Le facteur de transcription GATA4 est essentiel au développement et à la fonction des tissus dérivant du mésoderme et de l’endoderme, incluant les gonades. Le gène GATA4 est exprimé sous différents transcrits qui se distinguent par la séquence de leur premier exon non codant. Deux de ces transcrits sont majoritairement exprimés et sont conservés à travers les espèces : le transcrit GATA4 E1a (généré par un promoteur proximal 1a) et le transcrit GATA4 E1b (produit par le promoteur distal 1b). Des études effectuées chez des modèles de souris ont démontré qu’une séquence de 5 kb en amont du promoteur 1a du gène Gata4 est suffisante pour récapituler l’expression endogène du gène seulement dans une sous-population de cellules ayant le facteur GATA4, incluant les cellules de Sertoli dans les gonades mâles. Nous avons donc émis l’hypothèse que le promoteur 1b, tout comme le promoteur 1a, contribue au profil d’expression cellules- et tissus-spécifique de Gata4. Afin d’étudier les mécanismes qui contrôlent l’activité du promoteur alternatif 1b du gène Gata4 in vivo, nous avons généré une souris transgénique exprimant la protéine GFP sous le contrôle d’une séquence de 2 kb en amont de l’exon 1b. L’expression du transgène a été analysée dans plusieurs tissus et à différents stades de développement en détectant la protéine GFP par épifluorescence, immunohistochimie et Western Blot. Les résultats ont démontré qu’une séquence de 2 kb n’est pas suffisante pour induire l’expression du transgène chez la souris et suggèrent que des éléments de régulation supplémentaires sont nécessaires pour permettre l’expression endogène du gène Gata4 via son promoteur alternatif 1b. Afin d’identifier ces éléments, divers outils bio-informatiques couplés à des analyses in vitro ont été utilisés. Mes travaux de maîtrise mettent en évidence huit nouveaux enhancers potentiellement impliqués dans la régulation de l’activité du promoteur 1b de Gata4. Les résultats de cette étude permettent une meilleure compréhension des mécanismes transcriptionnels de l’activité du promoteur 1b de Gata4 dans différents types cellulaires et à différents stades du développement. / The GATA4 transcription factor is essential for the development and function of multiple tissues derived from both mesoderm and endoderm, such as the gonads. The GATA4 gene is expressed as multiple transcripts that differ in their first untranslated exon sequence. Two of them are predominantly expressed and are conserved among species: transcripts GATA4 E1a (generated by the proximal 1a promoter) and GATA4 E1b (via its distal 1b promoter). Previous studies using transgenic mice demonstrated that a 5 kb sequence upstream of 1a promoter is sufficient to recapitulate endogenous Gata4 expression only in a subset of cells normally containing GATA4, including Sertoli cells in the male gonad. We therefore hypothesized that 1b promoter, like 1a promoter, contributes to cell- and tissue-specific Gata4 expression. To gain insight into the mechanisms that control the activity of the Gata4 1b promoter in vivo, we generated transgenic mice expressing a GFP reporter under the control of 2 kb of sequences upstream of the distal promoter. Transgene expression was assessed in several tissues and at many developmental stages by detecting GFP protein by epifluorescence, immunohistochemistry and Western Blot. The results showed that 2 kb of upstream sequences of Gata4 1b promoter are not sufficient to direct transgene expression in the mouse and suggest that other elements are required for endogenous transcription of the gene from its distal 1b promoter. To identify these elements, several bioinformatic analyses coupled with in vitro assays were performed. My work highlights eight new enhancers potentially involved in Gata4 1b promoter activity. The results from this thesis will help to provide a better understanding of the mechanisms involved in the transcriptional regulation of the GATA4 gene in different cell types and at different developmental stages.

GATA4 est un facteur de transcription essentiel pour le développement et la fonction de plusieurs tissus, incluant les gonades. GATA4 est exprimé sous forme de deux transcrits majeurs présentant des premiers exons distincts non codants, soient l’exon 1a et l’exon 1b. J’ai proposé que l’utilisation de différents promoteurs soit un mécanisme important dans la régulation spatiotemporelle de l’expression de GATA4. Des expériences d’hybridation in situ ont révélé que les transcrits Gata4 1a et 1b sont bien présents au niveau des cellules somatiques du testicule et de l’ovaire au cours du développement. Les résultats in vitro nous ont suggéré que le promoteur 1b est régulé positivement par GATA4. Toutefois, les résultats in vivo ont révélé que le promoteur Gata4 1b est assujetti à une autorégulation négative. Les expériences de co-transfection ont démontré que GATA4 régule sa propre expression en réprimant l’activité transcriptionnelle du promoteur Gata4 1b en interagissant avec FOG2.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 novembre 2023) / Les facteurs de transcription GATA se lient aux motifs GATA qui sont des séquences nucléotidiques présentes dans tout le génome. Ils sont des régulateurs essentiels pour l'expression des gènes spécifiques aux cellules et à leur développement. Une dérégulation de la fonction des GATA a été associée à plusieurs maladies chez l'homme et la femme. Dans les gonades, les facteurs GATA se retrouvent exclusivement dans les cellules somatiques (granulosa, thèque, Sertoli et Leydig). Des études de perte de fonction dans les souris ont démontré que les facteurs GATA sont essentiels pour la détermination sexuelle et la fertilité. Des études d'invalidation de gènes ont aussi identifié plusieurs gènes cibles potentiels des facteurs GATA ; ils activent le promoteur de ces gènes en contexte in vitro dans des cellules. Toutefois, ces gènes n'ont pas encore été validés comme cibles directes des facteurs GATA en contexte in vivo. Dans le cadre de mon projet de maîtrise, j'ai caractérisé deux lignées de souris ayant une inactivation des motifs de liaison GATA soit dans le promoteur endogène du gène Star ou dans le promoteur PII du gène Cyp19a1. Le gène Star code pour la protéine STAR qui est nécessaire au transport du cholestérol dans les mitochondries des cellules stéroïdogéniques (gonades et glandes surrénales). Le gène Cyp19a1 code pour l'enzyme P450 aromatase qui est essentielle pour la production des œstrogènes. Les souris mutantes des deux lignées expriment des niveaux significativement plus bas de leur gène d'intérêt par rapport aux souris de type sauvage. Les résultats obtenus lors de la caractérisation des deux lignées m'ont permis de valider les gènes Star et Cyp19a1 comme cibles directes des facteurs GATA et de souligner une fois de plus l'importance de ces derniers pour la fertilité. / GATA transcription factors bind to nucleotide sequences called GATA motifs present throughout the genome. GATA factors are critical regulators of developmental and cell-specific gene expression. Dysregulated GATA function has been linked to several human diseases including some that affect men's and women's reproductive health. In the gonads, GATA factors are exclusive to somatic cells (granulosa, theca, Sertoli, Leydig). Loss-of-function studies in mice have shown GATA factors to be critical for sex determination and fertility. Knockout studies have also identified many genes that are likely targeted by GATA factors; the promoter sequences of some of these genes can be activated by GATA factors in cell-based assays. Whether these genes are direct targets for GATA action in vivo, however, has yet to be fully demonstrated. In the context of my master's degree, I have characterized two new mouse models where the GATA motifs in the proximal promoter of the Star gene or PII promoter of the P450 aromatase (Cyp19a1) gene were inactivated. The Star gene codes for the STAR protein which participates in cholesterol transport into the mitochondria of steroidogenic cells. The Cyp19a1 gene codes for aromatase, an enzyme required for estrogen production. I observed a dramatic decrease in the gene of interest (Star or Cyp19a1) in all mutant mice in comparison to wild type mice. The characterization of these two mouse models allowed me to validate the Star and Cyp19a1 genes as direct targets for GATA action and to emphasize, once again, the importance of these transcription factors for fertility.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité de lutte biologique contre le blanc. Par génie génétique, une molécule à activité antifongique, la flocculosine, a été isolée et caractérisée. Suite à ces travaux, l'utilisation des champignons du genre Pseudozyma pour la production de protéines recombinantes a présenté un nouvel axe de recherche. Toutefois, la variété des outils moléculaires disponibles pour l'étude des Pseudozyma spp. est limitée aux séquences régulatrices (promoteur, terminateur) du gène HSP70 d'un champignon voisin, Ustilago maydis. Les objectifs de notre recherche étaient donc les suivants : 1) obtenir des séquences promotrices de P. flocculosa; 2) comparer l'activité de ces séquences promotrices avec le promoteur HSP70; et 3) démontrer l'utilité de ces outils moléculaires dans le contexte d'une nouvelle approche d'étude de l'écologie de P. flocculosa. Dans un premier temps, un promoteur spécifique a été ciblé, soit le promoteur du gène d'actine car celui-ci est reconnu comme étant fort et constitutif chez d'autres champignons. En parallèle, un promoteur dont les transcrits étaient parmi les plus abondants dans des conditions de cultures déterminées a été identifié et cloné. Le gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GPD), une enzyme importante du métabolisme carboné de la cellule, a donc pu être cloné et séquencé. Nous avons ainsi obtenu 1133 pb de la séquence promotrice du gène d'actine et 1139 pb du gène GPD de P. flocculosa. Dans un deuxième temps, la comparaison de la force de ces deux promoteurs avec celle du promoteur HSP70 a permis d'établir que les promoteurs d'actine et de GPD présentaient une activité forte chez P. flocculosa et comparable à celle de HSP70 chez P. antarctica. Enfin, le développement d'une souche de P. flocculosa (Act4) exprimant de façon constitutive la GFP a permis son observation in situ pendant l'interaction tritrophique plante-agent pathogène-agent de lutte biologique. Il a ainsi été possible de montrer que P. flocculosa ne présentait pas de croissance remarquable en absence du blanc sur la feuille et ce, quelle que soit la plante-hôte utilisée. Néanmoins, en présence des structures du champignon pathogène, le développement de la souche Act4 était clairement stimulé.