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Les bases moléculaires de l’initiation et de la progression du cancer ovarien épithélial (COE) sont pauvrement comprises. Un élément pathogénique clé dans le cancer est l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs, fréquemment due à l’hyperméthylation de leur région promotrice. Dans ce contexte, nous avons utilisé une approche épigénomique pour trouver des gènes hyperméthylés dans le COE. Nous avons employé un agent déméthylant, 5-aza-dC, pour réactiver les gènes hyperméthylés dans quatre lignées cellulaires du COE (SKOV3, OVCAR3, TOV112 et TOV21). Nous avons trouvé plusieurs cibles potentielles d’hyperméthylation qui pourraient jouer un rôle fonctionnel dans la suppression tumorale, l’apoptose ou la réparation de l’ADN. Nous avons évalué leur statut de méthylation par MSP (methylation-specific PCR) et BSP (bisulfite-sequencing PCR) avec des échantillons normaux et tumoraux et deux lignées cellulaires du COE. Parmi ces cibles, le gène DOK1 a démontré une évidence de méthylation de la région promotrice des échantillons tumoraux comparativement à celle de ceux qui sont normaux. Des clones surexprimant et d’autres sous-exprimant DOK1 ont été construits et validés. Son rôle potentiel dans la prolifération cellulaire, dans la sensibilité au taxol et au cisplatin, et dans le cycle cellulaire a été évalué par des études fonctionnelles et une légère implication a été détectée dans ces fonctions. Les changements d’expressions globales reliés à l’expression de ce gène ont également été analysés par la technologie de micropuces de l’ADN. Nos données montrent que DOK1 est touché par une hyperméthylation de sa région promotrice potentielle dans les tumeurs du COE. Par contre, cette hyperméthylation ne semble pas influencer son niveau d'expression. Au contraire, son expression augmente dans le cancer ovarien. Cette augmentation serait reliée à une diminution des risques de progression du COE. Cette observation confirme le rôle potentiel de suppresseur de tumeur de DOK1 dans le COE. / The molecular basis of the epithelial ovarian cancer (EOC) initiation and progression are still poorly understood. A key pathogenic element in cancer is the inactivation of tumours suppressor genes, frequently due to the hypermethylation of their promoter sequence. In this context, we used an epigenomic approach to identify hypermethylated genes in the EOC. We used the demethylating agent, 5-aza-dC, to reactivate hypermethylated genes in four cells lines of EOC (SKOV3, OVCAR3, TOV112 and TOV21). We identified several targets genes potentially hypermethylated that could play a functional role in ovarian tumorigenesis suppression, apoptosis or DNA repair. We evaluated their methylation status by MSP (methylation-specific PCR) and BSP (bisulfite-sequencing PCR) within normal and tumoral ovarian samples and in two EOC cells lines. Among these targets, the DOK1 gene showed an evidence of methylation of the promoter region in the tumour samples compared to the normal ones. Clones over-expressing and others under-expressing DOK1 were built and validated. The potential role of this gene in cellular proliferation, sensitivity to taxol and cisplatin, and in the cell cycle was evaluated by functional studies and a little implication of the DOK1 gene was detected in these functions. The global expression changes connected to the expression of the DOK1 gene were also analyzed by the microarray genomics technology. Our data show that DOK1 is affected by hypermethylation of its potential promoter region in EOC tumors. This hypermethylation do seems not to influence its expression levels. On the contrary, its expression level increases in ovarian cancer. This increase would be connected to a reduction in the risks of progression of the COE. Moreover, this observation confirms the potential role of DOK1 as tumor suppressor in EOC.

L' étiologie du cancer de l'endomètre est méconnue. Pourtant, la LH et les prostaglandines activent via- leurs récepteurs spécifiques exprimés dans le cancer de l'endomètre, un second messager commun, soit l'AMPc impliquée dans la prolifération et l'invasion du cancer de l'endomètre. Les gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 sont surexprimés dans le cancer de l'endomètre et leur expression est connue pour répondre à la voie de l'AMPc via une stimulation par la LH et les prostaglandines. Les facteurs de transcription NUR 77 et C/EBPβ sont impliqués dans différents cancers et sont activés par la voie AMPc/PK.A, d'où notre hypothèse qu' ils pourraient activer la transcription des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 dans le cancer de l'endomètre. L'objectif de l 'étude est de déterminer si les facteurs NUR77 et C/EBPβ sont présents dans des lignées cellulaires du cancer de l'endomètre et s' ils pourraient être impliqués dans l'expression des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 dans ces cellules. J' ai pu démontrer la présence des deux facteurs dans différentes lignées cellulaires du cancer de l'endomètre. Cependant, mes résultats de transfections transitoires démontrent que NUR 77 et C/EBPβ activent faiblement les trois promoteurs à l'étude d'où l'intérêt de chercher d'autres collaborateurs impliqués dans l'expression des gènes STAR, HSD3β32 et COX-2 ou encore d' autres gènes régulés cibles par NUR77 et C/EBPβ dans le cancer de l'endomètre.

Les thérapies moléculaires ciblées ont changé la prise en charge des patients atteints de cancer, et en particulier dans le cancer colorectal (CCR). Il est important d’identifier des biomarqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements. En premier, la signalisation en aval de l’EGFR au niveau tumoral pourrait conditionner la réponse au cétuximab dans les cancers colorectaux (CCR). Notre premier travail a évalué le niveau d’expression tumorale de phosphoprotéines de signalisation en aval de l’EGFR (p-MEK, p-ERK1/2, p-AKT, p-GSK3b, p-P70S6K) analysés par Bioplex phosphoprotein array chez 42 patients avec un CCR métastatique, traités par anti-EGFR. L’expression de p-P70S6K est plus faible chez les patients répondeurs (p=0,02). La survie sans progression (SSP) est supérieure en cas d’expression faible de p-P70S6K (p=0,0001) et p-MEK (p=0,0006). p-MEK et p-P70S6K ont une expression plus élevée chez les KRAS mutés et apparaissent comme deux marqueurs pronostiques indépendants de KRAS (HR 0,34, p=0,01 et HR 0,42, p=0,03). Ainsi, le niveau d’expression des phosphoprotéines en aval de l’EGFR pourrait prédire la réponse et la SSP dans les CCR traités par anti-EGFR, indépendamment du statut KRAS. Il est difficile dans certain cas d’avoir accès au tissu tumoral. L’ADN circulant (cADN) dans les stades avancés de cancer peut aider à la caractérisation moléculaire des tumeurs, en tant que biopsie. Notre deuxième travail a étudié la faisabilité, la sensibilité et la spécificité d’une technique de spectrométrie de masse (Sequenom) pour détecter des mutations (238 mutations parmi 19 oncogènes) à partir du tissu tumoral et du cADN de 105 patients ayant un cancer avancé. La concentration médiane de cADN était de 17ng/ml de plasma (0,5-1600), soit 3 fois le niveau chez les volontaires sains. En analyse multivariée, la concentration de cADN, l’albumine et l’état général étaient des facteurs prédictifs indépendants de la survie globale des patients. De plus, il existait une concordance élevée des statuts mutationnels (KRAS, BRAF et PIK3CA) entre le tissu tumoral et le cADN dans plusieurs types tumoraux (CCR, sein, mélanome): un taux de concordance de 70% pour le gène KRAS et de 100% pour le gène BRAF ont été retrouvés dans le CCR. Notre Étude suggère que l’analyse du cADN pourrait être un matériel utilisable pour la recherche de mutations, notamment dans le suivi des patients ayant un cancer du colon traités par thérapies ciblées. Notre travail a donc montré l’intérêt de poursuivre l’étude de facteurs moléculaires qui pourraient prédire la réponse ou la résistance à des thérapies ciblées utilisées dans les cancers du colon, au niveau du tissu tumoral (phosphoprotéines) ou au niveau du sang (cADN). / Especially in CRC, it is important to identify molecular targeted therapies biomarkers. First, additional markers of resistance to KRAS mutations could predict resistance to anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibodies in advanced colorectal cancer (CRC). In our first study, in a series of 42 patients with advanced CRC treated with cetuximab/panitumumab, for whom KRAS status was previously determined, we retrospectively analyzed the intratumor expression of EGFR downstream signaling phosphoproteins of the RAS/MAPK and PI3K/AKT pathways (pERK1/2, pMEK1, pAKT, pP70S6K and pGSK3beta) using Bio-Plex phosphoprotein array. The expression of all the phosphoproteins was higher in KRAS mutated tumors than in WT tumors. The expression of pP70S6K was lower in responders than in nonresponder patients. In multivariate analysis, PFS was shorter for patients with high pMEK1 or pP70S6K expression, independently of KRAS status, as OS for patients with high pP70S6K expression. Our results suggest the importance of EGFR downstream signaling phosphoproteins expression in addition to KRAS status to define the subgroup of patients who will not benefit from anti-EGFR therapy. We hypothesized that circulating plasma DNA (cpDNA) in advanced cancer patients is largely derived from tumor, and can be utilized for tumor mutation sequencing when repeat biopsy is not feasible. In our second study, we utilized the Sequenom MassArray System and OncoCarta panel for somatic mutation profiling. Matched samples, acquired from the same patient but at different time points were evaluated; these comprised formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) archival tumor tissue (primary and/or metastatic) and cpDNA. The feasibility, sensitivity, and specificity of this high-throughput, multiplex mutation detection approach was tested utilizing specimens acquired from 105 patients with solid tumors referred for participation in Phase I trials of molecularly targeted drugs. The median cpDNA concentration was 17 ng/ml (range: 0.5-1600); this was 3-fold higher than in healthy volunteers. In multivariate analyses, cpDNA concentration, albumin, and performance status remained independent predictors of OS. We also observed high detection concordance for critical "hot-spot" mutations (70% for KRAS, 100% for BRAF) in matched cpDNA and archival tumor tissue. This multiplex sequencing assay can be utilized to detectsomatic mutations from plasma in advanced cancer patients, when safe repeat tumor biopsy is not feasible and genomic analysis of archival tumor is deemed insufficient. Our work did show the importance to search for molecular markers to predict response to targeted therapies, both in tumor tissu (phosphoproteins) and in blood (cpDNA).

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme et constitue un véritable problème de santé publique. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la caractérisation des principales voies de signalisation et ont mis en évidence l'implication majeure de la signalisation cellulaire dans les processus de cancérogenèse. Des cibles moléculaires ont ainsi été identifiées et ont permis le développement de thérapeutiques dites ciblées, telles que les anticorps monoclonaux ou encore les inhibiteurs de kinase. Malgré ces avancées considérables qui ont permis l'amélioration de la prise en charge des patientes, on constate l'apparition de résistances aux traitements. Ce travail avait pour objectifs d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de déterminer leur signification clinique, leur intérêt théranostique ainsi que leur impact sur la réponse aux traitements. Dans un premier temps nous avons étudié les mutations activatrices du gène PIK3CA. Ces mutations sont retrouvées dans 25% des cancers du sein et sont impliquées dans la résistance au trastuzumab, aux anti-œstrogènes et aux inhibiteurs de mTOR. 149 échantillons de tumeurs de sein infiltrantes ont été analysés par une technique de PCR-HRM (High Resolution Melting) et 118 échantillons par une technique de PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Les résultats des 2 techniques étaient concordants (k=0,845 ; p<0,001) et une relation entre mutations du gène PIK3CA et grade SBR a été mise en évidence, les tumeurs de grade SBR III étant moins fréquemment mutées que les autres (p=0.025 en HRM et p=0.009 en ARMS). Dans un second temps, notre travail a consisté en l'exploration fonctionnelle des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases et P38MAPKinase. Pour cela nous avons analysé le niveau d'expression des phosphoprotéines p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1/2, p-P90RSK, p-IGF1R ainsi que p-P38MAPK par immuno-analyse multiplexe. Cette partie a comporté 3 études. Une première étude rétrospective sur 45 échantillons de tumeurs mammaires invasives congelées a mis en évidence des niveaux d'expression de P38 et de p-P38 plus élevés dans les tumeurs RE+. La deuxième étude était une étude prospective visant à déterminer des biomarqueurs de réponse à l'association trastuzumab-évérolimus chez des patientes présentant un cancer du sein précoce traitées en préopératoire. Cette étude a révélé une augmentation statistiquement significative du niveau d'expression de p-MEK1 (p=0.012), p-ERK1/2 (p=0.003) et p-P38MAPK (p<0.001) dans le bras de traitement associant l'évérolimus au trastuzumab qui pourrait s'expliquer par la suppression par l'évérolimus d’une boucle de rétrocontrôle négatif contrôlant l'activation de la voie RAS/RAF/MAPKinases. Dans le bras de traitement évaluant le trastuzumab seul, aucune variation du niveau d'expression des phosphoprotéines n'a été mise en évidence, y compris en aval du récepteur HER2, ce qui soulève l'hypothèse d'un mécanisme d'action prédominant immunologique du trastuzumab. La troisième étude qui comparait l'impact du trastuzumab in vitro et en situation clinique confirme la différence des mécanismes d'action mis en jeu en fonction des conditions cellulaires et cliniques. Dans son ensemble, ce travail a mis en évidence que la détermination du statut mutationnel du gène PIK3CA et du niveau d’expression des phosphoprotéines pourrait être utile à une meilleure caractérisation moléculaire des cancers du sein et à l’optimisation de la personnalisation des prescriptions de thérapies ciblées / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and is a real public health problem.Advances in molecular biology have allowed the characterization of the major signaling pathways and revealed their major implication in carcinogenesis processes. Molecular targets have been identified and have enabled the development of targeted therapies, such as monoclonal antibodies, or kinase inhibitors. Despite these considerable advances that have improved the care of patients, emerging of resistance to treatments has been observed. The aim of this work was to identify new tumor biomarkers and determine their clinical significance, their theranostic interest and their impact on the response to targeted therapies. Initially, we studied the activating mutations of the PIK3CA gene. These mutations are found in 25% of breast cancers and are involved in resistance to trastuzumab, antiestrogens and mTOR inhibitors. We analyzed 149 invasive breast tumor samples for PIK3CA gene mutations by PCR-HRM (High Resolution Melting) and 118 by PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). The results achieved with the 2 techniques were consistent (k = 0.845; p <0.001) and a relationship between PIK3CA mutations and grade SBR was highlighted with a lower occurrence of mutations in SBR grade III tumors (p=0.025 in HRM and p=0.009 in ARMS). Secondly, we investigated the functional alteration of PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases and P38MAPKinase signaling pathways. We have analyzed the expression level of phosphoproteins p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1 / 2, p-P90RSK, p-IGF1R and p-p38MAPK by multiplex immunoanalysis. This part includes 3 studies. The first study was a retrospective study of 45 frozen samples of invasive breast tumors in which we observed that the level of expression of P38 and p-P38 was higher in the ER + tumors. The second study was a prospective study to identify biomarkers of response to trastuzumab-everolimus association in patients with early breast cancer treated preoperatively. This study showed a statistically significant increase of the expression level of p-MEK1 (p = 0.012), p-ERK1/2 (p = 0.003) and p-p38MAPK (p<0.001) in arm treated by trastuzumab associated with everolimus. It could be explained by the repression of a negative feedback loop involving S6K, PI3K and RAS by everolimus, leading to the activation of RAS/RAF/MAPKinases signaling pathway. In the control arm investigating trastuzumab alone, no significant variations of the level of expression of phosphoproteins was demonstrated, raising the hypothesis of the implementation of a predominant immunological mechanism of action for Trastuzumab. The third study that compared effect of trastuzumab in vitro and in clinical setting confirms that trastuzumab has different modes of action when evaluated in cells and in clinical conditions. As a whole, this work showed that determining the mutation status of PIK3CA and the expression level of phosphoproteins could be useful to refine the molecular characterization of breast cancers and optimize the criteria used to personalize the prescription of targeted therapies

Les thérapies moléculaires ciblées ont changé la prise en charge des patients atteints de cancer, et en particulier dans le cancer colorectal (CCR). Il est important d'identifier des biomarqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements. En premier, la signalisation en aval de l'EGFR au niveau tumoral pourrait conditionner la réponse au cétuximab dans les cancers colorectaux (CCR). Notre premier travail a évalué le niveau d'expression tumorale de phosphoprotéines de signalisation en aval de l'EGFR (p-MEK, p-ERK1/2, p-AKT, p-GSK3b, p-P70S6K) analysés par Bioplex phosphoprotein array chez 42 patients avec un CCR métastatique, traités par anti-EGFR. L'expression de p-P70S6K est plus faible chez les patients répondeurs (p=0,02). La survie sans progression (SSP) est supérieure en cas d'expression faible de p-P70S6K (p=0,0001) et p-MEK (p=0,0006). p-MEK et p-P70S6K ont une expression plus élevée chez les KRAS mutés et apparaissent comme deux marqueurs pronostiques indépendants de KRAS (HR 0,34, p=0,01 et HR 0,42, p=0,03). Ainsi, le niveau d'expression des phosphoprotéines en aval de l'EGFR pourrait prédire la réponse et la SSP dans les CCR traités par anti-EGFR, indépendamment du statut KRAS. Il est difficile dans certain cas d'avoir accès au tissu tumoral. L'ADN circulant (cADN) dans les stades avancés de cancer peut aider à la caractérisation moléculaire des tumeurs, en tant que biopsie. Notre deuxième travail a étudié la faisabilité, la sensibilité et la spécificité d'une technique de spectrométrie de masse (Sequenom) pour détecter des mutations (238 mutations parmi 19 oncogènes) à partir du tissu tumoral et du cADN de 105 patients ayant un cancer avancé. La concentration médiane de cADN était de 17ng/ml de plasma (0,5-1600), soit 3 fois le niveau chez les volontaires sains. En analyse multivariée, la concentration de cADN, l'albumine et l'état général étaient des facteurs prédictifs indépendants de la survie globale des patients. De plus, il existait une concordance élevée des statuts mutationnels (KRAS, BRAF et PIK3CA) entre le tissu tumoral et le cADN dans plusieurs types tumoraux (CCR, sein, mélanome): un taux de concordance de 70% pour le gène KRAS et de 100% pour le gène BRAF ont été retrouvés dans le CCR. Notre Étude suggère que l'analyse du cADN pourrait être un matériel utilisable pour la recherche de mutations, notamment dans le suivi des patients ayant un cancer du colon traités par thérapies ciblées. Notre travail a donc montré l'intérêt de poursuivre l'étude de facteurs moléculaires qui pourraient prédire la réponse ou la résistance à des thérapies ciblées utilisées dans les cancers du colon, au niveau du tissu tumoral (phosphoprotéines) ou au niveau du sang (cADN).

L'enzynle HSD3B2 humaine et la protéine STAR de souris encodées par les gènes HSD3B2 et Star, respectivement, sont retrouvées principalement au niveau des gonades et surrénales. L'importance de STAR comme transporteur du cholestérol et de HSD3B2 comme enzyme de la stéroïdogenèse est lnise en évidence par des mutations de ces gènes causant une hyperplasie congénitale des surrénales, un pseudohermaphrodisme mâle et une insuffisance des surrénales. Un rôle pour la famille de récepteurs nucléaires orphelins NUR 77 dans la stéroïdogenèse a été considéré. En effet, NUR77 est présent dans les gonades et surrénales où son expression est fortement et rapidement induite par des horlnones qui activent certains gènes impliqués dans la stéroïdogenèse. De plus, les profils d'expression de Nur77 et des gènes RSD3B2 et Star sont corrélés. Lors de cette thèse, j'ai démontré que les promoteurs HSD3B2 et Star constituent des nouvelles cibles de NUR77. Des éléments de réponse localisés à -130 pb et -95 pb des promoteurs HSD3B2 et Star respectivement, sont essentiels et suffisants pour conférer une réponse dépendante de NUR77, et la mutation de ces élélnents . diminue leurs activités basale et homlono-dépendante dans les cellules stéroïdogéniques. Dans les cellules de Leydig, un réduction de l'expression de Nur77 par siARN réduit l'induction de l'expression de Star par l'AMPc. Également, NUR77 coopère avec des co activateurs de la famille SRC et avec des membres de la famille AP-1 dans la régulation des promoteurs RSD3B2 et Star, respectivement. De plus, le dexaméthasone, un glucocorticoïde synthétique, inhibe l'activation de Star en diminuant le recrutement de NUR77, et non SF-I, à la région proximale du promoteur Star, donnant un argument moléculaire à la suppression causée par le stress de la production de testostérone dans le testicule. J'ai démontré que la voie de signalisation des CaMK est requise pour l'expression de STAR et NUR77 en réponse à l'AMPc dans les cellules de Leydig. Ainsi, CaMKI est spécifiquement exprimé dans les cellules de Leydig. Enfin, je démontre que CaMKI coopère avec NUR 77 et MEF2 pour activer les promoteurs Star et Nur77, respectivement, dans ces cellules. Ainsi, l'identification de NUR 77 comme régulateur important des promoteurs HS1J3B2 et Star et de son mécanisme d'action aident à mieux défénir la spécificité tissulaire et la régulation hormonale de ces gènes dans les cellules de Leydig en plus de soulever un rôle pour CaMKI dans ce processus.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal