Les mécanismes assurant l’homéostasie du compartiment lymphocytaire T périphériqueveillent à préserver à la fois le nombre, la diversité et la qualité des cellules T qui le composent. Cesmécanismes sont fortement sollicités chez un receveur d’allogreffe de cellules soucheshématopoïétiques puisqu’une déplétion initiale plus ou moins intense de son compartimentlymphocytaire périphérique est induite par le conditionnement pré-greffe. Le retour àl’homéostasie s’effectue grâce à la prolifération homéostatique des lymphocytes du donneurapportés par le greffon non manipulé, avant la reconstitution beaucoup plus tardive d’uncompartiment lymphocytaire T naïf opérationnel, en fonction des capacités de thymopoïèse dureceveur. L’IL-7 et l’IL-15, qui jouent un rôle majeur dans la survie des cellules T naïves et/oumémoires, participent étroitement à l’expansion des cellules T induite par la lymphopénie etméritent à ce titre le qualificatif de cytokines homéostatiques.Des protocoles de conditionnement d’intensité variable exposent à un risque équivalent demaladie du greffon contre l’hôte, sinon de rechute, en dépit de l’induction d’un degré variabled’inflammation. Ceci suggère que l’expansion homéostatique périphérique des lymphocytes T dudonneur est un facteur déterminant de l’évolution bénéfique ou défavorable de l’allogreffe.Une étude prospective de 107 patients répartis en deux cohortes, l’une aprèsconditionnement myéloablatif, l’autre après divers protocoles de conditionnement d’intensitéréduite nous a permis de comparer l’impact du degré de lymphopénie et d’inflammation sur lestaux systémiques d’IL-7 et d’IL-15, l’expression de leurs récepteurs par les lymphocytes Tcirculants et l’évolution clinique.Nous confirmons une évolution en miroir des taux plasmatiques d’IL-7 et de lalymphocytose et nous montrons que la cinétique des taux d’IL-7 post-allogreffe est semblablequelque soit l’intensité des protocoles de conditionnements utilisés. En revanche, si les taux d’IL-15présentent une cinétique en miroir similaire à celle de l’IL-7, la valeur au pic et l’aire sous la courbed’IL-15 diffèrent nettement selon le type de conditionnement, mais sont fortement corrélésà la CRP plasmatique.L’incidence des maladies aiguës du greffon contre l’hôte de grade 2 à 4 est similaire dansnos deux cohortes, mais le délai de survenue est plus tardif après un conditionnement réduit. Aprèsanalyse multivariée, notre étude permet de conclure à l’intérêt prospectif de la déterminationprécoce des taux plasmatiques d’IL-7 : dans les conditionnements myéloablatifs, un taux d’IL-7supérieur à 11,9 pg/mL à J+14 est prédictif, tandis que dans les conditionnements réduits, c’est untaux supérieur à 5,9 pg/mL à J+30 qui s’avère prédictif. Dans notre cohorte de patients sousconditionnement myéloablatif, de faibles taux d’IL-15 à J+14 sont associés en analyse univariée etmultivariée à la survenue ultérieure d’une rechute de l’hémopathie maligne. Une relation similairemais plus tardive (J+90) est retrouvée chez les receveurs d’un conditionnement réduit.Outre l’intérêt prospectif pour les patients de la détermination précoce des tauxplasmatiques d’IL-7 et d’IL-15, cette étude comparative a permis de cerner d’une part le rôleessentiel de la lymphopénie dans l’accumulation d’une concentration critique d’IL-7 nécessairepour piloter l’expansion homéostatique des cellules T matures et, d’autre part l’impact du contexteinflammatoire sur l’augmentation de la concentration plasmatique d’IL-15. Celle-ci, par son actiondirecte sur les l’expansion des cellules T CD8+ mémoires et ses effets contributifs à l’expansionhoméostatique des cellules T naïves, apparaît renforcer l’action de l’IL-7 en potentialisant son rôledans l’alloréactivité, bénéfique en terme de protection vis-à-vis de la rechute mais délétère enterme de réaction de greffon contre hôte. / My PhD was realised in the research team EA2686 at the Pole of Immunology in the Center of Biology Pathology of Lille under the direction of Doctor Myriam Labalette and in collaboration with Professor Ibrahim Yakoub-Agha from the department of Blood Diseases in the Hospital of Lille. The central line of the my work concern the implication of the different subpopulations of naive and memory T cells in the immune reconstitution and the main events post allograft of hematopoietic stem cells (HSC). 1)Study of factors controlling the homeostatic proliferation of T cells after allograft : By a prospective study, our team showed that the dynamic of reconstitution of subpopulations of naive and memory T cells during the immune reconstitution after allograft of HSC affects the occurrence of late events (Yakoub-Agha, 2009). The homeostatic proliferation of donor T cell provided by the graft and possibly also by the few residual recipient T cells is involved in the initial reconstitution of the lymphocyte compartment. Two main homeostatic cytokines are involved in this way of expansion of T cells after allograft, IL-7 and IL-15. We determined the precocious plasmatic level of these cytokines and the degree of expression of their receptor, IL-7Ralpha chain (CD127) and IL-15Rbeta chain (CD122) on the subpopulations of naive and memory T cells during the immune reconstitution post allograft. a) In 40 recipients of HSC with a myeloablative conditioning, our prospective study showed variations of IL-7 and IL-15 level during the first weeks post-graft. The plasmatic levels increased strongly to peak at day+14. Then, the concentrations return to a normal range around day+30. The increase of IL-7 and IL-15 levels observed during the first days post-graft could be due to an increase of production in response to the lymphopenia. However, at day+14 post-graft, we notice real important variations of IL-7 and IL-15 level among patients (range 3.8–30.2 and 14.3–66 pg/ml, respectively). A high level of IL-7 (&#8805;11,9 pg/mL) at day+14 post-graft, when recipients are strongly lymphopenic, is a predictive factor of a risk of occurrence of acute GVHD (HR= 3.63 ; P= .014) compared to others factors known to favour independently this complication (reinfection to CMV, sex-mismatch). The relapse of disease is significantly associated to low level of IL-15 at day+14 (<33.3 pg/mL) (HR= 0.93; P= .035) (Thiant, 2010). b) In a prospective group of 45 recipients of HSC with a reduced conditioning inducing a lower degree of lymphopenia, the occurrence of acute GVHD is significantly associated to the plasmatic level of IL-7 and IL-15 at day+30 post-graft. This later lag is explained by the modalities of conditioning inducing a lower lymphopenia and the later occurrence of acute GVHD (median time= 42 days) compared to recipients with myeloablative conditioning (median time= 30 days). We also showed that levels of cytokines a month after the graft, affect the degree of expression of receptors, IL-7R&#945; and IL-15R&#946; (Thiant, 2010). c) The increase of IL-7 could, in some conditions, suggest a failure of the receptivity by the IL-7Ralpha chain. We established a project of collaboration with the Professor Klaus Müller’s team from the Hospital of Copenhagen, which highlighted the presence of polymorphisms located on the nucleotidic sequence encoding the IL-7R alpha chain in recipients of bone marrow (Shamim, 2006). The polymorphism +510 is correlated to the level of IL-7 and represents a factor of risk of occurrence of acute GVHD (P=.049). We know that this polymorphism induces a modification of amino acid in the sequence but the consequences on the functionality of the receptor of IL-7 are not known yet. [...]

Les leucémies aigües myéloïdes (LAM) sont caractérisées par l'accumulation de blastes leucémiques pour lesquels les programmes de différenciation sont dérégulés. Les mutations des isocitrate déshydrogénases (IDH), présentes chez 15% des patients atteints de LAM à risque cytogénétique intermédiaire, participent à cette dérégulation en induisant la production de R-2-Hydroxyglutarate (R-2-HG), responsable d'une hyperméthylation globale de l'ADN. Nous avons identifié une signature génique spécifique de la mutation IDH1 R132H, caractérisée par une dérégulation des facteurs de transcription clés impliqués dans la différenciation granulocytaire, mais également par la dérégulation de gènes répondeurs à la différenciation induite par l'ATRA. Nous avons montré que la mutation IDH1 R132H sensibilise les lignées cellulaires et blastes d'échantillons primaires de patients à la différenciation induite par l'ATRA, à la fois in vitro et in vivo à des concentrations cliniquement relevantes. De plus, le traitement par une forme perméante du R-2-HG sensibilise la forme IDH1 WT à la différenciation induite par l'ATRA, alors que l'inhibition de la production du R-2-HG réduit de façon significative les effets de l'ATRA dans la lignée HL60 IDH1 R132H. L'ATRA permet de diminuer la viabilité cellulaire et augmenter l'apoptose spécifiquement en présence de la mutation IDH1 R132H, et conduit à une réduction drastique de la formation de colonies en milieu semi-solide. Il réduit également la prise tumorale de la lignée MOLM14 IDH1 R132H xénogreffées dans des souris NOD-Scid-IL2rynull et augmente de façon très significative la survie globale des souris, révélant l'effet potentiellement anti-leucémique de l'ATRA spécifiquement en présence de la mutation IDH1 R132H. Nous avons également mis en évidence un effet synergique entre l'ATRA et le dasatinib, spécifiquement en présence de la mutation IDH1 R132H, à la fois in vitro et in vivo. Pour finir, nous avons montré que la mutation IDH1 R132H réduit la survie de souris xénogreffées par rapport à la forme sauvage, ainsi que la sensibilité in vitro aux chimiothérapies classiquement utilisées pour le traitement des LAM (AraC et Idarubicine). Malgré tout, l'ajout d'ATRA permet d'augmenter l'efficacité des chimiothérapies, spécifiquement en présence de la mutation IDH1 R132H. Pour conclure, cette étude donne un rationnel pour tester ces combinaisons au cours de futurs essais cliniques dans ce sous-groupe de patients. / Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by accumulation of malignant blasts with impaired differentiation programs due to recurrent mutations such as isocitrate dehydrogenase (IDH) mutations found in 15% of AML patients. These mutations result in the production of (R)-2-hydroxyglutarate (2-HG), leading to a hypermethylation phenotype that impairs hematopoietic differentiation. Here we identified mutant IDH1-specific gene signatures regulated by key transcription factors involved in myeloid differentiation and responsive to retinoids. Accordingly, we showed that the presence of the IDH1 mutation sensitized AML cell lines and primary patient samples to all-trans retinoic acid (ATRA)-induced differentiation both in vitro and in vivo using clinically achievable doses. Moreover, treatment with a cell-permeable form of 2-HG sensitized wild-type IDH1 AML cells to ATRA-induced myeloid differentiation, while inhibition of 2-HG production significantly diminished ATRA effects in mutant IDH1 cells. ATRA treatment specifically decreased cell viability and induced apoptosis of mutant IDH1 blasts in vitro. ATRA also reduced tumor burden of mutant IDH1 AML cells xenografted in NOD-Scid-IL2rynull mice and highly increased mice overall survival, revealing a potent anti-leukemic effect of ATRA in the presence of IDH1 mutation. Moreover, we showed a synergistic effect between ATRA and dasatinib specifically in the presence of IDH1 R132H mutation, both in vitro and in vivo. Finally, we demonstrated that IDH1 R132H reduces survival of mice xenografted with mutant cell lines compared to the WT, and reduces sensitivity to chemotherapies (AraC and Idarubicine) in vitro. Nevertheless, the association of ATRA to chemotherapies increases their activity specifically in the presence of IDH1 R132H mutation. These therapeutic strategies hold promise for this AML patient subgroup in future clinical studies.

Les leucémies aigues sont la conséquence d’une prolifération clonale et maligne des cellules hématopoïétiques. Elles surviennent suite à un évènement oncogénique qui se produit dans une cellule souche hématopoïétique (CSH) ou progénitrice. Cela lui confère une certaine instabilité qui engendre l’accumulation d’autres évènements génétiques et/ou épigénétiques responsables du développement clinique de la maladie. Les leucémies MLL représentent environ 10% des leucémies aigues et aujourd’hui, plus de 70 gènes de fusion ont été caractérisés. Les sangs de cordon sont une source importante de CSH et progénitrices. La purification de ces cellules et leur transformation en cellules leucémiques à l’aide de gènes de fusion MLL nous permettent de générer des leucémies aigues humaines dans des souris immunodéficientes NSG et ainsi étudier le potentiel leucémique de différents gènes de fusion MLL. Dans un premier temps, 4 gènes de fusion MLL ont été étudiés : MLL-AF9, MLL-AF4, MLL-ENL et MLL-ELL. In vitro, nous sommes capables de transformer des CSH en cellules leucémiques capables de proliférer rapidement. Les résultats in vivo nous montrent qu’il est possible de générer des leucémies avec les oncogènes MLL-AF9 et MLL-ENL. Pour les fusions MLL-ELL et MLL-AF4, bien que quelques leucémies ont pu être obtenues, plusieurs problèmes techniques nous empêchent aujourd’hui de disposer d’un modèle adéquat permettant l’étude complète de ces oncogènes. Dans un second temps, les leucémies aigues MLL-AF9 ont été étudiées dans un modèle contrôlé où les cellules souches proviennent d’un donneur unique. Grâce à ce modèle, nous avons pu démontrer que l’oncogène MLL-AF9 est suffisant pour induire le développement de la maladie. En effet aucune nouvelle mutation n’a pu être identifiée au cours du développement de la leucémie. Parmi les leucémies myéloïdes aigues (LMA) MLL-AF9 issues de ce modèle, certains gènes non mutés, dont RET, ont été identifiés comme étant de potentiels biomarqueurs de ce sous-groupe de leucémie. / Acute leukemias result from a clonal and malignant proliferation of hematopoietic cells. They arise following an oncogenic event which occurs in a hematopoietic stem cell (HSC) or progenitor cell. This generates instability, causing the accumulation of other genetic and/or epigenetic events leading to the clinical development of the disease. MLL leukemias represent approximately 10 % of acute leukemias, and nowadays more than 70 fusion genes have been characterized. Cord blood is an important source of both HSCs and progenitor cells. Purification of these cells and subsequent transformation into leukemic cells allows us to induce human acute leukemia via MLL fusion genes into NSG immunodeficient mice and thus to study the leukemic potential of different MLL fusion genes. Firstly, four MLL fusion genes were studied: MLL-AF9, MLL-AF4, MLL-ENL and MLL-ELL. In vitro, we are able to transform HSC into leukemic cells which display rapid growth. The in vivo results showed that it is possible to induce leukemia by means of MLL-AF9 and MLL-ENL oncogenes. For the MLL- AF4 and MLL-ELL fusions, although some leukemias have been obtained, several technical difficulties prevented us from having an adequate model for the study of these oncogenes. Secondly, MLL-AF9 acute leukemias were studied in a model where stem cells originate from a single donor. Based on this model, we have determined that the single MLL-AF9 oncogene is sufficient to initiate disease. Indeed, no new mutations were identified during leukemia development. Among the different MLL-AF9 acute myeloid leukemias (AML) generated from this model, a certain number of non-mutated genes, notably the RET, have been identified as potential biomarkers for this specific subgroup of leukemia.

Les fusions de MLL peuvent générer trois types de leucémies aiguës (LLA-B, LMA et LLA-T). Les cellules souches/progénitrices de sang de cordon humain purifiées par une méthode de sélection négative ont été infectées par un rétrovirus contrôle exprimant la EGFP ou un rétrovirus exprimant un gène de fusion de MLL et la EGFP, avant d’être injectées dans le fémur de souris immunodéficientes. Après 20 semaines, les souris ont été sacrifiées et les organes hématopoïétiques ont été analysés par FACS. MLL-ENL a généré exclusivement des LLA-B, MLL-ELL des LLA-B et LMA, et MLL-AF9 des LLA-B et mixte. Il semble que certains partenaires peuvent jouer un rôle important dans le phénotype et que le microenvironnement murin peut favoriser le phénotype LLA-B. Cette étude peut aider à comprendre le rôle instructif des MLL-ENL, MLL-ELL et MLL-AF9 sur le phénotype leucémique et leur capacité à initier la transformation des cellules normales en cellules leucémiques. / MLL fusion genes may generate three different types of acute leukemia (B-ALL, AML and T-ALL). Purified human cord blood cells by negative selection technique (Lin-CB) and having CD34+ &gt; 70% were transduced by control retrovirus expressing the EGFP or other retrovirus expressing an MLL fusion gene and the EGFP, and then injected into the immune-deficient NSG mouse femur to test the leukemogenic potential. After 20 weeks, the mice were sacrificed and organs were analysed by FACS. MLL-ENL exclusively produced B-ALL, MLL-ELL B-ALL and AML, and MLL-AF9 B-ALL and mixed. It seems that some MLL partner genes may play an important role in phenotype, and the murine microenvironment of our in vivo model may promote the B-ALL phenotype. This study may help understand the instructive role of MLL-ENL, MLL-ELL and MLL-AF9 fusion genes in leukemic phenotype and their ability to induce the transformation of normal hematopoietic stem/progenitor cells into leukemic cells.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l'hémopathie maligne la plus commune chez les adultes dans les pays occidentaux. La LLC est caractérisée par une instabilité génomique qui se présente sous la forme de mutations somatiques récurrentes et d'anomalies chromosomiques. L'évolution clinique de la maladie, ainsi que la réponse au traitement basé sur la fludarabine, est très hétérogène. Bien que le traitement chimiothérapeutique de première ligne soit relativement efficace, la rechute est inévitable. Par conséquent, la LLC reste une maladie incurable. Les voies dites "3R", réplication, réparation et recombinaison de l'ADN, sont des processus essentiels pour maintenir l'intégrité du génome et prévenir l'apparition du cancer. A contrario, l'instabilité génétique peut entraîner la tumorigenèse et soutenir le développement de la chimiorésistance. Le but de mon projet de thèse a été d'étudier comment les 3R pouvaient contribuer à l'évolution de la LLC. L'analyse de l'expression génique à haut débit, a montré une signature 3R spécifique dans la LLC. De plus, en utilisant des données cliniques nous avons pu: 1. révéler l'anti-silencing function 1A histone chaperone (ASF1A) comme un marqueur pronostique pour le temps de début du premier traitement (time to first treatment (TTFT)) indépendamment des autres marqueurs cliniques connus, 2. montrer que le niveau d'expression de l'ADN polymérase nu (POLN) avant un traitement à base de fludarabine conditionne le temps sans progression (time to progression (TTP)) chez les patients après le traitement. Etant un analogue d'un nucléotide, la fludarabine agit, entre autres, comme un inhibiteur de la ribonucléotide réductase (RNR), une enzyme essentielle pour la régulation du pool cellulaire des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs). Or, une modification du pool des dNTPs imposée par la fludarabine provoque un stress réplicatif en perturbant la synthèse d'ADN. Nos données suggèrent que Pol nu (Pol ?) peut diminuer ce stress réplicatif en activant de nouvelles origines de réplication. Dans ce contexte, nous démontrons, donc, le rôle de Pol ? dans la chimiorésistance à la fludarabine. En conclusion, notre étude a démontré l'implication des facteurs 3R dans l'évolution de la LLC précédent le traitement ainsi que leur rôle mécanistique dans la résistance à la chimiothérapie à base de fludarabine. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common type of adult leukemia in the Western world, is a hematological malignancy characterized by genomic instability present in form of common somatic mutations and chromosomal abnormalities. The disease has a heterogeneous clinical course and despite relatively efficacious first-line chemoimmunotherapeutic treatment based on fludarabine, majority of CLL patients still relapses. CLL, therefore, remains an incurable disease. DNA transactions, including replication, repair of damaged DNA and recombination (the so-called "3Rs") are crucial processes required for preserving genome integrity and limiting cancer risk. Genome instability, on the other hand, is known to drive tumorigenesis and contribute to development of chemoresistance. The aim of my thesis project was to explore whether and how 3R could contribute to the evolution of CLL. In our high-throughput gene expression analysis we defined a specific 3R CLL signature and revealed anti-silencing function 1A histone chaperon (ASF1A) as an independent prognostic marker of time to first treatment (TTFT). Moreover, clinical data analysis showed that DNA polymerase nu (POLN) gene expression level could determine time to progression (TTP) in patients treated with fludarabine based therapeutic regime. Fludarabine is a nucleotide analog that acts, among other, as an inhibitor of ribonucleotide reductase (RNR), an enzyme responsible for regulating the cellular deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) pool. Perturbation of the dNTP pool caused by treatment with fludarabine induces replication stress by arresting DNA synthesis processes. Our data suggest that Pol nu (Pol ?) can counteract this type of replication stress by supporting the activation of new replication origins and, thereby, drive fludarabine chemoresistance. In conclusion, our study, on one hand, demonstrated the implication of 3R factors in the clinical course of CLL before the chemoimmmunotherapy treatment and, on the other hand, revealed their mechanistic role in resistance to fludarabine based therapy.

La protéine Tax du virus HTLV-1 a les propriétés d'un oncogène viral et joue un rôle important dans l'induction de la transformation cellulaire menant à l'ATL. L'activité oncogène de Tax résulte d'effets pléiotropes sur divers mécanismes cellulaires y compris l'activation de l'expression de gènes cellulaires spécifiques par la voie NF-B et la dérégulation de la progression du cycle cellulaire. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tax est une protéine hautement modifiée dans diverses lignées cellulaires y compris dans les lymphocytes T transformés par HTLV-1. L'ensemble des modifications post-traductionnelles de Tax forment une suite hiérarchisée qui contrôlent la localisation intracellulaire de Tax, sa capacité d'activer les kinases IKK et la voie de signalisation des facteurs NF-B et sa capacité d'induire un arrêt dans la progression de la mitose. En effet, la phosphorylation de Tax contrôle son ubiquitination et son passage dans le noyau où elle est sumoylée et acétylée. L’ubiquitination et la sumoylation de Tax agissent de manière concertée pour permettre l’activation de l’expression des gènes par la voie NF-B tandis que son acétylation permet de lever le blocage induit en fin de mitose. Les effets exercés par les modifications post-traductionnelles sur les fonctions oncogènes de la protéine Tax suggèrent que ces modifications pourraient être des cibles thérapeutiques pour le développement de traitements contre l'ATL.

L'objectif de ma thèse était de trouver de nouveaux oncogènes impliqués dans les leucémies de type T, en utilisant la méthode d'étiquetage rétroviral. Pour induire des leucémies de type T chez la souris, nous utilisons le rétrovirus RadLV qui induit la maladie en un temps de latence très court. La première étape de mon travail a consisté en la recherche de sites communs d'intégration (SCIs) de RadLV dans des thymomes de souris induits par ce rétrovirus. Nous avons trouvé un nouveau SCI que l'on a appelé Kis2, situé sur le chromosome X et impliqué dans 11 % des tumeurs analysées. Après avoir répertorié les gènes du locus, nous avons montré que les intégrations de RadLV au niveau du locus Kis2 provoquaient la surexpression de deux gènes. Le premier, situé très proche du SCl, correspond à un ARN non-codant que l'on a baptisé Kis2. Le deuxième, situé 300 kb en amont, correspond au gène Phf6, récemment impliqué dans un syndrome de retard mental. Nous avons donc mis en évidence que les intégrations rétrovirales pouvaient activer plusieurs gènes à la fois, et ce sur de longues distances. La deuxième étape de mon travail a consisté en la caractérisation du gène Kis2. Les intégrations rétrovirales provoquent la surexpression de cinq transcrits de ce gène, mettant en évidence un profil d'épissage complexe. Son caractère non-codant a rendu ce gène énigmatique, jusqu'à ce que l'on découvre en 3' du gène la présence du groupe de microARN (miARN) miR-106-363. Nous avons pu montrer qu'en définitive les ARN Kis2 correspondaient au pri-miARN de miR-106-363, qui se compose de six miARN (miR-106a, miR-18b, miR-20b, miR-19b, miR-92-2 et miR-363). La surexpression de ces pri-miARN dans les tumeurs de souris conduit à l'accumulation de miR-106a, miR-20b, miR-19b et miR92-2. Dans 46% des leucémies de type T humaines, le pri-miARN miR-106-363 est également surexprimé, conduisant à une surproduction de miR-19b et miR-92-2, et parfois de miR-106a. Nous montrons donc l'implication de miR-106-363 dans les leucémies humaines, et également l'existence d'une régulation post-transcriptionelle de ce groupe dont tous les miARN ne sont pas produits en même temps et dans les mêmes quantités. De façon intéressante, miR-106-363 est homologue au groupe miR-17-92, connu pour être impliqué entre autres dans des lymphomes de type B. Pour apprécier le potentiel oncogénique de miR-106-363, nous avons réalisé un test d'indépendance d'ancrage sur des cellules NIH3T3. Les résultats indiquent que miR-106a, miR-20b, miR-19b et miR-92-2 sont capables d'induire la formation de colonies. Nous avons par la suite procédé à l'identification de gènes cibles de ces miARN. Parmi une sélection de prédictions informatiques communes à miR-106a/20b, miR-19b et mir-92, nous avons choisi les gènes à caractère suppresseur de tumeur. Nous montrons que les gènes Mylip. Rbp1-like et possiblement Hipk3 sont ciblés par ces miARN, et que leur expression est inversement corrélée à celle de miR-106-363 dans les tumeurs de souris. Nos résultats constituent de nouveaux indices quant aux mécanismes oncogéniques relatifs à la surexpression de miR-106-363. Le dernier volet de ma thèse concerne l'identification de protéines interagissant avec les ARN Kis2. Ce travail était destiné à nous renseigner sur le rôle de ces ARN, alors que nous n'avions pas connaissance de miR-106-363. J'ai identifié par spectrométrie de masse trois protéines candidates: hnRNP A2/B1, hnRNP A3, KSRP, et possiblement PSF. Le rôle de ces protéines orienté vers la régulation de l'épissage m'a conduit à formuler l'hypothèse de l'implication de ces protéines dans la production des différents transcrits du gène Kis2. Finalement, ce profil d'épissage complexe pourrait être relié à l'expression différentielle des miARN de miR-106-363, et constituer un élément de régulation post-transcriptionelle de l'expression des miARN. Les interactions de ces protéines avec les ARN Kis2 restent toutefois à confirmer in vivo. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Leucémie, Étiquetage rétroviral, Oncogène, MicroARN.

Le rétrovirus Graffi induit des leucémies chez la souris et permet donc l'étude de phénomènes impliqués dans la leucémie ou plus généralement dans le cancer. Le but du présent projet a été de caractériser le rétrovirus murin Graffi et les leucémies induites afin d'apporter des éléments nouveaux aidant à la compréhension de la leucémie. La leucémie est une conséquence d'un dysfonctionnement de l'hématopoïèse. Les cellules leucémiques dérivent de progéniteurs hématopoïétiques qui ont subi des mutations et l'expression de plusieurs proto-oncogènes est dérégulée. Ainsi ces cellules anormales ne peuvent pas terminer le processus de différenciation, prolifèrent de façon anarchique, échappent à l'apoptose et envahissent l'organisme. Bien que ne formant pas de tumeurs solides, les cellules leucémiques ont beaucoup de caractéristiques en commun avec d'autres types de cellules cancéreuses. Le rétrovirus murin Graffi a été isolé en 1954 par Arnold Graffi, qui l'a caractérisé comme un rétrovirus induisant des leucémies myéloïdes. Son équipe et lui-même ont cependant été confrontés au phénomène qu'ils ont appelé 'diversification hématologique'. Récemment, 2 clones moléculaires ont été dérivés dans le laboratoire d'Eric Rassart à partir de l'extrait original du rétrovirus Graffi et qui correspondent à 2 génomes non défectifs, nommés GV-1.2 et GV-1.4. Les leucémies induites par ces 2 variants avaient été classifiées comme myéloïdes, ceci basé sur l'observation morphologique de frottis sanguins. Une nouvelle étude de caractérisation des leucémies induites par ces 2 variants dans 3 souches de souris a montré que le rétrovirus Graffi est capable d'induire des types de leucémies très variés: lymphoïdes (T et B) et non-lymphoïdes (myéloïdes, érythroïdes et mégacaryoblastiques). Beaucoup de ces leucémies sont très complexes (leucémies mixtes ou biphénotypiques). Les leucémies mégacaryoblastiques sont particulièrement intéressantes car ces leucémies humaines sont associées à un mauvais pronostic et sont peu étudiées. L'étude a également révélée que la région enhancer du virus joue un rôle clé dans la pathogenèse, ceci correspondant à un plus grand nombre de leucémies lymphoïdes (T) induit par GV-1.2 en comparaison avec GV-1.4. Une analyse phylogénétique détaillée a été effectuée grâce à l'obtention des séquences génomiques de GV-1.2 et GV-1.4. Cette étude a montré que le rétrovirus Graffi est très proche des virus SRS 19-6 et Moloney. L'étude phylogénique réalisée est très large, prenant en compte des membres de chaque classe de la famille des rétrovirus murins de la leucémies (écotropiques, amphotropiques, xénotropiques, polytropiques). Le rétrovirus Graffi, avec les virus SRS 19-6, Moloney, Rauscher et Friend sont plus proches des virus de type Casistas que des virus xénotropiques. En outre, l'analyse a également révélée que l'enveloppe de HEMV, un prototype d'un virus ancestral et celle de CasBrE sont proches d'un point de vue phylogénique. Finalement, afin d'utiliser les avantages du modèle 'Graffi', le profilage génique de chaque type de leucémies induites par ce rétrovirus a été effectuée grâce à la technologie des micropuces à haute densité (Affymetrix). De très nombreuses données sont issues de cette analyse et beaucoup de gènes non encore reliés à la leucémie ont été mis en évidence. Certains de ces gènes sont potentiellement des oncogènes et leurs fonctions méritent d'être analysées de façon plus approfondie. L'expression de certains gènes a été validée par RT-PCR. En conclusion, le rétrovirus Graffi représente un modèle complexe mais très intéressant pour étudier divers types de leucémies. L'expérience des micropuces a permis de faire ressortir des gènes dont il serait intéressant d'approfondir l'étude de la fonction. Globalement, l'utilisation des nombreuses données issues de l'analyse des micropuces permet une meilleure compréhension des cellules leucémiques et des lignées hématopoïétiques correspondantes. Le profilage génique des leucémies induites par le rétrovirus Graffi a permis d'ouvrir sur de nombreuses perspectives, certaines à caractères thérapeutiques. Ainsi, à plus long terme, cela pourrait permettre de fournir des éléments s'ajoutant aux outils de diagnostic, et d'identifier des gènes ou voies de signalisation pouvant être ciblés par des molécules inhibitrices. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus murin de la leucémie, Leucémie, Oncogène, Cancer, Hématopoïèse.

La translocation t(1;9)(q24 ;q34), qui engendre la protéine de fusion RCSD1-ABL1, a été identifiés dans des cas de LAL de mauvais pronostic. Les propriétés oncogéniques du partenaire RCSD1, sa structure et son rôle dans l’activité et la signalisation de RCSD1-ABL1 restent inconnus. Nous avons récemment rapporté le cas d’une LAL-B t(1;9)(q24 ;q34) montrant une résistance à un grand nombre d’ITK, mais une sensibilité inattendue au ponatinib, en l’absence de mutation d’ABL1 susceptible d’expliquer ces réponses.Dans le but de caractériser la protéine RCSD1-ABL1, de comprendre ces profils de réponse aux ITK et de rechercher un traitement optimal de ces leucémies, nous avons cloné le produit de fusion à partir des blastes leucémiques de la patiente. Les constructions obtenues ont été transfectées dans le modèle cellulaire BaF3, ce qui nous a permis : 1) de démontrer et 2) de disséquer pour la première fois l’oncogénicité et la signalisation de la protéine de fusion, au moins partiellement distincte de celle de BCR-ABL1 et notamment concernant l’activation de la voie JAK/STAT; 3) de purifier RCSD1-ABL1 et de révéler l’impact inattendu du bras N-terminal RCSD1 sur l’activité catalytique de l’enzyme et sa sensibilité aux ITK ; 4) d’intégrer ces données et de démontrer l’effet potentialisateur d’inhibiteurs de la voie JAK/STAT sur l’activité des ITK dans les cellules transduites par RCSD1-ABL1 mais pas celles exprimant BCR-ABL1. Enfin, le profilage chémo-génomique de prélèvements issus de 3 patients nous a permis de conforter nos résultats, et de proposer des bases précliniques de traitements personnalisés ciblant ces mécanismes. / The t(1;9)(q24;q34) translocation, generating the RCSD1-ABL1 fusion protein, is found in bad prognosis LAL cases. The oncogenic properties of RCSD1-ABL1 are unknown and the structure of the RCSD1 portion as well as its impact on RCSD1-ABL1 activity and signaling is yet to be determined. We recently reported the case of a patient with ALL associated with a RCSD1-ABL1 rearrangement that was resistant or poorly responsive to a large number of TKIs but was sensitive to Ponatinib, with no mutation that could explain this.In order to characterize this fusion protein, understand its response profile to TKI and optimize therapeutic approaches for these patients, we cloned the RCSD1-ABL1 gene from the patient sample and expressed it in the cellular model BaF3. This allowed us to 1) Demonstrate and 2) Study for the first time the oncogenic properties and signaling of the fusion protein, which is partially distinct from that of BCR-ABL1, especially regarding the JAK/STAT pathway; 3) Purify RCSD1-ABL1 and reveal the impact of the RCSD1 N-terminal portion on the enzyme activity and its TKI sensitivity; 4) Integrate this data and demonstrate the potentiating effect of JAT/STAT pathway inhibitors on TIK activity in cells expressing RCSD1-ABL1 but not in cells expressing BCR-ABL1.Finally, the chemo-genomic profiling of samples from three B-ALL t(1;9)(q24 ;q34) allowed us to consolidate our results and to propose preclinical bases for personalized treatments targeting the identified mechanisms.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.