le cancer ovarien. Cette augmentation serait reliée à une diminution des risques de progression du COE. Cette observation confirme le rôle potentiel de suppresseur de tumeur de DOK1 dans le COE. / The molecular basis of the epithelial ovarian cancer (EOC) initiation and progression are still poorly understood. A key pathogenic element in cancer is the inactivation of tumours suppressor genes, frequently due to the hypermethylation of their promoter sequence. In this context, we used an epigenomic approach to identify hypermethylated genes in the EOC. We used the demethylating agent, 5-aza-dC, to reactivate hypermethylated genes in four cells lines of EOC (SKOV3, OVCAR3, TOV112 and TOV21). We identified several targets genes potentially hypermethylated that could play a functional role in ovarian tumorigenesis suppression, apoptosis or DNA repair. We evaluated their methylation status by MSP (methylation-specific PCR) and BSP (bisulfite-sequencing PCR) within normal and tumoral ovarian samples and in two EOC cells lines. Among these targets, the DOK1 gene showed an evidence of methylation of the promoter region in the tumour samples compared to the normal ones. Clones over-expressing and others under-expressing DOK1 were built and validated. The potential role of this gene in cellular proliferation, sensitivity to taxol and cisplatin, and in the cell cycle was evaluated by functional studies and a little implication of the DOK1 gene was detected in these functions. The global expression changes connected to the expression of the DOK1 gene were also analyzed by the microarray genomics technology. Our data show that DOK1 is affected by hypermethylation of its potential promoter region in EOC tumors. This hypermethylation do seems not to influence its expression levels. On the contrary, its expression level increases in ovarian cancer. This increase would be connected to a reduction in the risks of progression of the COE. Moreover, this observation confirms the potential role of DOK1 as tumor suppressor in EOC.

La méthylation de l’ADN est l’un des facteurs épigénétiques les plus étudiés dans le cadre du dépistage de cancer. Détecter la méthylation de certains promoteurs de gènes permettrait d’identifier un cancer en particulier et d’améliorer, ainsi, le diagnostic lors de l’apparition de cellules cancéreuses. Plusieurs techniques ont été développées dans cette voie mais très peu sont basées sur une détection via des polymères conjugués. La majorité de ces techniques reposent sur une étape de PCR (Polymerase Chain Reaction) qui amplifie le nombre de copies d’ADN. L’utilisation de polymères conjuguée, notamment du poly(3-alkoxy-4-méthylthiophène) permettrait un affranchissement de cet étape due aux propriétés optiques associées aux changements conformationnels de ce dernier. Ce polymère a déjà fait ses preuves autant en détection d’éléments pathogènes (détection de séquences précises) qu’en études conformationnelles (détection de G-quadruplex). Ce mémoire traite de deux approches distinctes pour la détection d’ADN méthylé. La première approche se base sur l’impact de la méthylation d’ADN sur le polymère lui-même et l’étude de ces impacts par diverses techniques de caractérisation. La deuxième approche se penche sur la détection de séquence d’ADN modifiée artificiellement par un traitement au bisulfite de sodium. Ainsi, deux méthodes ont été abordées pour obtenir une détection d’ADN méthylé efficace et reproductible à des fins de diagnostics de cancer.

L'industrie bovine est un secteur de grande importance au Canada. En effet, à elle seule l'industrie laitière canadienne représentait un chiffre d'affaires de 15.7 milliards de dollars pour l'année 2013 (commission canadienne du lait). L'industrie laitière canadienne est reconnue pour la qualité génétique supérieure de son cheptel bovin, de même que pour ses programmes génétiques laitiers (c'est à dire les programmes de contrôle laitier et les programmes d'enregistrement du bétail laitier et de la classification pour le type). Le Canada détient 41 % du marché mondial d'exportation (2008) de bovins reproducteurs de race pure et d'embryons. La race holstein est la race laitière la plus importante (92 % du cheptel laitier). Les semences de bovins laitiers canadiens ont été exportées vers 84 pays différents principalement vers les États-Unis, les Pays-Bas, le Japon et l'Espagne. Le Canada est à l'avant-garde des nouvelles technologies en matière de génétique laitière. Grâce au génotypage, les généticiens peuvent déterminer le profil d'ADN d'un animal et produisent actuellement des évaluations génomiques pour plus de 60 caractères différents. Depuis août 2009, le Réseau laitier canadien (RLC) publie des évaluations génomiques qui combinent la valeur génomique directe (VGD) d'un animal avec son évaluation génétique traditionnelle. Pour rester compétitif, le Canada doit rester à l'affut des nouvelles technologies qui permettent de discerner les meilleurs animaux reproducteurs. La demande grandissante pour des animaux de qualité pousse l'industrie à utiliser les animaux de plus en plus jeunes. Il est reconnu que la qualité des gamètes des mâles âgés de moins de 16 mois est inférieure à celle des animaux matures. À ce jour il n'est pas clair si l'utilisation de gamètes immatures peut avoir un impact sur le phénotype des animaux issus de ces gamètes. La génétique permet de donner une information clé qu'an au potentiel reproducteur d'un animal et le génome d'un animal ne varie pas avec l'âge, toutefois il est possible que l'information épigénétique transmise par un gamète imparfait ait un impact négatif sur la descendance. L'étude des patrons épigénétique ainsi que le développement de méthode fiable pour récolter ces informations s'impose. Le réseau embryoGENE a développé une plateforme d'analyse épigénétique permettant d'établir un profil de méthylation de l'ADN à la grandeur du génome. Une lame de micro array comportant plus de 420 000 sondes combinées à une plateforme de bio-informatique permet une résolution sans précédent de l'épigénome bovin. Afin de déterminer si le méthylome des gamètes d'un animal évolue avec le temps. Quatre taureaux ont été récoltés alors qu'ils étaient âgés de 10, 12 et 16 mois. Les échantillons récoltés à 10 et 12 mois ont été comparés à l'échantillon mature (16 mois) afin de déterminer si les profils de méthylation ont varié dans le temps. Un total de 2604 sites différentiellement méthylés ont été détectés entre les échantillons de 10 mois à ceux de 16 mois. Cela démontre que les spermatozoïdes provenant de taureaux âgés de 10 mois n'ont pas un profil mature. Aucune différence significative au niveau des méthylations n'a pu être détectée lorsque l'on compare les échantillons de 12 mois à ceux de 16 mois. L'importance de ces différences pour l'embryon est méconnue. Il est toutefois connu que des altérations dans les marques épigénétiques portées par l'embryon soient à la source de plusieurs pathologies ou défauts embryonnaires. Il est raisonnable de soupçonner que l'utilisation de sperme immature puisse représenter un risque potentiel pour l'embryon.

La base moléculaire de la progression du cancer ovarien epithelial (COE) est encore peu comprise. Récemment, l'importance de la perturbation épigénétique de la régulation de gènes par l'hypométhylation globale du génome a commencé à être plus appréciée. L'hypométhylation est très peu étudiée dans le COE bien que l'on ait déjà montré qu'il existe une relation entre hypométhylation de l'ADN et la progression, l'invasion tumorale ainsi que la formation de métastases. Cette étude vise à identifier des gènes qui pourraient être activés par l'hypométhylation de leur région promotrice, ce qui contribuerait à la progression tumorale. Afin d'identifier de nouveaux gènes hypométhylés, quatre lignées cellulaires ovariennes (Skov3, Tovll2, Tov21 et Ovcar3) ont été traitées avec un donneur de groupement méthyl, du S-Adenosylmethionine (AdoMet), afin d'inhiber la déméthylation de l'ADN. Plusieurs gènes sous-exprimés après traitement ont été identifiés par l'analyse de l'expression génique globale en utilisant la technique de micropuces à ADN. Cette analyse a permis d'identifier le gène TMPRSS3 comme une cible potentielle d'hypométhylation dans le COE. Le gène TMPRSS3-D est connu pour son implication dans la migration et invasion dans le COE. Le statut de méthylation de la région promotrice du gène TMPRSS3 a été vérifié par analyse Methylation-Spécific PCR (MSP) et par Bisulfite Specific PCR (BSP). L'évaluation de son rôle potentiel dans l'étiologie du COE a été faite par la technique d'interférence à l'ARN. L'analyse d'expression génique globale en utilisant le clone où l'expression de TMPRSS3-D a été supprimée et son contrôle correspondant a permis de mieux comprendre l'effet moléculaire de TMPRSS3-D. Pris ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire confirment le rôle potentiel du gène TMPRSS3-D dans l'invasion et métastase du COE et plus important, nos données indiquent que la surexpression de TMPRSS3-D dans le COE est due aux mécanismes épigénétiques reliés à l'hypométhylation de sa région promotrice.