P53 empêche la réplication d'ADN cellulaire pathologique ainsi que viral en activant la transcription d'effecteurs en aval. L'augmentation d'expression de p53 et sa phosphorylation en réponse à des oncogènes ou à des dommages à l'ADN sont considérées comme déterminant l'activation transcriptionnelle de p53. Les mutations tumorales et les protéines virales convergent fonctionnellement en inactivant p53. Par exemple la protéine cellulaire MDM2 et la protéine adénovirale E1 B-55K ciblent toutes les deux p53 pour sa dégradation. Ceci représente la base du raisonnement de la création des molécules antagonistes de MDM2 et de l'adénovirus oncolytique où E1B-55K a été supprimé, ONYX-015 (Oncorine), comme thérapies anticancéreuses ciblant p53. Pourtant ici, nous montrons que E1B-55K est dispensable pour l'inactivation de p53 et nous révélons un mécanisme épigénétique nouveau et dominant qui inactive l'activité de p53, quel que soit le niveau et la phosphorylation de p53. En utilisant une approche génétique, nous dévoilons qu'E4-ORF3, une autre protéine adénovirale, est le point de nucléation de domaines d'hétérochromatine, menant à l'inactivation des promoteurs cibles de p53, en empêchant sa liaison et donc son activation transcriptionnelle. De plus, nous montrons qu'E4-ORF3 forme un échafaudage nucléaire qui dirige deux métyltransferases, SUV39H1 et SUV39H2, vers ces nouveaux domaines répressifs. Notre étude change la définition fondamentale du mécanisme d'inactivation de p53 dans les cellules infectées par un adénovirus, apportant une nouvelle lumière sur un mécanisme critique qui va maintenant permettre le développement de thérapies adénovirale vraiment sélectives du statut p53 des cellules. / P53 guards against pathological cellular and viral DNA replication by activating the transcription of downstream effectors. The induction of p53 levels and its phosphorylation in response to oncogenes and DNA damage is thought to determine p53 transcriptional activation. Tumor mutations and viral proteins functionally converge in inactivating p53. For example the cellular protein MDM2 and the adenoviral protein E1B-55k both target p53 for its degradation. This is the premise for MDM2 antagonists and the E1B-55k deleted oncolytic adenovirus, ONYX-015 (Oncorine) as p53-targeted cancer therapies. However, here we show that E1B-55k is dispensable for p53 inactivation and reveal a novel and dominant epigenetic mechanism that silences p53 activity, irrespective of p53 level and phosphorylation. Using a genetic approach, we reveal that E4-ORF3, another adenoviral protein, nucleates heterochromatin domain, leading to the silencing of p53 target promot er by preventing its binding and subsequent transcriptional activation. Moreover we show that E4-ORF3 forms a novel nuclear scaffold that directs two methyltransferases, SUV39H1 and SUV39H2, to this newly formed repressive domains. Our study changes the fundamental definition of how p53 is inactivated in adenovirus infected cells, and provides a critical mechanistic insight that could now enable the rational development of true p53 tumor selective adenoviral therapies.

Thèse ou mémoire avec insertion d’articles / La complexité et le coût de production à grande échelle des rAAV présentent un sérieux obstacle à la commercialisation des thérapies géniques. Des améliorations dans la fabrication des vecteurs rAAV sont réalisables à l'aide de lignées cellulaires d'empaquetage ou productrices, qui, dans le cas des rAAV, sont difficiles à générer en raison de la toxicité des protéines AAV Rep et des gènes auxiliaires d'adénovirus nécessaires à la production. Le gène AAV REP code pour quatre protéines Rep (Rep -78, -68, -52, -40) qui ont de multiples fonctions et rôles qui se chevauchent dans la production d'AAV. Les gènes auxiliaires adénoviraux utilisés dans la production de rAAV sont E2A, E4 et VA et jouent des rôles uniques dans le cycle de vie de l'AAV. Pour générer une lignée cellulaire d'empaquetage de AAV, tous ces composants doivent être intégrés de manière stable dans le génome des cellules. L'expression doit être étroitement régulée en raison de la cytotoxicité et lorsque l'expression est induite, les niveaux doivent être adéquats pour soutenir la production de rAAV. Une telle lignée cellulaire d'empaquetage serait un point de départ pour créer une lignée cellulaire productrice pour la production d'un sérotype spécifique d'AAV et d'un gène thérapeutique spécifique en intégrant un gène CAP d'intérêt et une séquence thérapeutique flanquée d'ITR. Le travail présenté dans cette thèse décrit le processus de génération et de caractérisation des lignées cellulaires d'empaquetage 293SF-CymR/λR-GyrB AAV exprimant les protéines Rep et les conceptions et tentatives de création d'une lignée cellulaire d'empaquetage Rep/Helper. Nous avons identifié et intégré avec succès une combinaison de deux protéines Rep (Rep68 et Rep40) exprimées à partir de deux promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. Les lignées cellulaires créées ont démontré leur capacité à produire des titres à des niveaux comparables aux productions par transfection transitoire avec les lignées cellulaires parentales et se sont avérées stables en culture sans sélection. Nous décrivons également notre conception et nos travaux de recherche sur la faisabilité pour générer des lignées cellulaires d'emballage Rep/Helper où les séquences codant pour les protéines E4orf6 et E2A DBP sont également exprimées à partir de promoteurs inductibles par le cumate et la coumermycine. / The complexity and cost of large-scale rAAV production present a serious obstacle in commercialization of rAAV gene therapies. Improvements in rAAV vector manufacturing are achievable using packaging or producer cell lines, which in case of rAAVs are difficult to generate due to the toxicity of AAV Rep proteins and adenovirus helper genes required for production. The AAV REP gene encodes four Rep proteins (Rep -78, -68, -52, -40) which have multiple overlapping functions and roles in AAV production. The adenoviral helper genes used in rAAV production are E2A, E4 and VA and serve unique roles in the AAV lifecycle. To generate an AAV packaging cell line all these components must be stably integrated into the genome of the cells. Expression must be tightly regulated due to cytotoxicity and when expression is induced, the levels must be adequate to support rAAV production. Such a packaging cell line would be a starting point to create a producer cell line for production of a specific serotype of AAV and specific therapeutic gene by integrating a CAP gene of interest and ITR flanked therapeutic sequence. The work presented in this thesis describes the process of generating and characterizing 293SF-CymR/λR-GyrB AAV packaging cell lines expressing the Rep proteins and the designs and attempts of creating a Rep/Helper packaging cell line. We successfully identified and integrated a combination of two Rep proteins (Rep68 and Rep40) expressed from two cumate and coumermycin inducible promoters. The created cell lines demonstrated ability to produce titers at levels comparable to transient transfection productions with the parental cell lines and were shown to be stable in culture without selection. We also describe our design and investigation into the feasibility of Rep/Helper packaging cell line generation where the E4orf6 and E2A DBP protein coding sequences are also expressed from cumate and coumermycin inducible promoters.

Le cancer de la prostate (CaP) est caractérisé par un microenvironnement tumoral immunosuppresseur qui inhibe l'immunité antitumorale. Le traitement avec des immunomodulateurs, comme les cytokines (e.g. IL-12), pourrait modifier la réponse immunitaire. Cependant, l'administration systémique d'immunomodulateurs peut provoquer des toxicités. Pour éviter cela, les immunomodulateurs pourraient être produits dans la tumeur par un adénovirus assurant l'expression du transgène spécifiquement au CaP. Notre laboratoire a construit un tel adénovirus codant pour l'IL-12 murin (mIL-12) sous le contrôle du promoteur PCA3 et d'un système d'amplification appelé TSTA. Il a été démontré que cet adénovirus, nommé Adv-PCA3-TSTA-mIL-12, réduisait la croissance des tumeurs de prostate TRAMP-C2 chez les souris C57BL/6. Ici, nous avons cherché à vérifier un possible effet synergique de l'activation d'OX40 pour améliorer la réponse observée avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. OX40 murin (mOX40), ainsi que son ligand (mOX40L), sont des points de contrôle immunitaires qui appartiennent à la superfamille des Tumor Necrosis Factors. Pour atteindre cet objectif, nous avons proposé deux approches. Dans la première, nous avons cherché à produire un Adv-PCA3-TSTA-mOX40L afin de l'utiliser en combinaison avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. L'Adv-PCA3-TSTA-mOX40L a été construit, mais sa capacité à induire l'expression de mOX40L dans les cellules TRAMP-C2 n'a pas encore été confirmée. Dans la seconde, un anticorps monoclonal (AcMo) agoniste anti-mOX40 serait administré en combinaison avec l'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. Pour tester cette approche, des cellules TRAMP-C2 ont été implantées chez des souris et les tumeurs ont été traitées par injections d'Adv-PCA3-TSTA-mIL-12 seules ou en association avec des injections de AcMo anti-mOX40 ou anti-mPD-1, comme comparateur. Les résultats n'ont montré aucun effet synergique significatif des combinaisons. Les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs ont montré peu de changements significatifs, à l'exception d'une diminution des cellules CD8⁺PD-1⁺ dans les tumeurs traitées avec les anti-mOX40 ou anti-mPD-1. La combinaison de la stimulation d'OX40 avec l'Adv-PCA3-TSTA-IL-12 ne semble pas avoir d'effet synergique. Des combinaisons plus efficaces devraient être recherchées. / Prostate cancer (PCa) is characterized by an immunosuppressive tumor microenvironment that inhibits antitumor immunity. Treatment with immunomodulators, such as cytokines (e.g., IL-12), could modify the immune response. However, systemic administration of immunomodulators can cause toxicities. To avoid these toxicities, the immunomodulators could be produced locally in the tumor using an adenoviral vector able to ensure PCa-specific expression of the transgene. Our laboratory previously constructed such an adenovirus encoding the murine IL-12 (mIL-12) under the control of the PCa-specific promoter PCA3 and an amplification system called TSTA. This adenovirus, named Adv-PCA3-TSTA-mIL-12, was shown to reduce the growth of TRAMP-C2 prostate tumor in C57BL/6 mice. Here, we aimed to test a possible synergistic effect of the activation of OX40 to improve the response observed with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The murine OX40 (mOX40), along with its ligand (mOX40L), are immune checkpoints that belong to the Tumor Necrosis Factor superfamily. To achieve this goal, we proposed two approaches. In the first, we aimed to produce an Adv-PCA3-TSTA expressing mouse OX40L in order to use it in combination with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The Adv-PCA3-TSTA-mOX40L was constructed, but its capacity to induce mOX40L expression in TRAMP-C2 cells has not been confirmed yet. In the second, agonistic anti-mOX40 monoclonal antibody (mAb) would be administered in combination with Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. To test this approach, TRAMP-C2 cells were implanted in mice and tumors were treated by injections of Adv-PCA3-TSTA-mIL-12 alone or in combination with injections of anti-mOX40 or anti-mPD-1 (as comparator) mAbs. Results showed no statistically significant synergistic effects of the addition of treatment with anti-mOX40 to Adv-PCA3-TSTA-mIL-12. The immune cells infiltrating tumors showed few significant changes, except for a decrease in CD8⁺+D-1+ cells in tumors treated with anti-mOX40 or anti-mPD-1 mAbs. The combination of OX40 stimulation with Adv-PCA3-TSTA-IL-12 appears to have no synergistic effect. We conclude by suggesting that more effective combinations should be looked for.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mes travaux de thèse ont pour but d’évaluer l’approche « épitope display » pour sa capacité d'induire les réponses cellulaires. Ad à capside modifiée par insertion de différents épitopes T issus de la ovalbumine ont étés produit. Après administration à des souris C57BL/6, j'ai mis en évidence l'induction de la réponse cellulaire dirigée contre les épitope insérés (grâce aux techniques ELISPOT, tétramères, ou bien en quantifiant la production d’IFNg par les splénocytes restimulés in vitro). J’ai démontré que ces réponses sont limités chez des souris préalablement immunisées avec Ad. Des manipulations en course ont pour but de confirmer ces résultats et d'évaluer la cinétique de ces réponses. Mon 2ème objectif est de comprendre les paramètres qui contrôlent l’immunogénicité des Ad présentant des épitopes. Ainsi, j’ai montré que l’ablation des interactions des Ad porteurs d’un épitope issu de l’ovalbumine avec les récepteurs/facteurs (intégrines, facteur X de la coagulation) impliqués dans l’entrée de l’Ad dans les cellules ne modifiait pas leur capacité à induire une réponse humorale contre l’ovalbumine. Ces résultats suggèrent que le processus d’infection virale n’est pas requis pour l’induction d’une réponse humorale par les Ad porteurs d’épitopes. / Recombinant adenoviruses (Ad) have recently been employed for a wide range of vaccination strategies. Unfortunately, highly prevalent pre-existing neutralizing antibodies (Abs), reduce their ability to trigger transgene expression. To avoid the step of gene transfer a new vaccination strategy has been proposed based on the use of Ad displaying epitopes inserted into their capsid proteins. Using an ovalbumin-derived B cell epitope, our group demonstrated that vaccination efficiency depends on both the site of peptide insertion and the host immune status towards Ad (Lanzi et al; 2011). The present work aims at (1) evaluating the potency of Ad displaying T-cell epitopes from ovalbumin to elicit cellular responses and (2) understanding the molecular bases controlling the efficacy of this vaccination strategy. 1) Ad displaying T-cell epitopes from ovalbumin were constructed, produced and characterized in vitro. First in vivo experiments in naive mice showed induction of cellular responses, assessed with techniques like ELISPOT, tetramer staining and in vitro splenocyte restimulation. Subsequent experiments showed that pre-exisitng anti-vector immunity is hampering the potent induction of anti-epitope cellular responses. Current work is aiming at confirming the obtained results as well as at evaluating the kinetics of cellular responses induced upon "epitope display" vaccination. 2)First, the influence of interactions of Ad (displaying OVA peptide) with their natural receptors was investigated. Different detargeted Ads were produced and characterized in vitro. Upon mice immunization these vectors led to unmodified anti-epitope humoral responses, suggesting that their efficacy does not depend on the ability to transduce cells. In parallel we sought to evaluate the impact of innate immunity on the outcome of anti-epitope adaptive immune responses. Upon immunization of WT and MyD88-/- mice with Ad displaying OVA epitope we observed that cellular responses induced in MyD88-/- mice are significantly diminished while humoral responses were not altered. These results remain to be confirmed but question the role of other innate immunity sensors in the immunogenicity of Ad-based vaccines. Altogether, our work is expected to provide the foundations for the development of Ad-based vaccines with minimized side effects and unaltered adjuvant properties.

Avec leurs caractéristiques d'auto-renouvellement illimité et de pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent une source infinie de cellules pour la thérapie cellulaire de maladies, telle que la dystrophie musculaire de Duchenne. Des études ont démontré que les hESC pouvaient être différenciées en cellules musculaires squelettiques, mais les techniques employées sont longues et inefficaces. Ce mémoire décrit un nouveau protocole de différenciation des hESC en cellules musculaires squelettiques à l'aide d'un adénovirus exprimant le gène MyoD sous le contrôle du promoteur CAO (Ad.CAO-MyoD). L'efficacité de ce virus pour induire la myogenèse des hESC a été mise en évidence par la présence de divers marqueurs myogéniques. Ensuite, le potentiel de fusion de ces cellules a été illustré par le marquage de la MyHC et par l'observation de quelques myotubes. Ces résultats préliminaires semblent indiquer que l'Ad.CAO-MyoD est un outil prometteur pour différencier les hESC en cellules musculaires squelettiques.

D'année en année, plusieurs études rapportent de nouvelles utilisations aux immunoglobulines intraveineuses (IglV). La constante augmentation de la demande pour ce produit pourrait mener à une pénurie. Afin de pouvoir produire des IglV in vitro à partir de lymphocytes B humains, l'étude des gènes impliqués dans la prolifération et la différenciation de ces cellules à l'aide d'un vecteur adenoviral s'avère pertinente. Cependant, des variations dans l'efficacité de transduction chez les lymphocytes B humains de sang périphérique et les cellules de la lignée plasmocytaire U266 ont été observées. Afin de comprendre cette différence, une étude de l'entrée et du cheminement du vecteur adenoviral chimérique Ad5/F35 à l'intérieur des cellules lymphocytaires a été entreprise. Des différences de liaison virus-cellule ont été observées entre les lymphocytes B et les cellules de la lignée U266, suggérant que certaines de ces protéines seraient impliquées dans le trafic intracellulaire d'Ad5/F35 et l'efficacité de transduction.

Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme, dont l’agent étiologique majeur est l’infection par les papillomavirus humain (notamment HPV-16 et 18), qui sont de petits virus infectant les épithéliums muqueux et cutanés, et pouvant induire la formation de tumeurs. L’inducteur majeur du processus oncogène est le processus d’intégration des régions codantes pour les oncoprotéines E6 et E7, au sein de la cellule hôte suite à l’infection. Elles interférent avec le cycle cellulaire et induisent notamment l’immortalisation, voire la transformation des cellules. Les fonctions les plus connue de ces deux oncoprotéines sont la dégradation des suppresseurs de tumeur p53 et pRb, respectivement. Mon travail de thèse à consisté en la mise au point des vecteurs adénoviraux exprimant des miARN dirigés contre l’oncoprotéine E6. Exprimés in vitro ils induisent l’induction de la mort cellulaire par apoptose des cellules tumorales traitées, via l’activation de la voie de caspases, et in vivo permettent le ralentissement de la croissance de tumeurs xénogreffées à des souris Nude. De plus, la stratégie thérapeutique adénovirale a montré ses extensions possibles sur d’autres types de cancers HPV-positifs, mais également via l’expression de différentes moléculaires thérapeutiques, visant à empêcher l’interaction des oncoprotéines telles qu’E6 avec leurs partenaires cellulaires et ainsi les empêcher d’exercer les activités biologiques impliquées dans le développement de cancers. Pour finir, les adénovirus peuvent également être vu comme des outils d’extinction fonctionnels d’E6 et permettant d’étudier les répercutions sur d’autres processus cellulaires. / Cervical cancer is the third most common female cancer. Infection by human papillomavirus (mainly HPV-16 and 18), with tropisms for mucosal or cutaneous squamous surfaces, is the major etiological agent implicated in cancer and tumor development. After infection, the oncogenic process is triggered by integration of oncoproteins E6 and E7 coding regions into the host cell genome. After integration, these oncoproteins interfere with the cell cycle and induce immortalization and cellular transformation of normal cells. The best known function of these two oncoproteins is the degradation of tumors suppressors p53 and pRb respectively. My thesis project consisted in the development of adenoviral vectors expressing miRNA directed against E6 oncoprotein. Their in vitro expression resulted in cellular death by apoptosis of the treated tumor cells, and allowed reduction of tumor growth in vivo in nude mice xenografts. In addition, the adenoviral therapeutical strategy showed its possible extensions on other types of HPV-positive cancers, but also through the possible expression of different therapeutic molecules aimed at preventing the interaction of viral oncoproteins, such as E6, with their cellular partners. These abolished interactions prevent oncoproteins from exercising their biological activities implicated in the development of cancers. In conclusion, we can say that adenoviruses can also be seen as functional tools suppressing E6 and enabling to highlight the repercussions of its suppression on other cellular processes.