Thèse-Universit́e de Paris. / Index bibliographique:-p. [107]-116.

Thèse d'exercice : Médecine. Génétique médicale : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 92-101 [178 réf.].

Thèse--Méd.--Reims, 1976. N°: N° 100. / Bibliogr. f. 152-165.

Thèse de doctorat--Sciences naturelles--Faculté des sciences de Paris, 1906. N°: 29. / Notes bibliogr.

Th. 3e cycle--Physiol. de la nutr.--Toulouse 3, 1977. N°: 1997.

Mémoire de DES : Biologie médicale : Université de Nantes : 2005. Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 74-80.

Dans l’intestin, le récepteur P2X7, un membre unique de la famille P2X, est fortement exprimé à la surface des cellules épithéliales intestinales le long des villosités, ce qui suggère un autre rôle pour ce récepteur que l’induction de l’apoptose des cellules à l’apex des villosités. Dans des modèles de cellules intestinales, nous avons mis en évidence qu’à la suite de l’activation du récepteur P2X7, la translocation à la membrane de GLUT2, le transporteur facilité du glucose, du fructose et du galactose dans l’intestin, était diminuée. Cette diminution d’expression s’accompagne d’une diminution d’absorption dans les cellules IEC-6 et d’une diminution du transport transcellulaire à travers une monocouche de cellules Caco-2 différenciées. En fait, comme nous l’avons montrée, l’internalisation de GLUT2 est induite par une voie de signalisation impliquant les protéines PI4K, PLC[gamma]-1, PKC[delta] et PKD1. Nous avons alors entrepris une série d’études pour déterminer quel était l’impact d’une délétion du gène P2rx7 sur le métabolisme du glucose dans un modèle de souris pour lequel l’expression de P2rx7 est invalidée (P2rx7-/-). Dans ce modèle, nous avons mesuré que les souris P2rx7-/- ont une masse significativement plus grande dès le sevrage. Des tests de tolérance au glucose sur des souris âgées de 3 semaines montrent une hyperglycémie qui se traduit par une concentration maximale de glucose sanguin plus élevé que le maximum de glycémie mesuré chez les souris normales. Cet état évolue à l’âge de 12 semaines avec une glycémie qui reste plus forte jusqu’à 90 min dans les souris P2rx7-/- par rapport aux souris contrôles. Nous avons également observé chez ces souris un taux d’insuline et de triglycérides significativement plus haut. La glycémie à jeun est aussi plus haute de façon significative à partir de 12 semaines. Cette différence de glycémie peut s’expliquer par une expression plus importante du transporteur GLUT2 à la surface apicale des cellules épithéliales dans le jéjunum des souris mutantes. Cette insertion systématique du transporteur semble favoriser une absorption rapide du glucose et le transport transcellulaire de celui-ci dans le sang. Enfin, l’augmentation de la glycémie a des conséquences sur le foie puisque les souris P2rx7-/- ont la voie de la lipogenèse active au sevrage et développent une stéatose hépatique avec accumulation croissante avec le temps de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules. L’ensemble des données suggère que le récepteur P2X7 joue un rôle majeur dans l’homéostasie du glucose.

Gata4 est un facteur de transcription exprimé par les entérocytes. Nos études ont démontré que Gata4 pouvait réguler l'expression de Pap1 chez le rat. Ce gène encode pour une protéine sécrétoire de type lectine impliquée dans le contrôle de la prolifération bactérienne. Puisqu'il a été démontré que des lectines antibactériennes de la famille Pap sont sécrétées dans la lumière intestinale en réponse à des stimuli inflammatoires, le but de cette étude était de définir l'implication transcriptionnelle de Gata4 dans la réponse inflammatoire des cellules épithéliales intestinales. Afin de caractériser l'effet de Gata4 sur la régulation transcriptionnelle de Pap1 dans les cellules Caco-2/15, nous avons utilisé des essais luciférase et généré différents mutants de la protéine Gata4 et du promoteur Pap1 . Nous avons également utilisé des immunobuvardages et des analyses de gel de rétention afin de mesurer la quantité et l'affinité de Gata4 pour l'ADN dans les cellules IEC-6/Cdx2. Les essais luciférase ont démontré que Gata4, en combinaison avec Cdx2, amène un effet synergique important sur l'activité du promoteur de Pap1 de l'ordre d'environ 8 fois. Différents mutants de la protéine Gata4 ont montré une abolition du potentiel transcriptionnel, démontrant que l'effet observé est spécifique. Cependant, la cotransfection d'un mutant du domaine en doigt de zinc (Zn) localisé en N-terminal, en combinaison avec Cdx2, augmente radicalement l'activation du promoteur de 18 fois. Des résultats préliminaires ont également démontré que la surexpression de ce mutant dans les cellules IEC-6/Cdx2 augmente fortement l'expression endogène du gène Pap1 . Cet effet pourrait être médié par des interactions avec les cofacteurs Fog. En effet, la cotransfection de Fog1 réprime l'effet synergique observé avec Gata4 de type sauvage mais non avec le mutant du domaine en doigt de Zn en N-terminal. Les mutants générés du promoteur Pap1 ont permis d'identifier le site Cdx2 et le site Gata le plus proximal du site d'initiation de la transcription comme nécessaire à l'effet transcriptionnel de Gata4 et Cdx2. En utilisant comme modèle les cellules IEC-6/Cdx2, nous avons montré qu'une induction avec des LPS n'a pas d'effet significatif sur la quantité totale de la protéine Gata4 mais des résultats préliminaires montrent une modulation de la phosphorylation de Gata4 sur la sérine 105. Par gel de rétention, nous avons montré que GATA4 a une affinité pour plusieurs sites sur le promoteur du gène Pap1 et qu'elle est augmentée en condition de stress cellulaire induit par les LPS. Cette étude nous permet de mieux comprendre l'implication de Gata4 dans la réponse inflammatoire de la cellule épithéliale intestinale.

L'épithélium de l'intestin grêle est en constant renouvellement.L'équilibre entre la prolifération et la différenciation cellulaire y est finement régulé par de nombreuses interactions entre l'épithélium et son environnement. Les interactions épithéliomésenchymateuses engendrent une signalisation qui affecte l'expression génique essentielle au développement et au maintien d'une muqueuse fonctionnelle. Plusieurs facteurs de transcription endodermiques ont été identifiés comme régulateurs de l'épithélium intestinal. Cdx2 en est un exemple, son expression dans les cellules épithéliales intestinales indifférenciées est suffisante à l'induction de leur différenciation en culture. Manuscrit 1: Afin de mieux comprendre les voies moléculaires impliquées dans la différenciation de l'épithélium intestinal, les gènes dont l'expression est modulée suite à l'induction de Cdx2 dans les cellules épithéliales intestinales ont été analysés. La cathepsine L est induite avec la polarisation et la différenciation des cellules épithéliales intestinales et l'inhibition de son activité interfère avec ces processus. De plus, la perte de l'activité de cette protéase conduit à une augmentation de la multiplicité tumorale dans l'intestin des souris APC[indice supérieur Min]. Ces résultats montrent une fonction intracellulaire non suspectée pour la cathepsine L dans l'épithélium intestinal au cours de la polarisation et de l'initiation tumorale. Manuscrit 2 : Pour identifier de nouveaux régulateurs de la différenciation épithéliale intestinale, un modèle de co-culture cellulaire permettant de récapituler la différenciation de cet épithélium a été établi et caractérisé génétiquement. Hnf-4[alpha] et Hnf-1[alpha] sont fortement induits au cours de cette différenciation.L'expression forcée de Hnf-4[alpha] dans les cellules indifférenciées entraîne l'activation de Hnf-1[alpha] et de plusieurs marqueurs des fonctions digestives, ainsi que l'établissement d'une barrière fonctionnelle en co-culture. Ces observations suggèrent que Hnf-4[alpha] est un joueur important dans la régulation de la différenciation des cellules épithéliales intestinales. Manuscrit 3 : Afin de démontrer les fonctions de Hnf-1[alpha] dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal in vivo, le phénotype intestinal des souris invalidées pour Hnf-1[alpha] a été analysé. Ces souris présentent une intestinalomégalie caractérisée par une augmentation de la prolifération cellulaire et cryptale. Ces phénomènes étant associés à une augmentation de l'activité de mTOR. De plus, les souris invalidées pour Hnf-1[alpha] présentent une modulation de l'expression de plusieurs marqueurs de cellules entéroendocrines. Ces observations suggèrent un rôle insoupçonné pour Hnf-1[alpha] dans le maintien de la croissance et le devenir des cellules entéroendocrines de l'intestin grêle. Section 4 : Afin de confirmer la collaboration entre les facteurs Hnf-4[alpha] et Hnf-1[alpha] dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal in vivo, des souris invalidées pour Hnf-1[alpha] de façon classique et pour Hnf-4[alpha] uniquement dans l'épithélium intestinal (doublement invalidées), au cours du développement embryonnaire (villine-Cre) ainsi que chez l'adulte (CYP1A1-Cre), ont été produites. Les souris doublement invalidées au cours du développement meurent dans les premières 36 heures suivant leur naissance et les souris doublement invalidées à l'âge adulte meurent au cours du traitement qui permet l'invalidation de Hnf-4[alpha]. Ces résultats indiquent que la double invalidation de Hnf-1[alpha] et de Hnf-4[alpha] au niveau de la muqueuse de l'intestin grêle est incompatible avec la survie des souris.

Les facteurs de transcription E2F sont impliqués dans différents processus physiologiques comme l'apoptose, la sénescence et la progression dans le cycle cellulaire par exemple. Des travaux antérieurs dans le laboratoire ont démontré que la localisation de E2F4 est dépendante du cycle cellulaire. Dans les cellules prolifératives de la crypte intestinale, E2F4 se localise au noyau alors que dans les cellules quiescentes ou différenciées, E2F4 est cytoplasmique. La localisation cellulaire de E2F4 est un élément important pour le contrôle de son activité transcriptionnelle. Nous avons analysé l'effet de l'expression nucléaire et constitutive de E2F4 dans un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines normales (HIEC) pour en mesurer l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Nous démontrons pour la première fois que E2F4 module l'expression de gènes associés à la régulation de la voie intrinsèque et extrinsèque de l'apoptose, un rôle qui lui était inconnu jusqu'à présent. Par interférence d'ARN, nous avons diminué les niveaux d'expression de p53, un gène au coeur de la régulation de l'apoptose. Nous avons observé que la mort cellulaire est significativement retardée. De plus, nous avons démontré que l'inhibition de l'activité des caspases ne prévient pas non plus la mort cellulaire. L'implication de mécanismes de mort cellulaire alternatifs p53 indépendants a été investiguée. Nos résultats démontrent que l'inhibition de l'activité des calpaïnes/cathepsines, de RIP, de la voie JNK, même en combinaison avec une réduction des niveaux de p53, ne font que retarder la mort cellulaire mais ne l'empêche jamais. Nos résultats indiquent que plusieurs mécanismes de mort cellulaire classiques (voies intrinsèque et extrinsèque) et alternatifs (ROS, autophagie, AIF) sont probablement activés par la surexpression nucléaire de E2F4 dans les cellules épithéliales intestinales. Nous avons aussi évalué l'importance de E2F4 dans le contrôle de la prolifération des cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses. Nous avons observé un ralentissement important de la prolifération et une cinétique d'entrée en phase S ralentie pour les populations HIEC qui expriment des niveaux réduits de E2F4. Ce ralentissement est probablement attribuable à la modulation des niveaux d'expression autant en ARNm et en protéines de nombreux gènes régulateurs de la transition G1/S tels que c-myc, cdk2, les cyclines A et D ainsi que p21 et p27 notamment. L'impact majeur de E2F4 sur le contrôle de la transition Gl/S n'avait jamais encore été décrit dans la littérature. De plus, dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales, E2F4 est surexprimé et se localise préférentiellement dans le noyau. Cette observation est confirmée par l'utilisation d'une banque de tissus où nous avons constaté que dans 24 spécimens sur 30, E2F4 est surexprimé dans la tumeur par rapport au tissu normal et que E2F4 est surtout nucléaire Finalement, nous avons aussi diminué les niveaux d'expression de E2F4 par interférence à l'ARN dans les lignées cellulaires Caco-2/15 et HCT-116 pour en analyser l'impact sur la prolifération et la survie cellulaire. Dans les deux lignées, la réduction de l'expression de E2F4 induit un ralentissement de la prolifération significatif et elle réduit leur capacité à former des colonies en agar mou. Par ailleurs, la réduction des niveaux d'expression de E2F4 entraîne une entrée accélérée en sénescence cellulaire dans les cellules HIEC et induit l'apparition de caractéristiques liées à la sénescence dans la lignée cellulaire Caco-2/15 révélant ainsi un rôle insoupçonné de E2F4 dans le contrôle de la sénescence cellulaire. Pris ensemble, mes résultats démontrent que E2F4 est un acteur majeur du contrôle du cycle cellulaire, de la survie et de la sénescence cellulaire dans les cellules épithéliales intestinales humaines normales et cancéreuses.