Aντικείµενο της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη και ο έλεγχος τετραδιάστατων υπολογιστικών µοντέλων της απόκρισης καρκινικών όγκων και φυσιολογικών ιστών in vivo σε ακτινοθεραπευτικά σχήµατα καθώς και της απόκρισης καρκινικών όγκων in vivo σε χηµειοθεραπευτικά σχήµατα. Στόχος είναι η χρήση των µοντέλων για τη βαθύτερη κατανόηση και ανάλυση της βιολογίας του καρκίνου και κυρίως για την εξατοµικευµένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής στρατηγικής µε τη διεξαγωγή πειραµάτων in silico (=στον υπολογιστή). Τα εν λόγω πειράµατα βασίζονται στα ατοµικά απεικονιστικά, ιστοπαθολογικά, γενετικά και ιστορικά δεδοµένα του ασθενούς. Τα µοντέλα δοµούνται µε τη χρήση κατάλληλου κυβικού πλέγµατος το οποίο διακριτοποιεί την ανατοµική περιοχή ενδιαφέροντος καθώς και µε ένα πλήθος καινοτόµων αλγορίθµων που αποδίδουν υπολογιστικά τα επί µερους βιολογικά φαινόµενα. Σε κάθε κυψελίδα του πλέγµατος προσοµοιώνονται οι βασικοί βιολογικοί «νόµοι» των κυττάρων όπως ο εξαρτώµενος από την τοπική παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών µεταβολισµός, η υπό συνθήκες διέλευση του κυτταρικού κύκλου, ο υπό συνθήκες κυτταρικός θάνατος (δια της νέκρωσης ή της απόπτωσης), η επιβίωση των κυττάρων µετά από την ακτινοβόληση ή την επίδραση χηµειοθεραπευτικού φαρµάκου, οι µηχανισµοί γεωµετρικής διόγκωσης και συρρίκνωσης του όγκου, η ενεργοποίηση των βλαστικών κυττάρων σε περίπτωση νέκρωσης φυσιολογικού ιστού κτλ. Το πλέγµα σαρώνεται χωροχρονικά και προσοµοιώνονται οι αλλαγές καταστάσεων των υποοµάδων κυττάρων πουβρίσκονται σε κάθε κυψελίδα. Επίσης προσοµοιώνεται η διαφορική συρρίκνωση ή η αύξηση του καρκινικού όγκου η οποία οδηγεί στη µακροσκοπική και απεικονιστικά ορατή αυξοµείωση του µεγέθους του. Από πλευράς µαθηµατικών «εργαλείων» χρησιµοποιούνται η έννοια των κυτταρικών αυτοµάτων, η γενική τεχνική Monte Carlo για την προσοµοίωση στοχαστικών φαινοµένων καθώς και ένα πλήθος νέων προτεινόµενων αλγορίθµων για τη διακριτή περιγραφή επί µέρους φαινοµένων / µηχανισµών. Για λόγους µείωσης του υπολογιστικού κόστους έτσι ώστε αυτό να είναι συµβατό µε την κλινική πράξη, προτείνεται και εφαρµόζεται µια σειρά από προσεκτικές κβαντοποιήσεις σε διάφορες παραµέτρους. Τα µοντέλα που αναπτύχθηκαν προσαρµόστηκαν στην περίπτωση του εγκεφαλικού όγκου πολυµόρφου γλοιοβλαστώµατος και της γύρω από αυτό φυσιολογικής λευκής και φαιάς ουσίας. Ως χηµειοθεραπευτικό φάρµακο θεωρήθηκε η τεµοζολοµίδη (temodal © ή temodar © ). Καταρχή τα µοντέλα ελέχθηκαν σχολαστικά τόσο από πλευράς αριθµητικής ευστάθειας (π.χ. διαφορετικές σειρές σάρωσης του πλέγµατος, χρήση διαφορετικών «σπόρων» στις γεννήτριες τυχαίων αριθµών κτλ.) όσο και από πλευράς ποιοτικής βιολογίας. Ακολούθησε η διεξαγωγή παραµετρικών µελετών η οποία επιβεβαίωσε ηµιποσοτικά τη συµφωνία τους µε την πειραµατική και κλινική συσσωρευµένη γνώση. Η διαδικασία ελέγχου συνεχίστηκε µε την προσοµοίωση πραγµατικών κλινικών µελετών (clinical studies) για συγκεκριµένες περιπτώσεις και µε τη συνακόλουθη διαπίστωση συµφωνίας µεταξύ αυτών και των αποτελεσµάτων των προσοµοιώσεων. Αν και οι κλινικοί έλεγχοι συνεχίζονται, τα µέχρι τώρα αποτελέσµατα συγκροτούν µια σηµαντική βάση αξιοπιστίας των µοντέλων. Τονίζεται πάντως ότι λόγω του ηµιστοχαστικού χαρακτήρα αλλά και της εξαιρετικής πολυπλοκότητας του καρκίνου είναι πρακτικάαπίθανο το αποτέλεσµα µιας προσµοίωσης να συµπίπτει απόλυτα µε τα πραγµατικά κλινικά δεδοµένα. Το κεντρικό συµπέρασµα της διατριβής είναι ότι τα αναπτυχθέντα προσοµοιωτικά µοντέλα είναι ικανά να αποτελέσουν τον πυρήνα ενός αξιόπιστου εικονικού συστήµατος διεξαγωγής ογκολογικών πειραµάτων και εξατοµικευµένης βελτιστοποίησης της ακτινοθεραπευτικής και χηµειοθεραπευτικής στρατηγικής. / Considerable research efforts have focused on the mathematical / computer modeling of the response of tumors and normal tissues to various therapeutic modalities but, unfortunately, current models of such dynamic processes need substantial improvement due to the complexity of the problems addressed and the paucity of large series of clinical data. This thesis presents an effort to overcome a number of current modeling shortcomings by addressing the actual clinical tumor and the surrounding normal tissue in vivo. Therefore, the proposed model simulates the spatiotemporal response of a tumor under different radiotherapeutic and chemotherapeutic fractionation schemes. Modeling of the in vivo response of slowly responding normal tissues to radiotherapy is also addressed. The special case of glioblastoma multiforme (GBM) has been considered as an application paradigm. Concerning chemotherapy, the effect of the temozolomide agent has been computer modeled. The salient points of the model are the following. The imaging data of the patient (e.g. MRI T1 slices), the exact histopathologic type of the malignancy as well as pertinent genetic (e.g. p53 gene status) data are appropriately collected and introduced into the simulation software. The proposed 4-D simulation model which refers predominantly to the cell – tissue level is based on the cell cycle, the oxygen and nutrient supply (as estimated form the imaging data), the cell loss factor, the alpha and beta radiobiological parameters of the linear quadratic (LQ) model and the pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters of the drug. Especially for the normal tissues, the tissue homeostatic tendency has been primarily taken into account.All parameters used in the model have already been defined and can in principle be determined either experimentally or clinically. Therefore new mathematics dictated parameters of ambiguous physical meaning are avoided. The chiefly discrete mathematics employed include the generic stochastic Monte Carlo technique, cellular automata constructs, Euclidean geometry metrics etc. Visualization of the simulation predictions has been achieved using virtual reality techniques. The model predictions have shown good agreement with both reason and clinical experience. An at least semi-quantitative agreement of the simulation predictions with the outcome of the RTOG Study 83-02 has strengthened the potential of the model. Long term quantitative testing and adaptation are ongoing. Therefore, after completion of the necessary long term tests and eventual improvements the proposed modeling platform could serve as a patient individualized decision-support system. In this way the medical doctor could make his or her final decision on the selection of the most promising therapeutic scheme by taking into account both, the predicted outcomes of all simulated regimens as well as his or her own medical knowledge and expertise. It is noted, however, that such a computational platform does not intend to replace the medical doctor’s input but to add the possibility to investigate the impact of specific treatment-induced perturbations. Such a system could also serve as an educational platform for professionals and patients by means of virtual reality demonstrations of the likely natural development and treatment responsiveness of specific cancers so that all groups might positively contribute to the discussion about treatment procedure.

Η ουδετεροπενία που σχετίζεται με τη χημειοθεραπεία, είναι μια συχνή ανεπιθύμητη ενέργεια της θεραπείας κατά του καρκίνου, η οποία κάνει τους ασθενείς πιο ευπαθείς σε λοιμώξεις απειλητικές για τη ζωή. Ο κίνδυνος για εμπύρετη ουδετεροπενία ποικίλει ανάλογα με το σχήμα της χημειοθεραπείας και διάφορα χαρακτηριστικά του ασθενούς, όπως η μεγάλη ηλικία ή σοβαρές συνοδές παθήσεις. Διάφορες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η χορήγηση αυξητικών παραγόντων των κοκκιοκυττάρων (G-CSFs) μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο για εμπύρετη ουδετεροπενία. Η μείωση κινδύνου που αναφέρεται σε κλινικές μελέτες, κυμαίνεται από 8% μέχρι 37%, και η διακύμανση του ποσοστού αυτού αντικατοπτρίζει διαφορές στον κίνδυνο εμπύρετης ουδετεροπενίας που σχετίζεται με το σχήμα της χημειοθεραπείας. Το πρόβλημα που περιορίζει τη χορήγησή τους είναι το μεγάλο κόστος που έχουν. Επομένως, η τελική απόφαση για τη χορήγηση αυτών των φαρμάκων βασίζεται στις μελέτες αποτελεσματικότητας του φαρμάκου. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση του πραγματικού ποσοστού εμφάνισης εμπύρετης ουδετεροπενίας σε ασθενείς με διάφορους συμπαγείς όγκους συμπεριλαμβανομένων και των λεμφωμάτων στους οποίους χορηγήθηκε αυξητικός παράγοντας αποικιών κοκκιοκυττάρων. Επιπρόσθετα μελετήθηκε ο συσχετισμός του ποσοστού εμφάνισης εμπύρετης ουδετεροπενίας με διάφορους παράγοντες που μπορεί να επηρεάζουν την εμφάνιση της. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κόστους-αποτελεσματικότητας της δευτερογενούς χορήγησης αυξητικού παράγοντα στο Κέντρο. Σε μια αναδρομική μελέτη μελετήθηκαν 482 ασθενείς οι οποίοι έλαβαν αυξητικό παράγοντα (λενογραστίμη) είτε ως πρωτογενή είτε ως δευτερογενή προφύλαξη. Η συλλογή των δεδομένων έγινε καταγράφοντας στοιχεία από τους φακέλους με το ιατρικό ιστορικό των ασθενών, από το λογισμικό πρόγραμμα Power Pro του φαρμακείου (ιστορικό φαρμάκων κάθε ασθενούς) και από το λογισμικό πρόγραμμα MOSAIQ του Κέντρου (αιματολογικές εξετάσεις των ασθενών). Μετά από πρωτογενή προφύλαξη με λενογραστίμη εμφανίστηκαν 38 εμπύρετα επεισόδια σε 30/367 (8,2%) ασθενείς, ενώ μετά από δευτερογενή προφύλαξη εμφανίστηκαν μόνο 5 εμπύρετα επεισόδια σε 5/115 (4,3%) ασθενείς. Από τη στατιστική ανάλυση δεδομένων προκύπτει ότι σημαντικοί προδιαθεσικοί παράγοντες για την εμφάνιση εμπύρετης ουδετεροπενίας ήταν το φύλο (p=0,015), η προηγούμενη ή ταυτόχρονη ακτινοθεραπεία (p=0,040) και ο αριθμός συνοδών παθήσεων (p=0,014). Με την αύξηση της διάρκειας χορήγησης λενογραστίμης μειώθηκε σημαντικά ο αριθμός επεισοδίων εμπύρετης ουδετεροπενίας ανά ασθενή (p=0,0067), η διάρκεια νοσηλείας στο νοσοκομείο (p=0,02), ενώ αντίθετα αυξήθηκαν οι ανεπιθύμητες ενέργειες οι οποίες παρατηρήθηκαν σε 153/482 (31,7%) ασθενείς (p=0,029). Η πιο συχνή ανεπιθύμητη ενέργεια που εμφανίστηκε ήταν ο πόνος στα οστά σε 148/482 (30,7%) ασθενείς, παρόλα αυτά σε 124/148 (83,8%) ασθενείς θεραπεύτηκε με χορήγηση παρακεταμόλης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης κόστους-αποτελεσματικότητας η χορήγηση χημειοθεραπείας με δευτερογενή προφύλαξη με λενογραστίμη σε ασθενείς «χαμηλού κινδύνου» παρουσιάζει υψηλότερη κλινική αποτελεσματικότητα από τη μη προφύλαξη, η οποία επέφερε τη μείωση του συνολικού κόστους ανά ασθενή που θεραπεύεται. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η λενογραστίμη αποτελεί υποψήφιο είδος G-CSF με ελκυστικά χαρακτηριστικά για χορήγηση σε ουδετεροπενικούς ασθενείς με πυρετό. Τα ποσοστά εμπύρετης ουδετεροπενίας που εμφανίστηκαν, αν και ήταν υψηλά, παραμένουν μικρότερα από αυτά που παρατηρήθηκαν την ίδια χρονική περίοδο σε πολλά κέντρα του εξωτερικού. Η δευτερογενής προφύλαξη με λενογραστίμη σε ασθενείς «χαμηλού κινδύνου» εκτιμάται ως η κυρίαρχη επιλογή τόσο από πλευράς κλινικής αποτελεσματικότητας όσο και από πλευράς κόστους-αποτελεσματικότητας. / Chemotherapy-induced febrile neutropenia (FN) is a serious side effect of cancer treatment, commonly occurring during the initial cycles of cytotoxic therapy and increasing in frequency with both the depth and duration of neutropenia. The risk of developing FN appears to depend on a variety of factors, including tumor type, chemotherapy regimen and patient-related risk factors. Myeloid growth factors have been shown to reduce the incidence, duration, and severity of neutropenic events across a broad range of malignancies and regimens, often enabling the delivery of full chemotherapy dose intensity. A major limitation of the use of G-CSFs is the ability to predict which patients are at risk of developing neutropenic complications as administration is costly. The purpose of this study was to: (1) evaluate the real-world incidence of FN in patients with solid tumors, including lymphoma, after receiving lenograstim, (2) analyse factors that predict the occurrence of chemotherapy-induced myelosuppression, and (3) evaluate the cost-effectiveness of secondary prophylaxis with lenograstim. The study conducted in Bank of Cyprus Oncology Center at Nicosia. A total of 482 patients who received G-CSF between February 2008 and January 2010 were identified and selected from the pharmacy records. Data were retrospectively obtained from the medical records and records with the blood cell accounts. Results were recorded and analyzed using a database system (SPSS). The incidence of FN after primary prophylaxis with lenograstim was 8,2% and after secondary prophylaxis was 4,3%. Analysis of the results showed that gender (p=0,015), prior or concurrent radiation (p=0,040) and comorbidities (p=0,014) were associated with the risk of severe and febrile neutropenia. The use of CSFs in patients with established FN reduces the amount of time spent in hospital (p=0,02), while side effects were increased (p=0,029). Bone pain was reported in 30,7% patients receiving lenograstim and was treated with paracetamol in 83,8% patients. Secondary prophylaxis with lenograstim improved health outcomes with a very limited cost. In this retrospective study lenograstim was shown to be effective in the prophylaxis of chemotherapy-induced neutropenia. Gender, prior or concurrent radiation and comorbidities were prognostic factors for neutropenia. Also, secondary prophylaxis in low risk patients was cost-effective at the current official price in Cyprus.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement du cancer qui utilise la combinaison d'un photosensibilisant, de la lumière et d'oxygène moléculaire. L'application de nanosubstances liposomales pour délivrer les photosensibilisants dans la tumeur est devenu un sujet important de la recherche en PDT.La présente étude porte sur les formulations liposomales conventionnelles et stériquement stabilisées de photosensibilisant mTHPC, Foslip® et Fospeg®, dans le but de déterminer les paramètres pour l'optimisation de la PDT liposomale. La caractérisation du comportement in vitro de la mTHPC liposomale a été étudiée, particulièrement sa localisation, l'état d'agrégation et les propriétés photophysiques des drogues dans les liposomes. Nous avons démontré l'état monomérique de la mTHPC dans les vésicules lipidiques et une localisation partielle du mTHPC dans Fospeg® dans la partie PEG des liposomes, alors que la majeure partie est liée à la bicouche lipidique. Nous avons ensuite étudié les cinétiques de relargage des drogues, le mode de liaison aux protéines et la destruction des liposomes dans le sérum. Dans ce but, une méthodologie basée sur la fluorescence pour estimer le relargage de la mTHPC à la fois in vitro et in vivo a été développée. Le relargage de la mTHPC des liposomes PEGylés a été retardé par rapport aux liposomes conventionnels et la destruction des liposomes a été considérablement diminuée. La connaissance de tous ces paramètres permet de mieux prédire le taux de relargage de la drogue, les paramètres pharmacologiques et l'effet tumoricide in vivo. Le traitement PDT pourrait être plus avantageux avec le Fospeg® comparé à la mTHPC incorporée dans les liposomes conventionnels / Photodynamic therapy (PDT) is a photochemical-based modality of cancer treatment that uses a combination of a photosensitizer, light and molecular oxygen. Application of liposomal nanocarriers to deliver photosensitizers to tumor targets has become a major direction of PDT research. The present study investigates conventional and sterically stabilized liposomal formulations of the photosensitizer mTHPC, Foslip® and Fospeg®, with a view to determine the parameters for optimizing liposomal PDT. The characterization of in vitro behaviour of liposomal mTHPC was conducted, with an emphasis on drug localization, aggregation state and photophysical properties of the compounds in liposomes. We demonstrated the monomeric state of mTHPC in lipid vesicles and a partial localisation of mTHPC in Fospeg® in a PEG shell, while the main part was bound to the lipid bilayer. We further studied the drug release kinetics and binding pattern to serum proteins and the destruction of liposomes in serum. With this aim, a fluorescence-based methodology of estimating mTHPC release both in vitro and in vivo was developed, as well as an in vitro assay to characterize liposome destruction. The release of mTHPC from PEGylated liposomes was delayed compared with conventional liposomes along with greatly diminished liposome destruction. Knowledge of these parameters allows to better predict the drug release rate, pharmacological parameters and in vivo tumoricidal effect. The PDT treatment could be more advantageous with Fospeg® compared to mTHPC embedded in conventional liposomes

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus répandu dans le monde avec plus d’un million de patients diagnostiqués chaque année, dont 50% auront une évolution métastatique de leur maladie. Les récentes études pour améliorer les traitements du cancer colorectal métastatique (CCRm) ont permis le développement d’anticorps monoclonaux, le cetuximab et le panitumumab, capables d’inhiber l’activation des récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies de signalisation en aval (RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR), responsables de la croissance cellulaire, la prolifération, l’inhibition de l’apoptose, l’invasion et de l’évolution métastatique. Cependant, dans les études incluant des patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage », c’est à dire exemptes de mutation des gènes KRAS et NRAS, le taux de réponse aux thérapies à base de cetuximab ou du panitumumab sont de l’ordre de 40 à 60% seulement, ce qui signifie qu’une grande partie des patients traités échappent au traitement par le biais d’autres mécanismes. La présence d’altérations d’autres gènes comme PIK3CA, BRAF est responsable en partie des cas où les patients ne présentent pas de réponse. De plus, la surexpression ou l’altération de protéine comme PTEN, PI3K, AKT impliquées dans les voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR peuvent avoir un impact significatif sur la prolifération cellulaire ou l’apoptose. L’absence ou la surexpression des protéines sous leur forme active phosphorylée pourrait présenter un intérêt pour prédire la réponse aux anti-EGFR chez les patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage ». Dans ce travail, nous avons tout d’abord développé des techniques pour le génotypage des gènes RAS et PIK3CA à partir d’échantillons de tumeurs colorectales fixées au formol et incluses en paraffine, puis dans un second temps, nous avons validé ces méthodes selon la norme ISO 15189, puis dans un dernier temps, nous avons étudié l’expression des phosphoprotéines en aval des récepteurs à l’EGF ainsi que les statuts mutationnels des gènes KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA à partir de 100 échantillons de tumeurs congelées issues de patients atteints d’un CCRm et traités par un anti-EGFR. Sur 100 échantillons de tumeurs, 60 ne présentaient pas de mutation des gènes RAS. Parmi les patients dont les tumeurs ne présentaient pas de mutation des gènes RAS, 45,0% présentaient une réponse tumorale partielle ou complète et 55,0% étaient en maladie stable ou évolutive lorsqu’ils étaient traités par un anti-EGFR. Les patients dont les tumeurs présentaient une mutation des gènes RAS avaient une survie sans progression (PFS) significativement plus faible (HR=3.04 [1.91; 4.83];p<0.001) ainsi qu’une survie globale (OS) plus faible (HR=2.49 [1.56; 3.97];p<0.001). La PFS et la survie globale (OS) étaient significativement plus élevées chez les patients dont les tumeurs étaient « RAS sauvage ». L’expression de pAKT, pERK1/2 et pMEK1 étaient significativement plus faibles chez les patients dont les tumeurs étaient sauvages que chez les patients présentant des tumeurs RAS mutées (p=0,0246 ; p=0,004 ; p=0,0110 respectivement) et aucune différence significative d’expression entre les tumeurs RAS sauvage et RAS mutées n’a été démontrée pour pEGFR, pGSK3, pIGFR et pP90SRK. Chez les patients présentant des tumeurs RAS sauvage, le taux de réponse était significativement supérieur pour les tumeurs surexprimant pEGFR et pAKT au dessus des seuils calculés (p=0,0258 et p=0,0277 respectivement). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le taux de réponse et l’expression des autres phosphoprotéines. Notre étude montre qu’associer la mesure de l’expression des phosphoprotéines de signalisation en aval d’EGFR, à l’analyse du statut mutationnel des gènes RAS, BRAF, PIK3CA pourrait présenter un intérêt dans la prédiction de la réponse aux thérapies anti-EGFR chez les patients atteints d’un cancer colorectal métastatique / Colorectal cancer is the third most common cancer worldwide with more than one million patients diagnosed each year, among 50% will develop metastatic disease. Recent efforts to improve the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC) has led to the development of monoclonal antibodies such as cetuximab and panitumumab, that inhibit the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and its downstream pathways (namely RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT/mTOR) that promote cell growth, proliferation, inhibition of apoptosis, invasion and metastasis. However, from studies including “RAS wild-type” i.e. KRAS and NRAS wild-type tumors, the response rates to cetuximab or panitumumab therapy ranged from only 40 to 60% which results in a large fraction of patients without any known causes for treatment failure. The presence of alterations in other genes such as PIK3CA or BRAF in the EGFR-dependent signaling pathways is responsible for some of the non-responding cases. Moreover, overexpression or alterations of proteins such as PTEN, PI3K, AKT, involved in the RAS/RAF/MAPK or PI3K/AKT/mTOR signaling pathways can have a significant impact on cell proliferation or apoptosis. Absence or overexpression of proteins under their active phosphorylated forms may be of interest to predict response to anti-EGFR in RAS wild-type patients. In this work, we first developed assays to assess RAS and PIK3CA mutations in formalin fixed paraffin embedded colorectal tumors, then we validated these assays according to ISO 15189 and we finally studied expression of downstream signalling phosphoproteins and KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA status in 100 frozen samples of patients with mCRC and treated with anti-EGFR. Among the 100 tumor samples, 60 were RAS wild-type. Among the RAS wild-type patients, 45.0% achieved a complete or partial response, and 55.0% had a stable disease or progression (p<0.001) when treated with anti-EGFR. Patients with a RAS mutation had significant lower progression-free survival (PFS) (HR=3.04[1.91; 4.83];p<0.001) and overall survival (OS) (HR=2.49[1.56; 3.97];p<0.001). PFS and OS were significantly higher in RAS wild-type patients. Expression of pAKT, pERK1/2 and pMEK1 was significantly lower in RAS wild-type patients than in RAS mutated patients (p=0.0246; p=0.004; p=0.0110 respectively) and no significant difference was observed between RAS wild-type and RAS mutated tumors in the expression of pEGFR, pGSK3, pIGFR, pP70S6K and pP90SRK. In RAS wild-type patients, response rate was significantly higher for tumors that overexpressed pEGFR and pAKT above the calculated threshold (p=0.0258 and p=0.0277 respectively). No significant relation was found between response rate and the level of expression of the other phosphoproteins. Our study shows that combining the analysis of the expression of EGFR downstream signalling phosphoproteins, RAS, BRAF or PIK3CA status could be of interest to predict the response to anti-EGFR therapies in patients with mCRC

Είναι ευρέως γνωστό από παλιά ότι οι μουστάρδες του αζώτου όταν είναι συνδεδεμένες μέσω ενός εστερικού δεσμού με ένα στεροειδές μόριο ή με ένα τροποποιημένο στεροειδές, τότε εμφανίζουν μικρότερη τοξικότητα και καλύτερη αντινεοπλασματική δράση. Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε το ρόλο του στεροειδικού μορίου στην έκφραση της αντιλευχαιμικής ενεργότητας, επανασυνθέσαμε 16 ανάλογα της μουστάρδας 4-Μe-CABA και τα εξετάσαμε στη λευχαιμία Ρ388 in vivo και σε φυσιολογικά ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro. H πλειοψηφεία των εξεταζόμενων ενώσεων εμφάνισε χαμηλή τοξικότητα-χαμηλότερη τοξικότητα από αυτήν της μουστάρδας- ενώ η αντιλευχαιμική δράση αυξήθηκε σημαντικά. Όσον αφορά στις τροποποιήσεις αποδείχτηκε για μια ακόμη φορά ότι η ύπαρξη της ΝΗ-CΟ ομάδας ως εξωκυκλικό αμίδιο συνεισεφέρει σημαντικά στην δράση του μορίου μόνο όμως όταν βρίσκεται σε β-διαμόρφωση. Η μετατροπή του Β αλλά και του D στεροειδικού σκελετού σε λακταμικό ενίσχυσε την αντιλευχαιμική δράση των μορίων. Επίσης τα 7-οξειδωμένα παράγωγα αποδείχτηκαν καλύτερα από τα μη οξειδωμένα ανάλογα. Τα ευρήματα μας υποστηρίζουν ότι το στεροειδικό κομμάτι αυτών των ενώσεων δεν είναι μία απλή βιολογική πλατφόρμα όπως εικαζόταν για χρόνια. / It is commonly known that nitrogen mustards when conjugated with steroids or modified steroids via esteric bond show low toxicity and better antileukemic activity. In order to confirm the role of the steroidal moiety on the expression of anti-leukemic activity we re-synthesized 15 derivatives of the 4-Μe-CABA mustard and tested them on leukaemia P388 in vivo and in normal human lymphocytes in vitro.The majority of the tested compounds showed low toxicity while the measured antileukemic potency was significantly increased.As far as the modifications that were tested, once more it was proved that the existence of the ΝΗ-CΟ moiety when out of the ring as an amidic group contributes significantly to the activity of the molecule only if it is at axial conformation. The lactamization of the B-steroidal ring as well as the lactamization of the D-steroidal ring rendered the molecule more potent. Furthermore the 7-oxidized derivatives proved better than the non-7-oxidized derivatives. Our findings support the notion that the steroidal part of these molecules is not just a simple biological platform as has been speculated for years.

La médecine personnalisée représente une grande attente et un grand espoir dans la lutte contre le cancer. Cette approche vise à adapter les traitements aux caractéristiques personnelles du patient, principalement des biomarqueurs génétiques. Dans notre premier travail, nous avons analysé l'ensemble des médicaments approuvés par la FDA avec un biomarqueur pharmacogénétique dans leur label et montré (1) que l'oncologie représentait un tiers des médicaments avec un biomarqueur dans leur notice et (2) qu'une part importante des médicaments en oncologie mentionnaient le biomarqueur pour requérir un test avant la prescription du médicament contrairement aux autres domaines thérapeutiques. Notre deuxième travail a analysé les essais cliniques soumis à la FDA en vue de la mise sur le marché des thérapies ciblées pour lesquelles il existait une indication restreinte aux patients présentant un certain biomarqueur. Nous concluons que dans deux tiers des cas, l'utilisation du biomarqueur pour sélectionner les patients à traiter était basée sur les résultats des essais cliniques restreints aux patients biomarqueur-positifs et, qu'ainsi, il n'existait aucune donnée clinique permettant de conclure à une différence d'effet traitement selon les valeurs du biomarqueur. Pour notre troisième travail, nous avons réalisé une cartographie de l'ensemble des essais enregistrés sur le registre américain des essais cliniques pour les médicaments anti-cancéreux avec la mention d'un biomarqueur dans leur label. Nous avons mis en évidence des variations très importantes entre les médicaments quant au recours à des essais enrichis et au fait de tester un médicament dans plusieurs indications ou avec plusieurs biomarqueurs prédictifs. Dans notre quatrième travail, nous avons étudié la question du bénéfice apporté par les médicaments anti-cancéreux dans un contexte d'augmentation très importante des prix et grâce à la publication récente de deux échelles par les sociétés européenne et américaine d'oncologie (ESMO et ASCO). Nous avons analysé le bénéfice de tous les médicaments anti-cancéreux approuvés entre 2000 et 2015 pour le traitement d'une tumeur solide. Nous avons montré (1) la faible valeur des récents médicaments anti-cancéreux, (2) l'absence de relation entre le prix et la valeur de ces médicaments et (3) l'absence de différence de bénéfice entre médicaments de médecine personnalisée et médicaments classiques. En conclusion, la présence de biomarqueurs prédictifs dans le label des médicaments---souvent citée comme critère de succès de la médecine personnalisée---est pour l'instant restreinte en grande partie à l'oncologie. Le niveau de preuve pour l'utilité clinique est souvent inconnu car les études sont restreintes à un sous-groupe de patients positifs pour le biomarqueur dès les phases initiales du développement du médicament. Enfin, seul un tiers des médicaments anti-cancéreux approuvés par la FDA entre 2000 et 2015 ont un bénéfice cliniquement pertinent, sans différence de bénéfice clinique entre les médicaments avec et sans biomarqueur et sans relation entre le prix et le bénéfice de ces médicaments. / Personalized medicine represents great expectations and hopes in oncology. This approach aims to adapt treatments to the personal characteristics of the patient, mainly genetic biomarkers. In our first work, we analyzed all the FDA-approved drugs with a pharmacogenetic biomarker in their label and showed (1) that oncology represented one-third of the drugs with a biomarker in their label and (2) a significant portion of oncology drugs mentioned the biomarker to require a biomarker test, contrary to other therapeutic areas. Our second work analyzed the clinical trials submitted to the FDA for the approval of targeted therapies for which there was a indication restricted to biomarker-positive patients. We conclude that in two-thirds of the cases, the use of the biomarker to select the patients to be treated was based on the results of the clinical trials restricted to the biomarker-positive patients. Thus, in these cases, there was no clinical evidence to conclude to a treatment-by-biomarker interaction. For our third work, we mapped all the trials recorded on the US ClinicalTrials.gov registry for anti-cancer drugs with a biomarker labeling. We found very important variations between drugs in the use of enriched trials and in testing of the drug in several indications or with several predictive biomarkers. In our last work, we examined the benefit of anti-cancer drugs in a context of very significant price increases and the recent publication of two scales by the European and American oncology societies (ESMO and ASCO). We analyzed the benefit of all anti-cancer drugs approved between 2000 and 2015 for the treatment of a solid tumor. We have shown (1) the low value of recent anti-cancer drugs, (2) the lack of relationship between the price and the value of these drugs, and (3) the lack of difference of benefice between personalized and “classical” medicines. In conclusion, the presence of predictive biomarkers in the label of drugs --- often cited as a criterion of success of personalized medicine --- is, at least for now, being restricted in large part to oncology. The level of evidence for clinical utility is often unknown because studies are restricted to the subgroup of biomarker-positive patients from the initial stages of the drug development. Finally, only one third of the anti-cancer drugs approved by the FDA between 2000 and 2015 have meaningful clinical benefit and there is no difference in clinical benefit between drugs with and without biomarkers and no relation between the price and the benefit of anti-cancer drugs.

Les glycosyltransférases (GTs) sont une famille importante d’enzymes responsable de la biosynthèse des chaînes de glycosaminoglycane (GAG) des protéoglycanes, composants clés de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique cellulaire impliqués dans la communication, l'adhésion, la migration et la prolifération cellulaires. Les GTs jouent donc un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques tels que les cancers ou encore les maladies dégénératives et génétiques. Parmi ces GTs, la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) est une cible thérapeutique potentielle puisqu'elle : i) catalyse une étape précoce et majeure de la biosynthèse des chaînes de GAG, ii) est impliquée dans une forme rare de maladie génétique des tissus conjonctifs, le syndrome d’Ehlers-Danlos, iii) prend en charge des xylosides exogènes modulant son activité in vitro et in vivo. Ce travail de thèse s'organise sur une étude structure/fonction de cette enzyme afin de cerner les résidus d'acides aminés clés dans l'interaction de l'enzyme avec un substrat modèle, le 4-methylombelliferyl-ß-D-xylose (4-MOX). Les résidus Y194, Y196 et Y199 ont ainsi été identifiés comme clés dans l'architecture du site de fixation du substrat accepteur et dans l'interaction de l'enzyme avec le xyloside. Au contraire, les résidus H195, R226 et le résidu R270, muté dans la forme progéroïde du syndrome d'Ehlers-Danlos, apparaissent comme des résidus « modulant » l'activité de l'enzyme, notamment du fait d'interactions moléculaires impliquant leur squelette peptidique pour H195 et R226 et une boucle flexible pour R270. Ces travaux ont permis de guider la synthèse d’analogues xylosidiques visant à inhiber l'activité de la ß4GalT7 humaine. Parmi les propositions, un dérivé fluoré du 4-MOX apparaît comme un inhibiteur efficace de la ß4GalT7 in vitro et in cellulo. Faiblement cytotoxique, ce dérivé réduit la prolifération des cellules de lignées cancéreuses SW1353 et MB MDA 231. Ces résultats ouvrent la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant les xylosides comme agents potentiels dans le traitement de cancers ou encore des maladies génétiques des tissus conjonctifs / Glycosyltransferases (GTs) are an important family of enzymes involved in the biosynthesis of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans which are key components of cell plasma membranes and of the extracellular matrix, and are thus implicated in cell communication, adhesion, migration and proliferation. GTs are thus key players in numerous pathophysiological processes such as cancers, degenerative and genetic diseases. Among these GTs, ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) is a potential therapeutic target since : i) it catalyzes a rate-limiting step in the early phase of the GAG chains biosynthesis, ii) it is implicated in a rare genetic connective tissue disorder (Ehlers-Danlos Syndrome), iii) its in vitro and in vivo activity can be modulated by exogenous xyloside molecules. This PhD work is focused on a structure/function study of the enzyme aiming to identify key amino acid residues that interact with 4-methylumbelliferyl-ß-D-xylose (4-MUX), taken as reference substrate. Y194, Y196 and Y199 have been identified as key residues for the architecture of the acceptor substrate binding site and establish interactions with 4-MUX. By contrast, H195, R226 and R270, a residue mutated in the progeroid form of Ehlers-Danlos Syndrome, should rather be considered as “modulating” residues towards the ß4GalT7 activity, H195 and R226 interacting with 4-MUX with their polypeptide backbone, and R270 via a flexible loop. This work guided the design of xylosidic compounds that would potentially inhibit the ß4GalT7 activity. Thus, a fluorinated derivative of 4-MUX appeared as an efficient in vitro and in cellulo inhibitor of the enzyme. Poorly cytotoxic, this compound also reduced the proliferation rate of cancer cells SW1353 and MB MDA 231. Altogether, these results offer new therapeutic strategies using xylosides as potential therapeutic agents in the treatment of cancer or rare genetic disorders

La mise en évidence de la variabilité pharmacocinétique et/ou pharmacodynamique permet l’optimisation de l’utilisation des cytotoxiques. L’association des thérapies ciblées à la chimiothérapie conventionnelle peut apporter des avantages supplémentaires en termes de bénéfice thérapeutique, mais aussi peut provoquer des interactions médicamenteuses et augmenter les variabilités interindividuelles. Les interactions médicamenteuses sont maintenant connues pour avoir un impact significatif sur l'élimination des médicaments.Le premier volet de ces travaux consiste à mesurer les concentrations sanguines de deux molécules (le lapatinib et la vinorelbine) chez les patientes et à les utiliser pour la modélisation pharmacocinétique. Cette modélisation a clairement montré l’influence du poids et du nombre des plaquettes sur la pharmacocinétique de la vinorelbine permettant ainsi de diminuer les variabilités pharmacocinétiques. Elle a également mis en évidence l’influence du lapatinib sur la pharmacocinétique de la vinorelbine. Cependant, compte tenu de l’absence de groupe témoin, nous n’avons pas réussi à obtenir une significativité statistique pour ces résultats. En parallèle, aucune influence de la vinorelbine sur le comportement pharmacocinétique du lapatinib n’a été mise en évidence.Le second volet concerne la modélisation de la réponse et de la tolérance des patientes pour cette association médicamenteuse (modélisation pharmacodynamique). La neutropénie est la toxicité dose-limitante et comme le lapatinib n’est pas connu pour être myélotoxique, nous avons modélisé cette toxicité par rapport au comportement pharmacocinétique de la vinorelbine. Là encore, nous avons observé une très forte tendance quant à l’influence du lapatinib sur la myélotoxicité de la vinorelbine. Concernant l’efficacité de cette association, la modélisation de l’évolution de la croissance tumorale a mis en évidence une synergie d’action entre ces deux molécules. A notre connaissance c’est la première fois qu’une telle modélisation tant du point de vue de la tolérance que de celui de la réponse, est réalisée lors d’une association de chimiothérapie classique et d’une thérapeutique ciblée.La modélisation PK-PD de population des médicaments anticancéreux peut apporter une aide précieuse aux cliniciens dans ce domaine. Elle peut également être essentielle dans la prise de décision clinique précoce. / The identification of sources of pharmacokinetic and / or pharmacodynamic variabilities, optimizes the use of cytotoxic agents. The combination of targeted therapies with conventional drugs may provide additional benefits in terms of therapeutic benefit, but also can cause drug interactions and increased variability. Drug interactions are known to have a significant impact on drug disposition.The first part of this work is to measure blood concentrations of two molecules (lapatinib and vinorelbine) in patients and to perform pharmacokinetic modeling. This modeling clearly showed the influence of weight and the platelet number on the pharmacokinetics of vinorelbine reducing thereby the pharmacokinetic variabilities. It also highlighted the influence of lapatinib on the pharmacokinetics of vinorelbine. However, due to the lack of control group, we failed to obtain statistical significance for these results. In parallel, no effect of vinorelbine on the pharmacokinetics of lapatinib has been detected.The second part concerns the modeling of the response and tolerance of patients for this drug combination (pharmacodynamic modeling). Neutropenia was detected as the dose-limiting toxicity of the combination and the fact that lapatinib is not known to be myelotoxic, we performed toxicity modeling based on the pharmacokinetics of vinorelbine. Again, we observed a strong tendency on the influence of lapatinib on the myelotoxicity of vinorelbine. Regarding the efficacy of this combination, tumor growth modeling showed a synergistic action between the two molecules. To our knowledge this is the first time that such a model, both in terms of tolerance and response, is implemented in a combination of conventional chemotherapy and targeted therapy.Population PK-PD modeling of cancer drugs can provide valuable assistance to clinicians in this field. It can also be essential in the early clinical decision making.

La surexpression du récepteur EGFR a un rôle majeur dans le développement des carcinomes des voies aérodigestives supérieures (VADS) et son inhibition par les anticorps anti-EGFR (cetuximab) induit un effet anti-tumoral mais pourrait également avoir un effet anti-angiogénique. Cependant, les effets de ces agents sur l'angiogenèse et les cellules endothéliales (CE) n'ont pas réellement été évalués. L'objectif de ce travail est d'étudier l'angiogenèse induite par les molécules libérées par les cellules tumorales des VADS (Cal27, FaDu) dans les milieux de culture en présence ou non de cetuximab, appelés milieux conditionnés (CM). Le cetuximab n'a pas d'effet direct significatif sur les CE. Il induit une diminution de la sécrétion de VEGF par les cellules tumorales mais paradoxalement, les CM obtenus induisent un effet pro-angiogénique. L'analyse de la composition des CM ne permet pas d'identifier de molécule clé responsable de cet effet, le cetuximab diminuant à la fois la sécrétion tumorale des facteurs pro- et anti-angiogéniques. Pour expliquer ce paradoxe et en accord avec la littérature, nous avons mis en évidence une libération de microvésicules par nos cellules tumorales (TMV), TMV exprimant EGFR et TF, et une régulation de cette libération et de leur contenu par le cetuximab. Ces TMV peuvent interagir avec les CE et le cetuximab favoriserait cette interaction. La caractérisation de ces TMV et leur rôle dans le processus angiogénique en réponse ou non au cetuximab permettront dans le futur de comprendre la réelle activité des anticorps anti-EGFR sur l'angiogenèse / Overexpression of EGFR has a major role in the development of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its inhibition by anti-EGFR antibodies (cetuximab) induced an anti-tumor effect but could also induce an anti-angiogenic effect. However, the effects of these agents onto angiogenesis and endothelial cells (EC) have not really been evaluated. The objective of this work is to study angiogenesis induced by mediators released by head and neck squamous carcinoma cells (Cal27, FaDu) in culture media with or without cetuximab exposure, known as conditioned media (CM). Cetuximab has no significant direct effect on EC. It induces a decrease in the secretion of VEGF by tumor cells but, paradoxically, the CM induces a pro-angiogenic effect. The analysis of the composition of the CM does not allow us to identify a key molecule responsible for this effect because cetuximab decreases the secretion of both pro- and anti-angiogenic factors by tumor cells. To explain this paradox and in agreement with the literature, we highlighted the release of microvesicles by our tumor cells (TMV), TMV which express EGFR and TF, and regulation of this release and the content of TMV after cetuximab exposure. These TMV may interact with the EC and cetuximab increases this interaction. Further characterization of TMV and studying their role in the angiogenic process in response to cetuximab will allow us in the future to understand the real activity of anti-EGFR antibodies onto angiogenesis

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme et constitue un véritable problème de santé publique. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la caractérisation des principales voies de signalisation et ont mis en évidence l'implication majeure de la signalisation cellulaire dans les processus de cancérogenèse. Des cibles moléculaires ont ainsi été identifiées et ont permis le développement de thérapeutiques dites ciblées, telles que les anticorps monoclonaux ou encore les inhibiteurs de kinase. Malgré ces avancées considérables qui ont permis l'amélioration de la prise en charge des patientes, on constate l'apparition de résistances aux traitements. Ce travail avait pour objectifs d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de déterminer leur signification clinique, leur intérêt théranostique ainsi que leur impact sur la réponse aux traitements. Dans un premier temps nous avons étudié les mutations activatrices du gène PIK3CA. Ces mutations sont retrouvées dans 25% des cancers du sein et sont impliquées dans la résistance au trastuzumab, aux anti-œstrogènes et aux inhibiteurs de mTOR. 149 échantillons de tumeurs de sein infiltrantes ont été analysés par une technique de PCR-HRM (High Resolution Melting) et 118 échantillons par une technique de PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Les résultats des 2 techniques étaient concordants (k=0,845 ; p<0,001) et une relation entre mutations du gène PIK3CA et grade SBR a été mise en évidence, les tumeurs de grade SBR III étant moins fréquemment mutées que les autres (p=0.025 en HRM et p=0.009 en ARMS). Dans un second temps, notre travail a consisté en l'exploration fonctionnelle des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases et P38MAPKinase. Pour cela nous avons analysé le niveau d'expression des phosphoprotéines p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1/2, p-P90RSK, p-IGF1R ainsi que p-P38MAPK par immuno-analyse multiplexe. Cette partie a comporté 3 études. Une première étude rétrospective sur 45 échantillons de tumeurs mammaires invasives congelées a mis en évidence des niveaux d'expression de P38 et de p-P38 plus élevés dans les tumeurs RE+. La deuxième étude était une étude prospective visant à déterminer des biomarqueurs de réponse à l'association trastuzumab-évérolimus chez des patientes présentant un cancer du sein précoce traitées en préopératoire. Cette étude a révélé une augmentation statistiquement significative du niveau d'expression de p-MEK1 (p=0.012), p-ERK1/2 (p=0.003) et p-P38MAPK (p<0.001) dans le bras de traitement associant l'évérolimus au trastuzumab qui pourrait s'expliquer par la suppression par l'évérolimus d’une boucle de rétrocontrôle négatif contrôlant l'activation de la voie RAS/RAF/MAPKinases. Dans le bras de traitement évaluant le trastuzumab seul, aucune variation du niveau d'expression des phosphoprotéines n'a été mise en évidence, y compris en aval du récepteur HER2, ce qui soulève l'hypothèse d'un mécanisme d'action prédominant immunologique du trastuzumab. La troisième étude qui comparait l'impact du trastuzumab in vitro et en situation clinique confirme la différence des mécanismes d'action mis en jeu en fonction des conditions cellulaires et cliniques. Dans son ensemble, ce travail a mis en évidence que la détermination du statut mutationnel du gène PIK3CA et du niveau d’expression des phosphoprotéines pourrait être utile à une meilleure caractérisation moléculaire des cancers du sein et à l’optimisation de la personnalisation des prescriptions de thérapies ciblées / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and is a real public health problem.Advances in molecular biology have allowed the characterization of the major signaling pathways and revealed their major implication in carcinogenesis processes. Molecular targets have been identified and have enabled the development of targeted therapies, such as monoclonal antibodies, or kinase inhibitors. Despite these considerable advances that have improved the care of patients, emerging of resistance to treatments has been observed. The aim of this work was to identify new tumor biomarkers and determine their clinical significance, their theranostic interest and their impact on the response to targeted therapies. Initially, we studied the activating mutations of the PIK3CA gene. These mutations are found in 25% of breast cancers and are involved in resistance to trastuzumab, antiestrogens and mTOR inhibitors. We analyzed 149 invasive breast tumor samples for PIK3CA gene mutations by PCR-HRM (High Resolution Melting) and 118 by PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). The results achieved with the 2 techniques were consistent (k = 0.845; p <0.001) and a relationship between PIK3CA mutations and grade SBR was highlighted with a lower occurrence of mutations in SBR grade III tumors (p=0.025 in HRM and p=0.009 in ARMS). Secondly, we investigated the functional alteration of PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases and P38MAPKinase signaling pathways. We have analyzed the expression level of phosphoproteins p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1 / 2, p-P90RSK, p-IGF1R and p-p38MAPK by multiplex immunoanalysis. This part includes 3 studies. The first study was a retrospective study of 45 frozen samples of invasive breast tumors in which we observed that the level of expression of P38 and p-P38 was higher in the ER + tumors. The second study was a prospective study to identify biomarkers of response to trastuzumab-everolimus association in patients with early breast cancer treated preoperatively. This study showed a statistically significant increase of the expression level of p-MEK1 (p = 0.012), p-ERK1/2 (p = 0.003) and p-p38MAPK (p<0.001) in arm treated by trastuzumab associated with everolimus. It could be explained by the repression of a negative feedback loop involving S6K, PI3K and RAS by everolimus, leading to the activation of RAS/RAF/MAPKinases signaling pathway. In the control arm investigating trastuzumab alone, no significant variations of the level of expression of phosphoproteins was demonstrated, raising the hypothesis of the implementation of a predominant immunological mechanism of action for Trastuzumab. The third study that compared effect of trastuzumab in vitro and in clinical setting confirms that trastuzumab has different modes of action when evaluated in cells and in clinical conditions. As a whole, this work showed that determining the mutation status of PIK3CA and the expression level of phosphoproteins could be useful to refine the molecular characterization of breast cancers and optimize the criteria used to personalize the prescription of targeted therapies