Dotés d’une position stratégique à la surface des cellules et au sein des matrices extracellulaires, les PGs à héparane-sulfates (HS) jouent un rôle essentiel dans de multiples processus physiopathologiques en régulant l’activité de nombreux médiateurs solubles. Les voies de biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAGs) nécessitent l’action coordonnée de glycosyltransférases (GTs) et sulfotransférases (STs). Bien que celles-ci soient en partie caractérisées, leurs mécanismes de régulation restent mal connus. Dans la première partie de notre travail, nous avons réalisé une étude structure-fonction de la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) qui catalyse une étape clé de l’initiation des chaînes de GAG. Nous avons identifié deux motifs D163VD165 et 221FWGWGREDDE230 strictement conservés au sein des ß4GalTs. Une approche in vitro combinée à la mesure du taux de biosynthèse des PGs par incorporation de 35S ex vivo, a permis d’évaluer l’impact des mutations conservative et non conservative sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la ß4GalT7. Nous avons ainsi pu cerner les résidus clés impliqués dans la reconnaissance des substrats donneur (UDP-galactose)/Mn2+, accepteur et la catalyse enzymatique. Dans un second temps, afin d’explorer les mécanismes de régulation des voies de biosynthèse, nous avons examiné les régions situées en 5’ des gènes codant les GTs et STs et mis en évidence une méthylation aberrante touchant en particulier la famille des 3-OSTs, dans les cellules de chondrosarcome humain H-EMC-SS (HEMC). Cette hyperméthylation provoque une diminution d’expression de ces transcrits conduisant à une altération des chaînes de HS, restaurée par le traitement des cellules par un agent déméthylant, la 5-aza-2’déoxycytidine. Ce traitement ainsi que la surexpression des 3-OSTs par transfert de gène produit un ralentissement de la prolifération et motilité cellulaires et une augmentation de capacité d’adhésion des cellules. Ces résultats soulignent l’importance de l’altération des chaînes de HS cellulaires dans le caractère invasif des HEMC et suggèrent que la 3-O-sulfatation est un facteur contribuant à ce processus. Nous avons montré pour la première fois que les gènes codant les ST à HS sont régulés par un mécanisme épigénétique dans les cellules HEMC. Ces résultats ouvrent la voie à une meilleure compréhension des pathologies articulaires d’origine cancéreuse et permettent d’envisager des stratégies thérapeutiques ciblant la méthylation de l’ADN. / Located at the cell-tissue-organ interface, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) facilitate ligand-receptor interactions crucial to many physiopathological processes. The synthesis of glycosaminoglycans (GAGs) requires the coordinated action of an array of glycosyltransferases (GTs) and sulfotransferases (STs). Although the biosynthetic scheme of HSPGs has been outlined, little is known about the regulation of this complex process. In the first part of our work, we performed structure-function studies of the human ß1,4-galactosyltransferase 7 (ß4GalT7) which catalyses a key step of the initiation of GAG synthesis and identified two conserved domains D163VD165 and 221FWGWGREDDE230 in the ß4GalT family. In vitro studies combined to ex vivo analysis of PG synthesis by 35S incorporation allowed us to determine the impact of site-directed mutations on the catalytic and functional properties of ß4GalT7. We identified key residues for donor UDP-galactose/Mn2+ and acceptor substrate binding, and catalysis. Secondarily, to investigate more in depth the mechanisms involved in the regulation of PG biosynthetic pathway, we inspected the 5’ region of the genes coding for GT and ST enzymes and identified the presence of typical CpG islands with the most striking hypermethylation pattern for the 3-OST gene subfamily in the chondrosarcoma cell line H-EMC-SS (HEMC). Aberrant methylation was associated with downregulation of these genes and altered HS-GAG chains, as demonstrated both at biochemical and cellular levels. Treatment of cells with an inhibitor of DNA methyltransferases (5-aza-2’deoxycytidine) or reintroduction of 3-OST cDNA expression into HEMC cells resulted in a decrease in the proliferative and migration capacities of HEMC cells, and augmented adhesion ability of the cells. These findings underline the significance of HS alterations in the invasive phenotype of HEMC and identify 3-O-sulfation as a contributing factor to this process. We show for the first time that a specific set of HS-O-sulfotransferases is regulated via an epigenetic mechanism in HEMC cells, may be of particular relevance in understanding the process of cartilage tumor pathogenesis, towards the development of therapies targeting DNA methylation.

La régulation transcriptionnelle des gènes constitue une étape clef de la biologie cellulaire. Parmi les mécanismes impliqués dans la répression génique, les modifications épigénétiques jouent un rôle fondamental. Deux machineries épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines du groupe Polycomb, établissent des profils moléculaires qui permettent de distinguer les formes active et inactive de la chromatine. L’établissement et la maintenance de la répression épigénétique des gènes interviennent dans de nombreux processus liés au développement tant biologiques (inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles, empreinte génomique ou encore l’expression de gènes tissus-spécifiques) que pathologiques (cancers). Au cours de notre thèse de doctorat, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN est ciblée en des régions génomiques précises et participe à la répression de l’expression des gènes. La méthylation de l’ADN est catalysée par des enzymes, appelées méthyltransférases de l’ADN (DNMTs), qui transfèrent des résidus méthyls sur les cytosines. Cette modification chimique covalente constitue un niveau de contrôle transcriptionnel important : il existe une corrélation entre méthylation de l’ADN et répression de l’expression génique au niveau de sites génomiques spécifiques. En outre, il semble de plus en plus clair qu’une méthylation aberrante de l’ADN participe au processus de cancérogenèse. A l’heure actuelle, les mécanismes moléculaires par lesquels la méthylation contribue au développement, à la différenciation et à la répression génique restent peu connus. Les données de la littérature suggèrent l’existence d’un lien étroit entre la méthylation de l’ADN et la structure de la chromatine. Celle-ci est notamment régulée par des modifications post-traductionnelles des histones. Il apparaît de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN et les modifications des histones prennent part à une «boucle de répression» assurant le maintien et la propagation d’états épigénétiques répressifs. L’étude des mécanismes de la répression médiée par les DNMTs s’avère donc étroitement liée à celle de la structure de la chromatine. Dans ce contexte, notre travail de thèse est basé sur l’hypothèse selon laquelle les deux principaux systèmes épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines Polycomb, agiraient de concert. Les protéines Polycomb participent au système de mémoire cellulaire, régulent l’expression et la différenciation, agissent sous forme de complexes multimériques associés à la chromatine et interviennent dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Au cours de notre travail, nous nous sommes particulièrement intéressé à la protéine Polycomb EZH2 (Enhancer of Zeste) parce qu’elle possède une activité méthyltransférase d’histone sur les 27 de l’histone H3, impliquée dans la répression transcriptionnelle. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un lien mécanistique entre les deux machineries épigénétiques principales, méthylation de l’ADN et protéines du groupe Polycomb. Nous avons montré qu’EZH2 interagit in vivo avec les DNMTs et purifie une activité méthyltransférase de l’ADN in vitro. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que les DNMTs fixent les régions promotrices de gènes cibles de EZH2 et que cette liaison est dépendante de la présence d’EZH2. Par ailleurs, l’analyse des promoteurs cibles d’EZH2 par séquençage au bisulfite suggère qu’EZH2 semble également requise pour la méthylation de l’ADN de ces séquences. Nos résultats permettent l’ébauche d’un modèle où EZH2 agit comme une plateforme de recrutement pour les DNMTs (Viré et al., Nature 2006). Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons investigué le rôle de MeCP2 dans ce modèle. MeCP2 est une protéine à domaine MBD (methyl-binding domain) qui se fixe sélectivement aux cytosines méthylées. Le recrutement de MeCP2 représente un mécanisme majeur par lequel la méthylation de l’ADN réprime la transcription. Nos données montrent que MeCP2 interagit avec EZH2 in vitro et in vivo et que ces protéines fixent des régions promotrices communes. De plus, le niveau de méthylation des cytosines semble prérequis à la présence d’EZH2. Ce travail suggère que MeCP2 puisse recruter EZH2 à la chromatine et renforcer un état réprimé de la chromatine en agissant comme un pont entre deux modifications épigénétiques essentielles, la méthylation de l’ADN et les proteins Polycomb (Viré et al., soumis). En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre un meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’épigénétique et plus particulièrement de cerner comment la méthylation de l’ADN est intimement connectée au remodelage de la chromatine, participe à la répression transcriptionnelle, est spécifiquement ciblée au sein du génome et contribue au développement et à la cancérogenèse.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), caractérisée par une pression artérielle pulmonaire moyenne (mPAP) supérieure à 20mmHg au repos, est une pathologie progressive et létale. L'augmentation progressive de la pression artérielle pulmonaire est la résultante d'une vasoconstriction soutenue associée à un profond remodelage des artères pulmonaires distales. Le remodelage vasculaire est dû principalement à une prolifération anormalement élevée et une résistance importante à l'apoptose des cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAPs). Le remodelage vasculaire et la vasoconstriction engendre une obstruction progressive des artères pulmonaires favorisant une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires. Cette augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires se répercute sur le ventricule droit (VD) forçant celui-ci à s'hypertrophier pour compenser et maintenir ses fonctions. Néanmoins, à mesure que la maladie progresse, l'obstruction artérielle s'accentue, rendant la compensation cardiaque droite plus difficile ce qui mènera ultimement au décès des patients par défaillance cardiaque droite. À ce jour les outils thérapeutiques utilisés ciblent uniquement le tonus vasculaire en favorisant la vasodilatation. Cependant, cette stratégie thérapeutique n'améliore que de façon médiocre le taux de survie des patients ce qui rend urgent le besoin de développer de nouvelles stratégies ciblant l'obstruction artérielle pulmonaire. Le remodelage, étant la conséquence d'une prolifération et d'une survie cellulaire importante, met en exergue une certaine similitude avec le cancer. En effet, certaines voies cellulaires dérégulées dans le cancer, comme ici la prolifération ou la survie cellulaire, se retrouvent également dérégulées en hypertension artérielle pulmonaire. La littérature scientifique démontre de plus en plus l'implication de modifications épigénétiques dans le développement de cancer, notamment par la transcription de gènes pro-prolifératifs et anti-apoptotiques. Les dernières années de recherche ont démontré que des facteurs épigénétiques pouvaient être responsables du développement et de la progression de l'HTAP. En ce sens, nous nous sommes intéressés au facteur épigénétique EZH2 (Enhancer of Zeste Homologue 2) fortement impliqué dans la prolifération et la survie cellulaire dans de nombreux cancers, faisant de lui une cible préférentielle des thérapies anticancéreuses. Étant donné le phénotype pro-prolifératif et résistant des CMLAPs-HTAP, EZH2 constitue une cible à étudier dans le remodelage vasculaire. De plus, la littérature rapporte un effet cardioprotecteur d'EZH2 face à l'hypertrophie et la fibrose dans le tissu cardiaque. Bien que l'HTAP soit une pathologie vasculaire avant tout, les patients décèdent d'une défaillance cardiaque droite. Le ventricule droit n'étant plus apte à s'adapter, accumule de la fibrose rendant la contraction laborieuse ce qui mène à la défaillance cardiaque droite. À la vue de son rôle de protecteur cardiaque décrit dans la littérature, nous avons également étudié sa potentielle implication dans l'hypertrophie et la fibrose cardiaque HTAP. Dans un premier volet de l'étude, nous avons démontré qu'EZH2 est surexprimé dans les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires de patients HTAP et de modèles expérimentaux. In vitro, l'inhibition d'EZH2 diminue la prolifération et la résistance à l'apoptose des cellules musculaires lisses HTAP comparativement aux cellules contrôles. Par une approche multiomique, nous avons démontré que l'inhibition d'EZH2 diminue l'expression de nombreux facteurs impliqués dans la progression du cycle cellulaire, y compris les cibles E2F, ainsi que des protéines impliquées dans la fonction mitochondriale. De plus, nous avons également démontré que l'inhibition d'EZH2 altère la bioénergétique des CMLAPs-HTAP. Dans le second volet de notre étude, nous avons démontré qu'EZH2 se retrouve surexprimé dans les ventricules droits compensés des patients et des modèles expérimentaux. Nous avons démontré qu'une inhibition de l'expression d'EZH2, in vitro, favorise l'hypertrophie cellulaire. D'un point de vue mécanisme cellulaire, EZH2 est régulé par l'ARN long non codant H19, plus précisément son micro-ARN : miR-675. Nous avons démontré que cette régulation passe par l'intermédiaire du facteur de transcription E2F1 qui régulé par miR-675 va réguler à son tour l'expression d'EZH2. L'inhibition d'H19 in vivo induit la surexpression d'E2F1 et d'EZH2 et démontre un effet thérapeutique cardioprotecteur bénéfique dans deux modèles expérimentaux de défaillance cardiaque droite. Pour conclure, les deux volets de notre étude nous permettent de mettre en évidence une implication d'EZH2 dans le phénotype pro-prolifératif et anti-apoptotique des CMLAPs-HTAP et également un rôle protecteur de la fonction ventriculaire droite. Ainsi, cela ouvre de nouvelles possibilités de découvertes thérapeutiques. / Pulmonary arterial hypertension (PAH), characterized by a mean pulmonary arterial pressure (mPAP) greater than 20mmHg at rest, is a progressive and fatal condition. The progressive increase in pulmonary artery pressure is the result of sustained vasoconstriction associated with a deep remodeling of the distal pulmonary arteries. Vascular remodeling is mainly due to abnormal proliferation and increased survival of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Vascular remodeling and vasoconstriction cause progressive obstruction of the pulmonary arteries, promoting an increase in pulmonary vascular resistance. This progressive increase in pulmonary vascular resistance affects the right ventricle (RV) forcing it to compensate by hypertrophy to maintain its functions. However, as the disease progresses, the arterial obstruction worsens, making right cardiac compensation more difficult, which will ultimately lead to the death of patients from right heart failure. To date, the therapeutic tools used only target vascular tone by promoting vasodilation. However, this therapeutic strategy poorly improves patient survival rates, which makes the need to develop new strategies targeting pulmonary artery obstruction urgent. The remodeling being the consequence of a high proliferation and an important cell survival highlights some similarities with cancer. Indeed, some deregulated cell pathways in cancer, such as cell proliferation or survival, are also deregulated in pulmonary arterial hypertension. The scientific literature increasingly demonstrates the involvement of epigenetic modifications in the development of cancer, through the transcription of pro-proliferative and anti-apoptotic genes. The last years of research have shown that epigenetic factors could be responsible for the development and progression of the PAH. In this sense, we were interested in the epigenetic factor EZH2 (Enhancer of Zeste Homologue 2) strongly involved in cell proliferation and survival in many cancers, making it a preferential target for anticancer therapies. Given the hyper-proliferative and resistant phenotype of PAH-PASMCs, EZH2 constitutes a target to be studied in vascular remodeling. In addition, the literature reports a cardioprotective effect of EZH2 against hypertrophy and fibrosis in heart tissue. Although PAH is primarily a vascular disease, patients die of right heart failure. As the right ventricle is no longer able to adapt, fibrosis accumulates making ventricular contractility difficult which leads to right heart failure. In view of its role as a cardiac protector described in the literature, we investigated its potential involvement in cardiac hypertrophy and fibrosis in PAH. In a first part of our study, we demonstrated that EZH2 is overexpressed in PAH-PASMCs from patients and in experimental models. In vitro, EZH2 inhibition decreases the proliferation and resistance to apoptosis of PAH-PASMCs compared to control cells. A multi-omic approach has made it possible to highlight multiple targets of EZH2, like targets of the transcription factor E2F1, involved in the regulation of the cell cycle, as well as proteins involved in mitochondrial function. In addition, we have also shown that inhibition of EZH2 alters PAH-PASMCs bioenergetics. In a second part of our study, we demonstrated that EZH2 is overexpressed in compensated right ventricles in PAH patients and in experimental models. We have shown that inhibition of EZH2 expression in vitro promotes cell hypertrophy. From a cellular mechanism point of view, EZH2 is regulated by the long non-coding RNA H19, more precisely its microRNA: miR-675. We have demonstrated that this regulation is mediated by the transcription factor E2F1 which, regulated by miR-675, will in turn regulate the expression of EZH2. Inhibition of H19 in vivo induces E2F1 and EZH2 overexpression and demonstrates a beneficial cardioprotective therapeutic effect in two experimental models of right heart failure. In conclusion, the two parts of our study allow us to demonstrate an involvement of EZH2 in the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of PAH-PASMCs and a protective role of right ventricular function. Thus, these results open new possibilities for therapeutic discoveries.

La chromatine est une structure essentielle qui régit l'homéostasie cellulaire à travers diverses voies dépendantes de la molécule d'ADN telles que l'expression des gènes, la stabilité du génome, l'apoptose, etc. Ainsi, étudier ses mécanismes de régulation est un enjeu crucial pour comprendre le fonctionnement cellulaire. Un des facteurs clés de la modulation de la structure de la chromatine est le complexe acétyltransférase NuA4/TIP60. En effet, ce complexe multi-protéiques très conservé permet l'acétylation des histones, dont H4, et l'incorporation du variant H2A.Z. Il agit alors sur plusieurs mécanismes cellulaires tels que la réparation des cassures doubles brins d'ADN en favorisant la recombinaison homologue ou encore l'activation de la transcription. C'est pourquoi, il est primordial de comprendre en détails les fonctions de ce complexe. Mon projet de doctorat se découpe en deux parties selon les sous-unités du complexe NuA4/TIP60 étudiées. La première partie concerne la sous-unité MRG15, associée à de nombreux complexes, et donc impliquée dans plusieurs fonctions telles que la régulation de l'épissage ou encore la réparation de l'ADN. Combinant des méthodes d'édition du génome avec des purifications de complexes natif et de spectrométrie de masse, nous avons pu identifier un nouveau complexe, composé des sous-unités BRD8, MRGBP, MRG15/X ainsi qu'une nouvelle sous-unité, EP400NL, initialement décrite comme un pseudogène. Puis, par une technique de séquençage d'ARNs, nous montrons que ce complexe est important pour moduler l'expression de gènes spécifiques. De plus, nous avons étudié le mutant W78A/F105A de MRGBP qui perd l'interaction avec MRG15, et le mutant W172A/Y235A de MRG15 qui n'interagit plus avec les facteurs de réparations PALB2/BRCA2. De ce fait, ces mutants aideraient à la compréhension de la fonction de MRG15 lors de la réparation de l'ADN. La seconde partie de mon doctorat concerne la sous-unité MBTD1. En effet, nous nous sommes intéressés à la fusion entre MBTD1 et le facteur d'épissage ZMYND11. Elle est retrouvée dans des cas de leucémies myéloïdes aigües (LMA). Nous avons montré que les mécanismes oncogéniques de cette fusion sont dépendants de la délocalisation sur les corps des gènes du complexes NuA4/TIP60 induisant une augmentation d'acétylation de H4. Ceci génère alors un défaut transcriptionnel dont une surexpression de l'oncogène Myc et des dérégulations d'épissage alternatif de transcrits spécifiques. De plus, nous avons mis en évidence les résidus essentiels pour l'interaction entre MBTD1 et la sous-unité EPC1, associant alors MBTD1 avec le reste du complexe NuA4/TIP60. Ensemble, ces résultats permettraient le développement de nouveaux outils thérapeutiques pouvant cibler MBTD1 afin de traiter les cas de LMA spécifiques. L'ensemble de ces travaux offre une meilleure compréhension des fonctions du complexe NuA4/TIP60 liées à ses différentes sous-unités, à la fois au niveau transcriptionnel mais également au niveau de la réparation de l'ADN. De plus, ils établissent les mécanismes oncogéniques associées à ce complexe. Ainsi, de futures stratégies thérapeutiques pourraient être développées. / Chromatin is an essential structure that governs cell homeostasis through various DNA molecule-dependent pathways such as gene expression, genome stability, apoptosis, etc. Thus, studying its regulatory mechanisms is a crucial issue in understanding cell functioning. One of the key factors in the modulation of chromatin structure is the acetyltransferase complex NuA4/TIP60. Indeed, this highly conserved multi-protein complex allows the acetylation of histones, including H4, and the incorporation of the H2A.Z variant. It then acts on several cellular mechanisms such as the repair of DNA double strand breaks by promoting homologous recombination or even the activation of transcription. This is why it is essential to understand in detail the functions of this complex. My doctoral project is divided into two parts according to the subunits of the NuA4/TIP60 complex studied. The first part concerns the MRG15 subunit, associated with many complexes and therefore involved in several functions such as the regulation of splicing or DNA repair. Combining genome editing methods with native complex purifications and mass spectrometry analysis, we were able to identify a new complex, composed of the BRD8, MRGBP, MRG15/X subunits as well as a new subunit, EP400NL, initially described as a pseudogene. Then, by an RNA sequencing technique, we show that this complex is important for modulating the expression of specific genes. In addition, we studied the W78A/F105A mutant of MRGBP which loses interaction with MRG15 and the W172A/Y235A mutant of MRG15 which loses its interaction with repair factors PALB2/BRCA2. Thus, these mutants would help to understand the function of MRG15 during DNA repair. The second part of my doctorate concerns the MBTD1 subunit. Indeed, we were interested in the fusion between MBTD1 and the splicing factor ZMYND11 found in cases of acute myeloid leukemia (AML). We then showed that the oncogenic mechanisms of this fusion are dependent on the delocalization of the NuA4/TIP60 complex on the bodies of the genes, leading to an increase of H4 acetylation. This generates a transcriptional alteration including overexpression of the Myc oncogene and deregulation of alternative splicing of specific transcripts. In addition, we have characterized the residues required for the interaction between MBTD1 and the EPC1 subunit, essential for the association of MBTD1 with the rest of the NuA4/TIP60 complex. Together, these results would allow the development of new therapeutic tools that can target MBTD1 to treat specific AML cases. All of this work provides a better understanding of the functions of the NuA4/TIP60 complex linked to its various subunits both at the transcriptional level but also in DNA repair. In addition, they establish the oncogenic mechanisms associated with this complex. Thus, future therapeutic strategies could be developed.

Les plantes sont des organismes sessiles qui présentent plusieurs caractéristiques leur permettant de s'adapter rapidement aux variations de conditions environnementales. En particulier la lumière représente une source d’information essentielle utilisée tout au long du cycle de vie pour ajuster leur développement. Cette thèse avait pour objet l’étude de l’impact des mécanismes chromatiniens dans la régulation de l’expression des gènes pouvant influencer l’adaptabilité des plantes aux variations de signaux lumineux, à travers deux types de réponses caractérisées par des échelles de temps différentes chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. La première étude portait sur des processus chromatiniens dynamiques participant à la régulation de l’expression génique, et utilisait comme modèle le dé‐étiolement. La triméthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me3), une modification posttraductionnelle généralement associée à un état transcriptionnel actif a été plus particulièrement étudiée. Afin de mieux connaître cette voie, le gène SWD2‐Like b (S2Lb) a été caractérisé. Il s’agit d’un nouveau partenaire de complexes COMPASS‐like et un déterminant important du niveau global de H3K4me3. L’analyse de plantes dans lesquelles ce gène est inactivé a montré qu’un défaut d’accumulation de H3K4me3 corrélait avec une induction plus faible de gènes de réponse à la lumière au cours du dé‐étiolement. Ces résultats et les nouveaux outils obtenus constituent une base solide pour étudier l’influence de cette marque et des facteurs associés sur la modulation fine de l’expression génique en relation avec d’autres marques chromatiniennes. La seconde étude cherchait à déterminer l’impact des variations épigénétiques sur la capacité des plantes à induire un syndrome d’évitement de l’ombre, une réponse adaptative à des conditions de lumière défavorables produites par des compétiteurs. Un phénotypage à grande échelle dans deux conditions de lumière induisant des réponses opposées a été réalisé sur une population de lignées recombinantes inbred (epiRIL), dans laquelle les variations épigénétiques (méthylation de l’ADN) sont maximisées mais les variations de séquence nucléotidique sont minimes. Une plus grande variation phénotypique ainsi qu’une plus grande amplitude dans la capacité de réponse à l’ombre ont été observées dans la population epiRIL. De plus, une cartographie QTL a permis d’identifier une région au début du chromosome 3 spécifiquement associée à la réponse d’évitement de l’ombre. Bien qu’une caractérisation plus fine soit nécessaire, le locus impliqué pourrait correspondre à une première description de QTL « épigénétique » influençant la plasticité phénotypique des plantes en réponse à une variation des conditions de l’environnement. / Plants are sessile organisms that successfully face variations of the environment by taking advantage of their ability to adapt their physiology and morphology. In particular, light perception constitutes an essential source of information used throughout their life cycle to fine‐tune development. The work presented was aimed at studying the role of chromatin‐associated mechanisms on adaptive responses to light cues at two different timescales in the model plant species Arabidopsis thaliana. In a first part, the role of chromatin dynamics in the regulation of gene expression was assessed during de‐etiolation, a developmental transition of seedlings that is triggered upon the first perception of light. It focused mainly on the trimethylation of histone H3 at lysine 4 (H3K4me3), a post‐translational modification associated with transcriptionally active states. To gain new insights into this pathway, the SWD2‐Like b (S2Lb) gene was characterized and shown to represent a new partner of plant COMPASS‐like complexes and a major determinant of H3K4me3 in A.thaliana. Loss‐of‐function plant lines for the S2Lb gene revealed that a default in H3K4me3 enrichment correlates with impaired inducibility of several light‐responsive genes during de‐etiolation. The findings described here set the bases to investigating how this mark and the associated factors influence the modulation of gene expression in relation with other chromatin marks. The second part of this thesis was aimed at assessing the impact of epigenetic variation on the capacity of plants to undergo the shade‐avoidance response (SAR), an adaptive developmental response to unfavorable light conditions produced by competitors. A population of epigenetic Recombinant Inbred Lines (epiRILs), in which epigenetic variation (DNA cytosine methylation) is maximized and nucleotidic sequence variation is minimized, was used for a large‐scale phenotyping under two light conditions triggering opposite responses. The epiRIL population exhibited larger amplitude of phenotypic variation than wild‐type parents in each condition as well as a wider range of response to shade. A region at the beginning of chromosome 3 was identified by QTL mapping to specifically associate to the SAR. Though it remains to be characterized, the locus involved may represent a first “epigenetic QTL” influencing phenotypic plasticity in response to environmental changes.

P53 empêche la réplication d'ADN cellulaire pathologique ainsi que viral en activant la transcription d'effecteurs en aval. L'augmentation d'expression de p53 et sa phosphorylation en réponse à des oncogènes ou à des dommages à l'ADN sont considérées comme déterminant l'activation transcriptionnelle de p53. Les mutations tumorales et les protéines virales convergent fonctionnellement en inactivant p53. Par exemple la protéine cellulaire MDM2 et la protéine adénovirale E1 B-55K ciblent toutes les deux p53 pour sa dégradation. Ceci représente la base du raisonnement de la création des molécules antagonistes de MDM2 et de l'adénovirus oncolytique où E1B-55K a été supprimé, ONYX-015 (Oncorine), comme thérapies anticancéreuses ciblant p53. Pourtant ici, nous montrons que E1B-55K est dispensable pour l'inactivation de p53 et nous révélons un mécanisme épigénétique nouveau et dominant qui inactive l'activité de p53, quel que soit le niveau et la phosphorylation de p53. En utilisant une approche génétique, nous dévoilons qu'E4-ORF3, une autre protéine adénovirale, est le point de nucléation de domaines d'hétérochromatine, menant à l'inactivation des promoteurs cibles de p53, en empêchant sa liaison et donc son activation transcriptionnelle. De plus, nous montrons qu'E4-ORF3 forme un échafaudage nucléaire qui dirige deux métyltransferases, SUV39H1 et SUV39H2, vers ces nouveaux domaines répressifs. Notre étude change la définition fondamentale du mécanisme d'inactivation de p53 dans les cellules infectées par un adénovirus, apportant une nouvelle lumière sur un mécanisme critique qui va maintenant permettre le développement de thérapies adénovirale vraiment sélectives du statut p53 des cellules. / P53 guards against pathological cellular and viral DNA replication by activating the transcription of downstream effectors. The induction of p53 levels and its phosphorylation in response to oncogenes and DNA damage is thought to determine p53 transcriptional activation. Tumor mutations and viral proteins functionally converge in inactivating p53. For example the cellular protein MDM2 and the adenoviral protein E1B-55k both target p53 for its degradation. This is the premise for MDM2 antagonists and the E1B-55k deleted oncolytic adenovirus, ONYX-015 (Oncorine) as p53-targeted cancer therapies. However, here we show that E1B-55k is dispensable for p53 inactivation and reveal a novel and dominant epigenetic mechanism that silences p53 activity, irrespective of p53 level and phosphorylation. Using a genetic approach, we reveal that E4-ORF3, another adenoviral protein, nucleates heterochromatin domain, leading to the silencing of p53 target promot er by preventing its binding and subsequent transcriptional activation. Moreover we show that E4-ORF3 forms a novel nuclear scaffold that directs two methyltransferases, SUV39H1 and SUV39H2, to this newly formed repressive domains. Our study changes the fundamental definition of how p53 is inactivated in adenovirus infected cells, and provides a critical mechanistic insight that could now enable the rational development of true p53 tumor selective adenoviral therapies.

Résumé Parmi les rétrovirus tumorigènes, les rétrovirus appelés « complexes » dont font partie HTLV-1 chez l’homme et BLV chez le mouton, sont responsables de leucémies lymphoïdes chroniques caractérisées par des pathogenèses similaires. Bien que la contribution essentielle de la protéine Tax dans la leucémogenèse soit bien établie pour ces deux virus, il existe toujours une contreverse quant à l’expression des protéines virales -dont l’oncoprotéine Tax- dans les cellules transformées. Dans le cas de HTLV-1 et BLV, le virus est latent. Une hypothèse attrayante suggère que l’extinction complète du provirus accompagnée du blocage transcriptionnel de l’expression de Tax dans la cellule leucémique serait un élément indispensable au développement de la tumeur en réduisant son immunogénicité. Le silencing viral permettrait à la cellule infectée d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte. Dans la première partie de notre travail, nous avons pu montrer, grâce à l’observation et le suivi de deux moutons infectés par BLV, que l’extinction virale était associée au développement tumoral. Alors que la phase asymptomatique est caractérisée par l’existence de différents clones cellulaires infectés et exprimant le virus, la phase tumorale est caractérisée par l’existence d’un seul clone cellulaire dans lequel l’expression virale est éteinte. Dans le cas du mouton S2531, nous avons mis en évidence que le silencing observé dans la phase tumorale est d’origine génétique. L’extinction de l’expression virale et la domination du clone muté au niveau de la protéine Tax (K303) sont associées à l’émergence de la leucémie et constituent une caractéristique de la phase tumorale. Le deuxième mouton étudié, S267, est caractérisé par la présence de cellules infectées non transformées et transformées au même moment. Par ailleurs, le mouton S267 est caractérisé par une absence de mutations ou délétions au niveau du provirus intégré dans les cellules tumorales. Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons pu, grâce à l’établissement de la lignée L267 dans laquelle le silencing viral n’est pas lié à une défection dans la structure génomique du provirus, élucider les mécanismes épigénétiques responsables du silencing. Nous montrons que ce provirus silencieux peut être réactivé in vitro 1) lorsque la protéine Tax sauvage est introduite par transfert rétroviral, 2) après traitement des cellules par la trichostatine A (TSA), un inhibiteur des histones désacétylases, 3) par traitement des cellules à la 5’azacytidine, un agent inhibiteur de DNA méthyltransférases. La réactivation du provirus silencieux lui confère la capacité d’infecter des moutons sains, suggérant que le provirus est complet et exempt de mutation qui pourrait altérer son fonctionnement. Les complexes de désacétylation des histones msin3A et HDAC-1 jouent un rôle important dans l’établissement du silencing viral via la condensation de la chromatine, et ce changement de la structure chromatinienne est lié a un ensemble de modifications ciblant les acides aminés des queues N-terminales des histones H3 et H4 établissant ainsi un code histone pour l’extinction et l’expression du provirus. Enfin, l’étude comparative des profils d’expression génique de cellules B tumorales dans lesquelles le provirus BLV est soit silencieux, soit ré-activé suite à l’expression exogène de Tax a montré que les mécanismes épigénétiques de silencing se superposent même dans le modèle génétique de silencing. De plus le rétablissement de l’expression virale par Tax est associé à une élimination des complexes de désacétylation des histones au niveau du promoteur viral. Nos résultats ouvrent le champ vers l’utilisation de modèle de leucémie ovine dans des essais thérapeutiques basés sur la combinaison du traitement par des inhibiteurs des HDACs et des DNMTs et une immunothérapie ciblant des antigènes tumoraux d’origine virale ou cellulaire. De telles expériences in vivo constitueront un modèle utile pour le traitement l’ATLL et de pathologies prolifératives touchant les cellules B chez l’homme.

L'appariement des chromatides sœurs est un prérequis fondamental pour la ségrégation fidèle du génome. Cet assemblage est précisément régulé par plusieurs facteurs modulant la solidarité entre le complexe formant la cohésine et les chromosomes. Un de ces facteurs, Pds5, engage la cohésine par le biais de SCC1 et participe à la fois au renforcement de la cohésion, et inversement à la libération de la cohésine de la chromatine. Dans cette thèse, la structure cristalline du complexe entre les protéines de levure Pds5 et SCC1 est présentée. Celle-ci permet la compréhension de la fonction moléculaire de Pds5. Pds5 forme un « heat-repeat » allongé qui se lie à SCC1 via une interface dont sa séquence reste conservée. Suite à la caractérisation biologique et biochimique de cette structure, cette thèse démontre que l'intégrité de l'interface entre Pds5 et SCC1 est indispensable pour le recrutement de Pds5 à la cohésine et que son abrogation conduit à la perte de la cohésion entre les chromatides sœurs ainsi que la perte de la viabilité cellulaire. Les résultats présentés dans cette thèse suggèrent donc que Pds5 est constitutivement lie au cœur de la sous-unité de la cohésine. / Sister chromatid cohesion is a fundamental prerequisite to faithful genome segregation. Cohesion is precisely regulated by accessory factors that modulate the stability with which the cohesin complex embraces chromosomes. One of these factors, Pds5, engages cohesin through Scc1 and participates both in the enhancement of cohesion, and conversely in mediating the release of cohesin from chromatin. In this thesis the crystal structure of a complex between budding yeast Pds5 and Scc1 is presented, thus elucidating the molecular basis of Pds5 function. Pds5 forms an elongated HEAT repeat that binds to Scc1 via a conserved surface patch. Through complementary cell biological and biochemical characterisation of this structure, the thesis demonstrates that the integrity of the Pds5–Scc1 interface is indispensable for the recruitment of Pds5 to cohesin, and that its abrogation results in loss of sister chromatid cohesion and cell viability. The results presented in this thesis therefore suggest that Pds5 is a constitutively bound, core subunit of cohesin.

Dans le domaine de l’épigénétique, la méthylation de l’ADN et les modifications des histones ont longtemps focalisé l’attention de la recherche biologique et médicale. Toutefois, notre vision de l’épigénétique s’est fortement élargie avec la découverte de « nouvelles » modifications épigénétiques de l’ADN et de l’ARN. Dès lors, au cours de cette thèse, nous avons voulu explorer trois de ces modifications, et leurs enzymes, dans le cadre des cancers du sein.Premièrement, nous avons étudié l’enzyme TET1, responsable de l’hydroxyméthylation de l’ADN (5hmC). Nous avons découvert que le niveau d’expression de TET1 dans les tumeurs mammaires basal-like corrélait avec les changements de 5hmC par rapport au tissu sain. Nous avons aussi établi un lien inédit entre la répression de TET1 et l’infiltration immune dans ces cancers. Nous avons ensuite démontré que cette répression était liée à l’activation canonique de NF-κB, un régulateur majeur de l’immunité et l’inflammation. Enfin, nous avons étendu ce nouveau mode de régulation de TET1 par l’immunité à d’autres types de cancers, y compris le mélanome, le cancer du poumon et le cancer de la thyroïde.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons effectué la première étude transcriptomique d’une nouvelle modification de l’ARN, l’hydroxyméthylation de l’ARN (5hmrC). Chez la drosophile, nous avons révélé la distribution de cette marque le long du transcriptome, associé une fonction régulatrice de la traduction protéique à la marque et révélé le rôle central de 5hmrC et dTet, l’enzyme responsable de sa formation, dans le développement du système nerveux central. A la suite de cette étude pionnière, nous avons investigué 5hmrC en lignées mammaires et nous avons découvert plus de 700 ARNs différentiellement hydroxyméthylés dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules mammaires normales. Globalement, nos résultats indiquent que 5hmrC constitue un nouveau niveau de dérégulation de la fonction des gènes dans les cancers du sein.Dans la dernière partie, nous avons examiné le rôle de la méthylation de l’ARN (m6A) dans les cancers mammaires. Nous avons cartographié la distribution de m6A en lignées et en tissus humains et identifié près de 2000 ARNs différentiellement méthylés dans les cellules cancéreuses. Ensuite, nous avons découvert qu’une déméthylase de l’ARN, FTO, était sous-exprimée dans les cancers du sein, et nous avons démontré que cette dérégulation s’accompagnait d’une augmentation globale de m6A et d’un mauvais pronostic de survie chez les patients. In vitro, la sous-expression de FTO cause un phénotype plus agressif en termes de migration, invasion et caractère souche des cellules cancéreuses mammaires. Ainsi, nos résultats semblent assigner une fonction suppressive de tumeur à FTO dans la glande mammaire.En conclusion, nos résultats démontrent l’importance biologique des « nouvelles » modifications de l’ADN et l’ARN et de leur dérégulation dans le développement des tumeurs mammaires. Nos données mettent au jour de nouveaux mécanismes par lesquels l’épigénétique contribue au processus de cancérogénèse et indiquent que l’étude de ces modifications pourrait avoir une utilité clinique. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La sénescence cellulaire est une réponse à un stress des cellules de mammifères se caractérisant entre autres par un arrêt durable du cycle cellulaire, la production d’un sécrétome particulier (SASP) et un remaniement de la chromatine. Celle-ci peut être déclenchée par des stress génotoxiques, l’activation d’oncogènes ou un raccourcissement trop important des télomères. Des analyses en spectrométrie de masse ont permis de mettre en évidence l’accumulation d’un variant d’histone dans le cas de sénescence cellulaire induite par des dommages à l’ADN. Ce variant, nommé H2A.J, représente 1% de la quantité totale d’histones H2A mais atteint près de 20% en sénescence longue durée. Cette thèse se concentre sur l’étude de la fonction de cette protéine H2A.J qui semblerait impliquer dans l’activation transcriptionnelle du SASP. Afin d'étudier le rôle de cette protéine, j'utilise des lignées stables de fibroblastes humains exprimant ou non un shARN ciblant le gène de H2A.J et je cherche à mettre en évidence des différences entre ces lignées. Du fait de son accumulation lié à l’activation des voies de réparation des dommages à l’ADN, ce variant présente un potentiel comme biomarqueur du vieillissement in vivo. A ce jour, aucun biomarqueur spécifique de cet état n’a été identifié. Enfin, L’expression constitutive du gène codant pour cette protéine suggère une régulation post-transcriptionnelle de sa déposition. L’un des objectifs du projet est de mettre en évidence les voies de régulation permettant l’accumulation dans la chromatine de H2A.J. / In mammalian cells, cellular senescence has been defined as a stress response. It is characterized by a stable cell cycle arrest, morphological transformation, a secretion of pro-inflammatory factors termed the SASP (senescence associated secretory phenotype) and the alteration of the chromatin structure. Originally, telomere loss or dysfunction was shown to trigger the onset of senescence. However, the senescence state can also result from inadequate culture conditions, oncogene induction or genotoxic stresses. Work in the lab focuses on mechanisms governing the onset and maintenance of senescence and on the search for new markers of senescence. We have recently identified chromatin modifications and epigenetic regulations during cellular senescence, such as post-translational modifications of histones and changes in the histone variants composition of nucleosomes. Mass spectrometry revealed the accumulation of a specific histone variant in DNA-damage induced senescence. This variant, H2A.J, makes up to 1% of the H2A histone content during proliferation, but reaches 20% of H2A species during deep senescence. The goal of my thesis work was to determine the function of this histone variant. We produced stable human fibroblast cell lines expressing shRNAs silencing the H2A.J gene. Microarray and RNA-sequencing analyses have shown that H2AJ-depleted fibroblasts have an altered transcriptome. In particular, such cells show a greatly delayed derepression in senescence of several SASP genes coding for some key cytokines and chemokines. This result indicates that accumulation of H2A.J in senescence is important for efficient expression of the SASP phenotype. Finally, the accumulation of senescent cells in aged tissues has often been inferred using surrogate markers (DNA damage, SA-B-Galactosidase, etc.). Our data suggest that H2AJ accumulation may be a novel in-vivo biomarker of aging for certain cell types.