Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met samenvatting in het Nederlands.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 février 2006). Bibliogr.

La régulation transcriptionnelle des gènes constitue une étape clef de la biologie cellulaire. Parmi les mécanismes impliqués dans la répression génique, les modifications épigénétiques jouent un rôle fondamental. Deux machineries épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines du groupe Polycomb, établissent des profils moléculaires qui permettent de distinguer les formes active et inactive de la chromatine. L’établissement et la maintenance de la répression épigénétique des gènes interviennent dans de nombreux processus liés au développement tant biologiques (inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles, empreinte génomique ou encore l’expression de gènes tissus-spécifiques) que pathologiques (cancers). Au cours de notre thèse de doctorat, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN est ciblée en des régions génomiques précises et participe à la répression de l’expression des gènes. La méthylation de l’ADN est catalysée par des enzymes, appelées méthyltransférases de l’ADN (DNMTs), qui transfèrent des résidus méthyls sur les cytosines. Cette modification chimique covalente constitue un niveau de contrôle transcriptionnel important : il existe une corrélation entre méthylation de l’ADN et répression de l’expression génique au niveau de sites génomiques spécifiques. En outre, il semble de plus en plus clair qu’une méthylation aberrante de l’ADN participe au processus de cancérogenèse. A l’heure actuelle, les mécanismes moléculaires par lesquels la méthylation contribue au développement, à la différenciation et à la répression génique restent peu connus. Les données de la littérature suggèrent l’existence d’un lien étroit entre la méthylation de l’ADN et la structure de la chromatine. Celle-ci est notamment régulée par des modifications post-traductionnelles des histones. Il apparaît de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN et les modifications des histones prennent part à une «boucle de répression» assurant le maintien et la propagation d’états épigénétiques répressifs. L’étude des mécanismes de la répression médiée par les DNMTs s’avère donc étroitement liée à celle de la structure de la chromatine. Dans ce contexte, notre travail de thèse est basé sur l’hypothèse selon laquelle les deux principaux systèmes épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines Polycomb, agiraient de concert. Les protéines Polycomb participent au système de mémoire cellulaire, régulent l’expression et la différenciation, agissent sous forme de complexes multimériques associés à la chromatine et interviennent dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Au cours de notre travail, nous nous sommes particulièrement intéressé à la protéine Polycomb EZH2 (Enhancer of Zeste) parce qu’elle possède une activité méthyltransférase d’histone sur les 27 de l’histone H3, impliquée dans la répression transcriptionnelle. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un lien mécanistique entre les deux machineries épigénétiques principales, méthylation de l’ADN et protéines du groupe Polycomb. Nous avons montré qu’EZH2 interagit in vivo avec les DNMTs et purifie une activité méthyltransférase de l’ADN in vitro. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que les DNMTs fixent les régions promotrices de gènes cibles de EZH2 et que cette liaison est dépendante de la présence d’EZH2. Par ailleurs, l’analyse des promoteurs cibles d’EZH2 par séquençage au bisulfite suggère qu’EZH2 semble également requise pour la méthylation de l’ADN de ces séquences. Nos résultats permettent l’ébauche d’un modèle où EZH2 agit comme une plateforme de recrutement pour les DNMTs (Viré et al., Nature 2006). Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons investigué le rôle de MeCP2 dans ce modèle. MeCP2 est une protéine à domaine MBD (methyl-binding domain) qui se fixe sélectivement aux cytosines méthylées. Le recrutement de MeCP2 représente un mécanisme majeur par lequel la méthylation de l’ADN réprime la transcription. Nos données montrent que MeCP2 interagit avec EZH2 in vitro et in vivo et que ces protéines fixent des régions promotrices communes. De plus, le niveau de méthylation des cytosines semble prérequis à la présence d’EZH2. Ce travail suggère que MeCP2 puisse recruter EZH2 à la chromatine et renforcer un état réprimé de la chromatine en agissant comme un pont entre deux modifications épigénétiques essentielles, la méthylation de l’ADN et les proteins Polycomb (Viré et al., soumis). En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre un meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’épigénétique et plus particulièrement de cerner comment la méthylation de l’ADN est intimement connectée au remodelage de la chromatine, participe à la répression transcriptionnelle, est spécifiquement ciblée au sein du génome et contribue au développement et à la cancérogenèse.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit.opg. en samenvatting in het Nederlands.

L'organisation des génomes eucaryotes sous forme de chromatine constitue un élément de régulation essentiel de tous les processus cellulaires dépendants de l'ADN. Les facteurs intervenant sur cette organisation jouent donc un rôle crucial dans le bon fonctionnement et le maintien de l'identité des cellules et l'intégrité du matériel génomique. Le complexe NuA4/TIP60 est capable d'agir sur l'organisation de la chromatine de deux façons distinctes : premièrement en acétylant les histones H2A et H4 via sa sous-unité KAT5/Tip60, conduisant à une structure chromatinienne plus relâchée et accessible; deuxièmement en incorporant le variant d'histone H2A.Z dans la chromatine, conférant des propriétés particulières aux régions du génome concernées. NuA4/TIP60 joue ainsi un rôle central dans la régulation de nombreux processus cellulaires, en particulier l'expression des gènes et la réparation des dommages à l'ADN. Le complexe est composé d'au moins 17 sous-unités chez l'humain; les propriétés et fonctions de certaines de ces sous-unités restent à préciser dans le but de mieux comprendre comment NuA4/TIP60 régule l'organisation de la chromatine. Dans la première partie de mes travaux de doctorat présentés ici, nous avons cherché à clarifier la fonction du chromodomaine de KAT5/Tip60, la sous-unité catalytique du complexe. En effet des observations contradictoires avaient été rapportées dans la littérature, en particulier en ce qui concerne la capacité du chromodomaine à reconnaître des marques d'histones spécifiques. Nos résultats suggèrent que ce domaine régule plutôt l'activité acétyltransférase du complexe indépendamment des marques d'histones. Nous avons également caractérisé des mutations de KAT5/Tip60, dont l'une dans le chromodomaine, liées à un syndrome neurodéveloppemental chez plusieurs patients. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z au sein de la chromatine par NuA4/TIP60 et par un autre complexe, SRCAP. Nos résultats suggèrent que NuA4/TIP60 favorise l'un des paralogues de H2A.Z, H2A.Z.2, par rapport à H2A.Z.1, contrairement à SRCAP. Nous avons également identifié des partenaires spécifiques pour chaque paralogue de H2A.Z qui permettent d'expliquer une partie des rôles différents joués par ces paralogues dans la régulation de la transcription. Dans leur ensemble ces travaux contribuent à améliorer notre compréhension de la façon dont le complexe NuA4/TIP60 affecte l'organisation chromatinienne, et comment des perturbations de cette fonction peuvent entraîner des conséquences pathologiques sérieuses. / Eucaryotic genomes take the shape of chromatin, the organization of which affects all DNA-based cellular processes. Hence, factors involved in this organization are critical for maintaining proper cell function, identity, and genome integrity. The NuA4/TIP60 complex affects chromatin organization through two different mechanisms: first by acetylating histones H2A and H4 in chromatin, increasing its relaxation and accessibility; second by incorporating the histone variant H2A.Z into chromatin, assigning distinct properties to given genomic regions. NuA4/TIP60 therefore acts as a central regulator of many cellular processes, in particular gene expression and DNA damage repair. NuA4/TIP60 comprises at least 17 subunits, the functions and properties of many of which still need elucidating in order to better understand how the complex regulates chromatin structure. In the first part of my PhD project presented hereby, we aimed to clarify the function of KAT5/Tip60, the catalytical subunit of NuA4/Tip60. Contradictory results had been previously reported regarding the chromodomain ability to bind specific histone marks. Our results suggest that this domain instead regulates the acetyltransferase activity of NuA4/Tip60 independently of histone marks. We have also characterized mutations in KAT5/Tip60, one of them inside the chromodomain, linked to a rare neurodevelopmental syndrome. In the second part, we were interested in the incorporation of the histone variant H2A.Z in chromatin by NuA4/TIP60 as well as another complex, SRCAP. Our results suggest that NuA4/TIP60 favors one of the two H2A.Z paralogs, H2A.Z.2, over H2A.Z.1, as opposed to SRCAP which binds both equally. We also identified specific interactors for each paralog, which could explain in part how H2A.Z.1 and H2A.Z.2 regulate gene expression differently. Overall this work contributes to a better understanding of how NuA4/TIP60 regulates chromatin organization, and how disruption of these functions can lead to serious pathological outcomes.

La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours de divers processus nucléaires ayant besoin d’un accès direct à l’ADN tels que la réplication, la transcription ou la réparation des lésions. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés et regroupent les chaperons d’histones, les complexes de remodelage ATP-dépendants, les variants d’histone et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Le complexe acéyltransférase NuA4 responsable de l’acétylation des histones H4 et H2A participe activement à la dynamique de la chromatine au cours de ces processus. Il favorise sa relaxation lors de l’activation de la transcription et de la réparation de l’ADN. Il est le seul complexe acétyltransférase dont l’activité est essentielle chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le but de mon projet de doctorat était de mieux comprendre les mécanismes capables de réguler son activité. Nous avons mis en évidence trois niveaux de régulation de son activité, via (i) son auto-acétylation, (ii) son ciblage à la chromatine de façon spécifique et (iii) directement par son substrat histone. Alors que l’acétylation de la sous-unité Yng2 de NuA4 par le complexe lui-même est importante pour le maintien de l’intégrité du complexe et de son activité, nous avons découvert que NuA4 est capable de s’auto-acétyler in vivo et in vitro sur plusieurs de ces sous-unités et que l’acétylation d’un seule lysine dans le domaine MYST de sa sous-unité catalytique Esa1 est essentielle à l’activité du complexe, sans influencer son intégrité. D’autre part, nous avons caractérisé par des techniques de purification un sous-module de NuA4 composé des facteurs Eaf5, Eaf7 et de la protéine à chromodomaine Eaf3 capable de reconnaître les lysines méthylées, qui serait impliqué dans le ciblage de NuA4 à la chromatine. Ce complexe trimérique est également présent indépendant de NuA4 dans la cellule, et serait localisé de façon préférentielle sur la région codante des gènes. Enfin, les travaux du laboratoire ont montré que les modifications post-traductionnelles présentes sur la queue N-ter de H4 peuvent réguler l’activité de NuA4. La phosphorylation de H4 sur sa sérine 1 inhibe son acétylation sur les lysines adjacentes par NuA4. Alors que nous montrons que cette marque est spécifiquement induite sur la région codante de gènes activés, nos résultats indiquent que cette phosphorylation serait impliquée dans la dynamique de la chromatine au cours de l’élongation de la transcription. / Chromatin, which basic unit is the nucleosome, is a very dynamic structure that requires remodeling during nuclear processes that need to access the DNA such as replication, transcription and DNA damage repair. A number of remodeling factors have been characterized and include histone chaperone, ATP-dependent remodelers, histone variants and post-translational histone modifiers. The NuA4 acetyltransferase complex, responsible for H4 and H2A acetylation, participates in chromatin and nucleosome dynamics associated to these nuclear processes. It was shown to promote chromatin relaxation during transcription activation and DNA repair. NuA4 is the only acetyltransferase complex essential for viability in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The objective of my Ph.D. project was to understand the mechanisms that regulate NuA4’s activity. We brought to the forefront tree different ways to control NuA4’s activity, via its auto-acetylation, its specific targeting to the chromatin and via its histone substrate. While acetylation of the Yng2 subunit of NuA4 by NuA4 itself is important for maintenance of the integrity and activity of the complex, we discovered that NuA4 is capable of in vivo and in vitro auto-acetylation of several of its subunits. In addition, we showed that the acetylation of a single lysine residue located in the MYST domain of the catalytic subunit Esa1 is essential for the activity of the complex and has no effect on its integrity. On another hand, we have characterized a sub-complex of NuA4 composed by the Eaf5, Eaf7 and the chromodomain-containing Eaf3 proteins that are implicated in NuA4 targeting to the chromatin. This trimeric complex is also found in the cell independent of NuA4 and preferentially associated to gene coding region. Finally, published works from our laboratory showed that post-translational modifications of H4 N-ter tail can regulate NuA4 activity. Phosphorylation of H4 serine1 inhibits its acetylation on adjacent lysines by NuA4. We demonstrated that this mark is specifically induced on coding region of active genes and that this phosphorylation would be implicated in chromatin dynamics associated with the transcription elongation process.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 13 févr. 2008). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 74-89. Publié aussi en version électronique.