Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Le facteur de transcription GATA4 joue un rôle majeur dans le développement du cœur, du système digestif et des gonades. Bien qu'un grand nombre de gènes cibles de GATA4 soit connu, les mécanismes qui régulent sa propre expression restent à définir. Afin de mieux comprendre la régulation de G AT A4 dans les gonades, un fragment de 5 kb situé en amont de l'exon 1 du gène Gata4 de rat a été clone et inséré devant le gène rapporteur luciferase. Des expériences de transfections transitoires dans des lignées gonadiques (MA-10, MSC-1, DC3) et hétérologue (CV-1) ont révélé que l'activité basale du promoteur Gata4 était assurée par une courte région d'ADN de 118 pb en amont de l'exon 1. Une étude in silico comparant les séquences orthologues de cette région a permis d'identifier plusieurs éléments « cis » conservés. Une mutagenèse de ces sites a démontré qu'un élément E-box était crucial pour l'activité basale du promoteur Gata4. Des essais de retardement sur gel ont mis en évidence la liaison de la E-box par les facteurs de transcription ubiquitaires USF1 et USF2. Cette étude décrit pour la première fois les éléments de régulation basale requis pour la transcription du gène G AT A4. / The GATA4 transcription factor plays a major role in the development of the heart, the gut and gonads. Although many target genes regulated by GATA4 have been identified, surprisingly little is known about the factors and the mechanisms implicated in the regulation of the GATA4 gene itself. In order to better understand how GATA4 expression is controlled in the gonads, 5 kb of the region immediately upstream of exon 1 of the rat Gata4 gene have been cloned and placed upstream of a firefly luciferase reporter. Transient transfection assays in both homologous (MA-10, MSC-1 and DC3) and heterologous (CV-1) cell lines revealed that the first 118 bp were sufficient to drive full promoter activity. Comparative sequence analysis revealed the presence of multiple conserved cisregulatory elements located within this minimal promoter region. Site-directed mutation of these sites identified an E-box as the crucial element required for the basal activity of the Gata4 promoter. Subsequent gelshift assays showed that the E-box was bound by the ubiquitous transcription factors USF1 and USF2. Therefore, this study provides the first description of the regulatory sequences required for GATA4 transcription.

Gata4 est un facteur de transcription exprimé par les entérocytes. Nos études ont démontré que Gata4 pouvait réguler l'expression de Pap1 chez le rat. Ce gène encode pour une protéine sécrétoire de type lectine impliquée dans le contrôle de la prolifération bactérienne. Puisqu'il a été démontré que des lectines antibactériennes de la famille Pap sont sécrétées dans la lumière intestinale en réponse à des stimuli inflammatoires, le but de cette étude était de définir l'implication transcriptionnelle de Gata4 dans la réponse inflammatoire des cellules épithéliales intestinales. Afin de caractériser l'effet de Gata4 sur la régulation transcriptionnelle de Pap1 dans les cellules Caco-2/15, nous avons utilisé des essais luciférase et généré différents mutants de la protéine Gata4 et du promoteur Pap1 . Nous avons également utilisé des immunobuvardages et des analyses de gel de rétention afin de mesurer la quantité et l'affinité de Gata4 pour l'ADN dans les cellules IEC-6/Cdx2. Les essais luciférase ont démontré que Gata4, en combinaison avec Cdx2, amène un effet synergique important sur l'activité du promoteur de Pap1 de l'ordre d'environ 8 fois. Différents mutants de la protéine Gata4 ont montré une abolition du potentiel transcriptionnel, démontrant que l'effet observé est spécifique. Cependant, la cotransfection d'un mutant du domaine en doigt de zinc (Zn) localisé en N-terminal, en combinaison avec Cdx2, augmente radicalement l'activation du promoteur de 18 fois. Des résultats préliminaires ont également démontré que la surexpression de ce mutant dans les cellules IEC-6/Cdx2 augmente fortement l'expression endogène du gène Pap1 . Cet effet pourrait être médié par des interactions avec les cofacteurs Fog. En effet, la cotransfection de Fog1 réprime l'effet synergique observé avec Gata4 de type sauvage mais non avec le mutant du domaine en doigt de Zn en N-terminal. Les mutants générés du promoteur Pap1 ont permis d'identifier le site Cdx2 et le site Gata le plus proximal du site d'initiation de la transcription comme nécessaire à l'effet transcriptionnel de Gata4 et Cdx2. En utilisant comme modèle les cellules IEC-6/Cdx2, nous avons montré qu'une induction avec des LPS n'a pas d'effet significatif sur la quantité totale de la protéine Gata4 mais des résultats préliminaires montrent une modulation de la phosphorylation de Gata4 sur la sérine 105. Par gel de rétention, nous avons montré que GATA4 a une affinité pour plusieurs sites sur le promoteur du gène Pap1 et qu'elle est augmentée en condition de stress cellulaire induit par les LPS. Cette étude nous permet de mieux comprendre l'implication de Gata4 dans la réponse inflammatoire de la cellule épithéliale intestinale.

The GATA transcription factors consist of six family members that bind the consensus DNA binding element W-GATA-R, and are poorly characterized in the central nervous system (CNS). In this thesis we identify GATA4 to be expressed in the neurons and glia of normal murine and human embryonic and adult CNS with significant loss in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most common and lethal primary brain tumour and exhibits multiple molecular aberrations. Here we report that loss of the transcription factor GATA4, a negative regulator of normal astrocyte proliferation, is a driver in glioma formation and fulfills the hallmarks of a tumour suppressor gene. Although GATA4 was expressed in normal brain, loss of GATA4 was observed in GBM operative samples and was a negative survival prognostic marker. GATA4 loss occurred through promoter hypermethylation or novel somatic mutations. Loss of GATA4 in normal human astrocytes promoted high-grade astrocytoma formation, in cooperation with other relevant genetic alterations such as activated Ras or loss of TP53. Loss of GATA4 with activated Ras in normal astrocytes promoted a progenitor like phenotype, formation of neurospheres and the ability to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes. Re-expression of GATA4 in human GBM cell lines, primary cultures and brain tumour initiating cells suppressed tumour growth in vitro and in vivo through direct activation of the cell cycle inhibitor P21CIP1, independent of TP53. Re-expression of GATA4 also conferred sensitivity of GBM cells to temozolomide, a DNA alkylating agent currently used in GBM therapy. This sensitivity was independent of MGMT, the DNA repair enzyme often implicated in temozolomide resistance. Instead GATA4 reduced expression of APNG, a DNA repair enzyme poorly characterized in GBM mediated temozolomide resistance. Identification and validation of GATA4 as a tumour suppressor gene and its downstream targets in GBM may yield promising novel therapeutic strategies.

The GATA transcription factors consist of six family members that bind the consensus DNA binding element W-GATA-R, and are poorly characterized in the central nervous system (CNS). In this thesis we identify GATA4 to be expressed in the neurons and glia of normal murine and human embryonic and adult CNS with significant loss in Glioblastoma Multiforme (GBM). GBM is the most common and lethal primary brain tumour and exhibits multiple molecular aberrations. Here we report that loss of the transcription factor GATA4, a negative regulator of normal astrocyte proliferation, is a driver in glioma formation and fulfills the hallmarks of a tumour suppressor gene. Although GATA4 was expressed in normal brain, loss of GATA4 was observed in GBM operative samples and was a negative survival prognostic marker. GATA4 loss occurred through promoter hypermethylation or novel somatic mutations. Loss of GATA4 in normal human astrocytes promoted high-grade astrocytoma formation, in cooperation with other relevant genetic alterations such as activated Ras or loss of TP53. Loss of GATA4 with activated Ras in normal astrocytes promoted a progenitor like phenotype, formation of neurospheres and the ability to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes. Re-expression of GATA4 in human GBM cell lines, primary cultures and brain tumour initiating cells suppressed tumour growth in vitro and in vivo through direct activation of the cell cycle inhibitor P21CIP1, independent of TP53. Re-expression of GATA4 also conferred sensitivity of GBM cells to temozolomide, a DNA alkylating agent currently used in GBM therapy. This sensitivity was independent of MGMT, the DNA repair enzyme often implicated in temozolomide resistance. Instead GATA4 reduced expression of APNG, a DNA repair enzyme poorly characterized in GBM mediated temozolomide resistance. Identification and validation of GATA4 as a tumour suppressor gene and its downstream targets in GBM may yield promising novel therapeutic strategies.

Au niveau intestinal, le facteur de transcription Gata4 est exprimé dans les cellules épithéliales de la partie proximale de l’intestin grêle. Ce facteur est un régulateur de plusieurs gènes tel celui encodant la sucrase isomaltase. Quelques études ont aussi suggéré que ce facteur est impliqué dans le contrôle de l’expression de molécules de jonction, favorisant ainsi la polarisation des cellules épithéliales en culture. Dans notre laboratoire, des résultats tendent à démontrer que Gata4 est impliqué dans la réponse inflammatoire des cellules épithéliales en régulant, avec ses cofacteurs Cdx2 et Fog1, l’expression génique du peptide antimicrobien Pap1. In vivo, l’invalidation de Gata4 a montré que ce facteur de transcription est impliqué dans le maintien de l’identité et des fonctions du jéjunum par rapport à l’iléon. Cependant, aucune étude ne s’est intéressée à la régulation des molécules de jonction dans ce contexte. La présente étude a pour but de compléter l’étude de la régulation du gène Pap1 par Gata4 et d’étudier le rôle de Gata4 dans le contrôle de l’expression des molécules de jonction chez la souris. Nos résultats confirment le rôle du facteur de transcription Gata4 et de son corépresseur Fog1 dans le contrôle de l’expression de Pap1. La méthode d’interférence à l’ARN dirigée contre Fog1 a permis d’induire spontanément l’expression de Pap1 dans la lignée IEC-6/Cdx2. Chez la souris, la perte de Gata4 modifie l’expression de certaines molécules de jonction cellulaire. Des PCR quantitatifs et des immunobuvardages ont révélé que l’expression de plusieurs molécules de jonction est modulée en absence de Gata4. La Claudine 2 est la molécule de jonction dont l’expression est la plus induite autant au niveau de l’ARNm que de la protéine. Ces modifications entraînent une augmentation du passage paracellulaire du FITC-dextran fluorescent, ce qui suggère que l’épithélium est plus perméable aux macromolécules. Des infections orales par Salmonella Typhimurium ont révélé un passage accru de ces bactéries dans les animaux femelles. L’ensemble de ces travaux suggère que Gata4 est impliqué dans le contrôle de la perméabilité des jonctions intercellulaires ainsi que dans la protection des cellules épithéliales intestinales contre les bactéries.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 208-212. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le facteur de transcription GATA4 est essentiel au développement et à la fonction des tissus dérivant du mésoderme et de l’endoderme, incluant les gonades. Le gène GATA4 est exprimé sous différents transcrits qui se distinguent par la séquence de leur premier exon non codant. Deux de ces transcrits sont majoritairement exprimés et sont conservés à travers les espèces : le transcrit GATA4 E1a (généré par un promoteur proximal 1a) et le transcrit GATA4 E1b (produit par le promoteur distal 1b). Des études effectuées chez des modèles de souris ont démontré qu’une séquence de 5 kb en amont du promoteur 1a du gène Gata4 est suffisante pour récapituler l’expression endogène du gène seulement dans une sous-population de cellules ayant le facteur GATA4, incluant les cellules de Sertoli dans les gonades mâles. Nous avons donc émis l’hypothèse que le promoteur 1b, tout comme le promoteur 1a, contribue au profil d’expression cellules- et tissus-spécifique de Gata4. Afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent l’activité du promoteur alternatif 1b du gène Gata4 in vivo, nous avons généré une souris transgénique exprimant la protéine GFP sous le contrôle d’une séquence de 2 kb en amont de l’exon 1b. L’expression du transgène a été analysée dans plusieurs tissus et à différents stades de développement en détectant la protéine GFP par épifluorescence, immunohistochimie et Western Blot. Les résultats ont démontré qu’une séquence de 2 kb n’est pas suffisante pour induire l’expression du transgène chez la souris et suggèrent que des éléments de régulation supplémentaires sont nécessaires pour permettre l’expression endogène du gène Gata4 via son promoteur alternatif 1b. Afin d’identifier ces éléments, divers outils bio-informatiques couplés à des analyses in vitro ont été utilisés. Mes travaux de maîtrise mettent en évidence huit nouveaux enhancers potentiellement impliqués dans la régulation de l’activité du promoteur 1b de Gata4. Les résultats de cette étude permettent une meilleure compréhension des mécanismes transcriptionnels de l’activité du promoteur 1b de Gata4 dans différents types cellulaires et à différents stades du développement. / The GATA4 transcription factor is essential for the development and function of multiple tissues derived from both mesoderm and endoderm, such as the gonads. The GATA4 gene is expressed as multiple transcripts that differ in their first untranslated exon sequence. Two of them are predominantly expressed and are conserved among species: transcripts GATA4 E1a (generated by the proximal 1a promoter) and GATA4 E1b (via its distal 1b promoter). Previous studies using transgenic mice demonstrated that a 5 kb sequence upstream of 1a promoter is sufficient to recapitulate endogenous Gata4 expression only in a subset of cells normally containing GATA4, including Sertoli cells in the male gonad. We therefore hypothesized that 1b promoter, like 1a promoter, contributes to cell- and tissue-specific Gata4 expression. To gain insight into the mechanisms that control the activity of the Gata4 1b promoter in vivo, we generated transgenic mice expressing a GFP reporter under the control of 2 kb of sequences upstream of the distal promoter. Transgene expression was assessed in several tissues and at many developmental stages by detecting GFP protein by epifluorescence, immunohistochemistry and Western Blot. The results showed that 2 kb of upstream sequences of Gata4 1b promoter are not sufficient to direct transgene expression in the mouse and suggest that other elements are required for endogenous transcription of the gene from its distal 1b promoter. To identify these elements, several bioinformatic analyses coupled with in vitro assays were performed. My work highlights eight new enhancers potentially involved in Gata4 1b promoter activity. The results from this thesis will help to provide a better understanding of the mechanisms involved in the transcriptional regulation of the GATA4 gene in different cell types and at different developmental stages.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

The development and function of the heart is governed by a conserved set of transcription factors (TFs) that regulate gene expression in a cell-type, time point and stimulus driven manner. Of these core cardiac TFs, the most ubiquitously expressed is the zinc finger protein GATA4. In cardiomyocytes, GATA4 is central to proliferation, differentiation, hypertrophy and induction of pro-survival pathways. In cardiac endothelial cells, it is required for valve and septal development, although the exact mechanisms remain unclear. To regulate such a wide array of functions in a spatially and temporally controlled manner, GATA4 interacts with specific protein partners, the majority of whom have been identified in cardiomyocytes. However, a complete understanding of the protein interactome of GATA4, particularly in cardiac endothelial cells, has not yet been achieved. Using a mass spectrometry-based approach, we have identified a series of novel GATA4 interacting partners in cardiac endothelial cells. 3xFlag GATA4 was stably overexpressed via retroviral transduction in the TC13 cardiac endothelial precursor cell line, immunoprecipitated from nuclear protein extracts and sent for HPLC-ESI-MS/MS. Several novel GATA4 interacting partners were identified including the chaperone protein Heat Shock Protein 70 (HSP70), the inducible orphan nuclear receptor Nerve Growth Factor 1β (NGFIβ, NUR77) and the Drosophila-Binding/Human Splicing protein family members Non-POU Domain Containing Octamer Binding Protein (NONO) and Paraspeckle 1 (PSPC1). Chapter 1 discusses the interaction between GATA4 and HSP70 and its role in cardiomyocyte survival upon exposure to chemotherapeutic agent Doxorubicin (DOX). HSP70 binds directly to GATA4, preventing DOX-mediated cleavage and degradation by Caspase-1, cardiomyocyte cell death and heart failure. Chapter 2 focuses on the cooperative interaction between GATA4 and NUR77 in cardiac microvascular endothelial cells and its central role in myocardial angiogenesis in response to pressure overload. The GATA4-NUR77 complex transactivates the promoter of Angiopoietin-Like 7 (ANGPTL7), a secreted pro-angiogenic chemotactic factor, triggering endothelial cell proliferation and tube formation in cultured cardiac endothelial cells and increasing myocardial capillary density in vivo. Chapter 3 discusses the interaction between GATA4 and the DBHS proteins NONO and PSPC1 in the regulation of cardiac development. These proteins play opposing roles when bound to GATA4 as PSPC1 enhances GATA4 activation of critical cardiac promoter targets and NONO acts as a rheostat to repress GATA4 activity. In vivo, loss of NONO results in left ventricular non-compaction consistent with humans with loss-of-function mutations. However, simultaneous Gata4 haploinsufficiency partially rescues this phenotype. Together, this data identifies multiple novel cell type and time point specific GATA4 protein partners and sheds light on GATA4 regulatory mechanisms in cardiac development and disease.

Congenital heart defects due to the aberrant development of the atrioventricular (AV) valves and septum are among the most common developmental abnormality in newborns and cause significant neonatal morbidity and mortality. A key point in cardiac morphogenesis occurs when cells within the endocardial cushions (ECCs), the precursors for the AV valvoseptal complex, delaminate and undergo an epithelial-to-mesenchymal transformation (EMT). The mesenchymal cells then proliferate and the cushion area elongates to form the AV valves and portions of the AV septae. The signals that initiate region-specific EMT during heart development are unknown. Cilia, known for their role in establishing left-right (LR) asymmetry, function to receive and integrate extracellular signals, including fluid flow, in a range of other organ systems. We hypothesize that cilia could also have a direct role in heart development outside of their role in LR development. Using immunohistochemistry, we demonstrated the presence of cilia on the myocardium, epicardium, and ECCs of wild-type mouse hearts at embryonic day (e) 9.5 and e12.5. To characterize the potential role of these cilia, we compared mice with mutations affecting ciliary biogenesis, motility, and mechanosensation. Using bright field microscopy and in situ hybridization, we analyzed the embryonic heart structure and the expression pattern of Gata4, an EMT transcription factor. We showed that compared to mice with immotile but structurally normal cilia, the mice without cilia had hypocellular ECCs, a thinned compact myocardium (CM), and an up-regulated expression of Gata4. These observations suggest that a subset of cilia called cardiac cilia have a role in cardiogenesis outside of their role in LR development and affect Gata4 expression. One possible function of cardiac cilia is as mechanosensors, integrating fluid flow and influencing cardiac morphogenesis including EMT and development of the CM.