No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

Sports persons abuse androgenic-anabolic steroid (AAS) for cosmetic reasons (Pope et al., 2000) and to improve muscle mass and strength (Bhasin et al., 1996) with the intention of improving performance. MS abuse causes physiological and psychological dependence (Brower et al., 2002) and adverse cardiovascular effects (Graham et al., 2006b). sports persons also abuse recombinant human (rh) growth hormone (GH) and insulin for similar reasons and because it is still undetectable by urinalysis (Powrie et al., 2007). The purpose of this thesis was to determine the prevalence of abuse of rhGH and insulin with the intention of identifying any adverse physiological and haematological effects. The first study consisted of a questionnaire design that attempted to discover the prevalence of abuse of AAS. From the distribution of 210 questionnaires (response rate 70%) it was concluded that there were increases in the abuse of the drugs, growth hormone (24%) and insulin (14%) in comparison to earlier findings (Grace et al., 2001r The purpose of the second study was to investigate the effects of 30 days rhGH administration (0.013 mg.kg -I, n=36) in an abstinent AAS group (rhGH) compared with an exercise control group (BC) and a sedentary control group (SC). Packed cell volume (PCV) significantly decreased within the rhGH group (0.47±0.03 vs. 0.45±0.02, ratio; P<0.05) and was significantly greater than BC pre-rhGH administration (month 1; 0.47±0.03 vs. 0.44 ± 0.01; P<0.05). Triglycerides significantly decreased within the rhGH group (1.74 ± 0.4 vs. 1.4 ± OJ, mmol/L; P<0.05) and significantly decreased compared with SC on-rhGH administration (month 2; 1.4 ± 0.3 vs. 2.0 ± 0.6, mmol/L; P<0.05). The third study assessed the effects of 30 days insulin administration (0.12 IU.kg -I, n=36) in an abstinent AAS group (I-group) compared with an BC group and an SC group. Body mass index (BMI) significantly increased within the I-group (30.8 ± 3.2 vs. 31.2 ± 3.2, kg.m", P<0.05). PCV significantly increased within the I-group (0.45 ± 0.01 vs. 0.47 ± 0.02, ratio; P<0.05) and was significantly increased compared with BC on-insulin administration (month 2; 0.47 ± 0.02 vs. 0.44 ± 0.01, ratio; P<0.05). Triglycerides significantly increased within the I-group (1.78 ± 0.5 vs. 1.94 ± 0.5, mmol/L; P<0.05). Maximum inspiratory pressure (MIP) significantly increased within the I-group (MIP: 117 ± 32 vs. 122 ± 28, cm.H20; P<0.05). The fourth study assessed the effects of 30 days rhGH (0.017 mg.kg -1.dai1) and insulin (0.13 IU.kg -1, n=36) in an abstinent AAS group (rhGH-&-I group) compared with an BC group and anSCgroup. The arterial pulse wave velocity (APWV) significantly increased in the lower limb pre-occlusion velocity in the rhGH-&-I group compared with the BC group on rhGH-&-I administration (month 2; 10.8 ± 1.7 vs. 9.6 ± 0.9, m.s', P<0.05). The fifth study assessed the effects of 6 days rhGH administration (0.019 mg.kg -l.dail, n=48) in an abstinent AAS group (rhGH) compared with an abstinent AAS control group (C). Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) questionnaire significantly decreased in both anxiety (A) and depression (D) symptoms within the rhGH group (A: 6.8 ± 4.5 vs. 3.6 ± 3.5 vs. 4.1 ± 3.1; D: 4.5 ± 4.7 vs. 1.5 ± 2.5 vs. 2.5 ± 3.0, P<0.017) and compared with the C group (A: 3.6 ± 3.5 vs. 5.3 ± 2.1; D: 1.5 ± 2.5 vs. 3.0 ± 2.8, P<0.05). Body fat significantly decreased within the rhGH group (19.2 ± 6.3 vs. 20.2 ± 6.2, %, P<0.017). Resting heart rate (HR) and resting rate pressure product (RPP) significantly increased compared with the BC group (HR: 78 ± 11 vs. 67 ± 16, bpm; RPP: 97 ± 14 vs. 84 ± 24, bpm.mm.Hg X 10-2, P<0.05). APWV, lower limb pre-occlusion velocity, homocysteine (HCY) and C reactive protein (CRP) concentrations all significantly decreased within the rhGH administration group (APWV: 9.97 ± 1.38 vs. 9.18 ± 1.6, m.s"; HCY: 13.2 ± 4.0 vs. 11.5 ± 3.0, umol/L; CRP: 1.77 ± 2.1 vs. 1.26 ± 1.5 vs., mg/L, all P<0.017). Forced expiratory volume in 1 second/forced vital capacity (FEV I/FVC), MIP and maximum epiratory pressure (MEP) all significantly increased compared with the C group (FEV1/FVC: 85 ± 6 vs. 82 ± 5, %; MIP: 144 ± 24 vs. 129 ± 28, L; MEP: 179 ± 35 vs. 157 ± 32, L, all P<0.05). Strength (one repetition maximum; bench press [BePr] and squat [S]) and power (high intensity cycle ergometry) all significantly increased within the rhGH group (BePr: 106 ± 18 vs. 113 ± 19, S: 143 ± 27 vs. 164 ± 26, kg; Power: 1345 ± 216 vs. 1466 ± 257 vs. 1497 ± 253, W, all P<0.017) and BePr and S significantly increased compared with the C group (BePr; 113 ± 19 vs. 97 ± 24, kg; S; 164 ± 26 vs. 141 ± 34 kg, both P<0.05). Serum insulin-like growth factor (IGF-1) significantly increased within the rhGH group (159 ± 54 vs. 317 ± 91, ng.ml", P<0.017) and compared with the C group (317 ± 91 vs. 169 ± 50, ng.ml", P<0.05). RhGH administration for 30 days, in a dosage of 0.013 mg.kg -1.d-1, in abstinent AAS using weight lifters, appeared to offer no improvements in strength, but suggested an improvement in the specific cardiovascular risk marker, triglycerides. Insulin administration, for 30 days, in a dosage of 0.12 IU.kg -\, appeared to precipitate an adverse effect on the blood viscosity and lipoprotein profile, which may have a deleterious effect on an individual's risk of atherogenesis. The combination of rhGH-&-I, for 30 days, appeared to cause a significant increase in APWV, which may significantly increase cardiovascular risk in otherwise apparently healthy individuals However, 6 days use of rhGH in a dosage of 0.019 mg.kg -1.dai1 in apparently healthy abstinent AAS dependents, appeared to improve psychological profiles, alter body composition favourably, improve specific cardiovascular risk markers, improve respiratory function and increase strength and power. This suggested that the effects are dosage and time dependent. Despite this, the increase in resting heart rate and RPP may have an adverse effect on the cardiovascular system. Further work is required to establish any long term adverse effects before such therapy could be offered as a replacement treatment from AAS dependency.

In recent years, nutraceuticals and functional foods have attracted considerable interest as potential alternative therapies for treatment of hypertension, especially for pre-hypertensive patients. Researches to date on a new technology suitable for production of hydrolysate have gained in importance. Currently, most hydrolysates are produced in a batch reactor followed by , subsequent purification technologies. Here, we present the findings of an integrative process that contains anion exchange adsorber in a stirred tank reactor fitted with micro filtration membrane for the production of ACE inhibitory hydrolysates. The adsorption kinetics and capacity were first elucidated using a standard solution of β- lactoglobulin. Higher binding capacity with short adsorption time was achieved because of strong electrostatic and hydrophobic interactions. In the case of β-lactoglobulin from whey, the adsorption capacity decreased because of the presence of ions and other whey proteins. However, a higher recovery of β-lactoglobulin (98%) and casein derived peptides (CDP) (76%) was achieved while only 21 % for α-lactalbumin. The hydrolysis of the proteins while bound could result in two different hydrolysates enriched in ACE inhibitory peptides; one from CDP at 2 h (IC50=288 μg/ml) and the other one from β-lactoglobulin after removing the 2 h hydrolysate. The eluted hydrolysate fraction also had antioxidant activity; this could lead for the production of hydrolysates with different functionality in a single production process. The 2h hydrolysate contained the well-known and widely studied potent antihypertensive tri- peptide IPP and several other novel peptides. Ten major peptides from the β-lactoglobulin hydrolysate were also identified. Two of the peptides lIAE and KPTPEGDLEILL were the most abundant and have structural similarity with other ACE inhibitory peptides. Particularly, the C- terminal sequence of the tetrapeptide lIAE has structural similarity with that of micro algae derived tripeptide lAB (IC50=34.7μM). This peptide could be the main contributor for the bioactive potency of this hydrolysate. Furthermore, the simulated gastrointestinal digestibility study demonstrated the bioactivity of the hydrolysates did not change. The in-silico digestibility study of individual pep tides indicated most of the peptides were stable or cleaved only partially without affecting their C-terminal sequences. This is an interesting outcome and further investigation was conducted after scaling-up the process. These scale-up hydrolysate products were then spray dried to study the sensory attributes and the impact of processing in bioactivity. No significant changes were observed in both studies. Furthermore, the same bioactivity was achieved comparing the scale-up and lab scale hydrolysates. In conclusion, this process was successfully investigated and proved to have several benefits. In this context, the results of this study provided several interesting evidence giving some new insights about various different aspects: (i) produce two different ACEi hydrolysates; (ii) the non-hydrolyzed substrate, less active ACEi and bitter causing peptides remain adsorbed on the resin and resulted partial fractionation; (iii) high stability of residual enzyme activity; (iv) the adsorbed hydrolysate fraction (elute) showed antioxidant activity that might be very effective to promote the production of both ACE inhibitory and antioxidant hydrolysates in a single production process; (vi) the in-vitro simulated digestibility study demonstrated the stability of the bioactivity after digestion.

No description available.

No description available.

Οι σύγχρονες στρατηγικές στην ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων στοχεύουν, κατά κύριο λόγο, σε καλά χαρακτηρισμένους μοριακούς στόχους με σκοπό την επαγωγή ή την αναστολή συγκεκριμένων βιολογικών δράσεων και τον περιορισμό ανεπιθύμητων παρενεργειών. Έναν ανάλογο μοριακό στόχο αποτελεί η διαλυτή γουανυλική κυκλάση (sGC), η οποία βρίσκεται στο επίκεντρο του ερευνητικού ενδιαφέροντος την τελευταία δεκαετία. Παρόλο που ανακαλύφθηκε περίπου πριν από τέσσερις δεκαετίες ως μέλος της οικογένειας των κυκλασών, η έρευνα που ακολούθησε την ανακάλυψή της δεν χαρακτηρίστηκε από την ίδια πρόοδο που χαρακτήρισε έναν άλλο εκπρόσωπο της ίδιας οικογένειας, την αδενυλική κυκλάση. Μερικοί από τους λόγους της περιορισμένης μελέτης της sGC συνοψίζονται στην χαμηλή ενδοκυτταρική της συγκέντρωση, που συνεπάγεται δυσκολίες στην απομόνωση, στον καθαρισμό και το χειρισμό της, και στην έλλειψη ενός αποτελεσματικού συστήματος έκφρασής της. Επιπρόσθετα, μόνο μετά την ανακάλυψη του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), την αναγνώρισή του ως σηματοδοτικό μόριο καθώς και την ταυτοποίησή του ως τον EDRF στα τέλη της δεκαετίας του ’80, πραγματοποιήθηκε ουσιαστική πρόοδος στον τομέα των βιολογικών δράσεων της sGC. Ο καθαρισμός του ετεροδιμερούς ενζύμου και η ανακάλυψη ενός μορίου αίμης ανά διμερές έθεσε τη βάση για την αποσαφήνιση του μηχανισμού ενεργοποίησης της sGC από το ΝΟ και την ακόλουθη κατάλυση της μετατροπής του GTP σε κυκλικό GMP, αν και ο ακριβής μηχανισμός παραμένει μέχρι σήμερα άγνωστος. Η ταυτοποίηση, επομένως, του σηματοδοτικού μονοπατιού NO/sGC/cGMP αποτέλεσε τη βάση για την ανακάλυψη ότι φάρμακα όπως τα οργανικά νιτρώδη, που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της στηθάγχης για περισσότερο από έναν αιώνα, δρουν στην ουσία ως δότες μονοξειδίου του αζώτου μέσω βιομετατροπής τους και ασκούν τη δράση τους μέσω ενεργοποίησης της sGC και παραγωγής, ακολούθως, του δεύτερου αγγελιοφόρου cGMP. Tα παραπάνω δεδομένα οδήγησαν στον προσδιορισμό του ΝΟ ως σημαντικού σηματοδοτικού μορίου στη φυσιολογία καταρχήν του καρδιαγγειακού συστήματος. Η πρόοδος που ακολούθησε τη μελέτη του sGC-cGMP μονοπατιού αποκάλυψε την ευρεία παρουσία του ενζύμου σχεδόν σε όλα τα κύτταρα των θηλαστικών και την εμπλοκή του σε ουσιαστικές φυσιολογικές λειτουργίες, όπως την καρδιακή ομοιόσταση, τη χάλαση αγγειακών και μη λείων μυικών ινών, την αναστολή της συσσώρευσης/συγκόλλησης αιμοπεταλίων, την περιφερειακή και κεντρική νευροδιαβίβαση, την ανοσολογική απόκριση, τη μεταγωγή του οπτικού ερεθίσματος, ενώ παρουσιάζει και ρυθμιστική δράση στο γαστρεντερικό και ουρογεννητικό σύστημα. Ταυτόχρονα, απορρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού έχει διαπιστωθεί να εμπλέκεται στην φυσιολογία και την εξέλιξη συγκεκριμένων παθολογικών καταστάσεων όπως αρτηριακή και πνευμονική υπέρταση, καρδιακή ανεπάρκεια, αρτηριοσκλήρυνση και θρόμβωση, διαβήτης, νεφρική ίνωση και ανεπάρκεια, φλεγμονώδεις και νευροεκφυλιστικές παθήσεις, γαστρεντερικές διαταραχές, σήψη και καρκίνος, όπου εντοπίζεται είτε να υπερλειτουργεί είτε να υπολειτουργεί. Εξαιτίας της σπουδαιότητας και της σοβαρότητας των καρδιαγγειακών παθήσεων, όπου το σηματοδοτικό μονοπάτι υπολειτουργεί, το μεγαλύτερο κομμάτι της έρευνας που ακολούθησε σχετικά με την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων εστίασε κυρίως στην ανάπτυξη αγωνιστών της sGC, παρέχοντας όχι μόνο ΝΟ-δότες με βελτιωμένες ιδιότητες αλλά, επιπρόσθετα, δύο νέες κατηγορίες ΝΟ-ανεξάρτητων ενεργοποιητών που περιλαμβάνουν διακριτές δομικά ενώσεις. Η πρόοδος, ωστόσο, στην αναστολή του ενζύμου κρίνεται εμφανώς υποδεέστερη, παρόλη την προφανή σπουδαιότητα ανάλογων ενώσεων στη διερεύνηση των cGMP-εξαρτώμενων βιολογικών δράσεων. Μεταξύ διάφορων ενώσεων, όπως οργανικών φωσφορικών ενώσεων, νουκλεοτιδικών αναλόγων, πορφυρινικών παραγώγων και άλλων, ο περισσότερο ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα είναι το ODQ, το οποίο θεωρείται ότι δρα μέσω οξείδωσης του σιδήρου της αίμης με αποτέλεσμα την απώλεια της ικανότητας ενεργοποίησης του ενζύμου από το ΝΟ. Το μειονέκτημα του ODQ, ωστόσο, να δρα in vivo και σε άλλες αιμοπρωτεΐνες περιορίζει την εφαρμογή του και καθιστά επιτακτική την ανάγκη ανακάλυψης νέων εκλεκτικών αναστολέων. Σε αυτά τα πλαίσια, στόχο της παρούσας μελέτης αποτελεί ο σχεδιασμός, η σύνθεση και η βιολογική αποτίμηση νέων πιθανών αναστολέων της sGC. Με βάση τη χημική δομή του ODQ, ως την ένωση-οδηγό, σχεδιάστηκαν νέα τρικυκλικά ανάλογα του βασικού σκελετού του ινδολίου και του διϋδροϊνδολίου. Η επιλογή του ινδολικού δακτυλίου έναντι του κινοξαλινικού σκελετού του ODQ πραγματοποιήθηκε με στόχο να διερευνηθεί κατά πόσο ο νέος σκελετός θα έχει επίδραση στη διατήρηση ή/και την ενίσχυση της ανασταλτικής δράσης έναντι της sGC. Επιπρόσθετα, η επιλογή του διϋδροϊνδολικού σκελετού αποσκοπούσε στη διερεύνηση της επίδρασης που μπορεί να έχουν μη επίπεδες ενώσεις έναντι του επίπεδου ODQ. Ταυτόχρονα, σχεδιάστηκε μία σειρά ετεροκυκλικών δακτυλίων προσδεδεμένων στους βασικούς σκελετούς, διαφορετικών από το δακτύλιο οξαδιαζολόνης του ODQ, ώστε να εξετασθούν πιθανές διαφορές της τελικής δράσης σε συνάρτηση με δομικές διαφορές των τρίτων δακτυλίων. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της συνθετικής μεθοδολογίας για την παραλαβή τόσο των τελικών προϊόντων όσο και σημαντικών ενδιάμεσων ενώσεων ως συνθετικών ενδιαμέσων για τη μελλοντική σύνθεση τροποποιημένων παραγώγων. Η σύνθεση των τελικών διϋδροϊνδολικών αναλόγων πραγματοποιήθηκε με κυκλοποίηση μέσω επίδρασης υδροξυλαμίνης ή διάφορων υδραζινών σε α-υδροξυμεθυλεν-κετο- ενδιάμεσα παράγωγα, τα οποία παραλήφθηκαν από τα αντίστοιχα 4-κετο-τετραϋδροϊνδολικά παράγωγα με την επίδραση μυρμηκικού αιθυλεστέρα. Τα αντίστοιχα ινδολικά τρικυκλικά προϊόντα συντέθηκαν από τα διϋδροϊνδολικά υπό συνθήκες αφυδρογόνωσης με επίδραση DDQ. Εξαιτίας των πειραματικών συνθηκών που εφαρμόζονται για την παραλαβή των συνθετικών ενδιαμέσων, κρίθηκε απαραίτητη για την εξέλιξη του συνθετικού σχήματος η προστασία, προηγουμένως, του πυρρολικού αζώτου με την κατάλληλη ομάδα. Με στόχο τη διερεύνηση της επίδρασης που μπορεί να έχει στην τελική βιολογική δράση η παρουσία ελεύθερου –ΝΗ στον πυρρολικό δακτύλιο, κρίθηκε σκόπιμη η αποπροστασία των τελικών προϊόντων. Παρόλο που εξετάσθηκε ποικιλία προστατευτικών ομάδων και συνθηκών αποπροστασίας, τα διϋδροϊνδολικά τρικυκλικά προϊόντα αποδείχτηκαν ασταθή. Κατέστη εφικτό να απομακρυνθεί μόνο μία προστατευτική ομάδα, η SEM ομάδα, και μόνο από τα πλήρως αρωματοποιημένα ινδολικά προϊόντα, τα οποία απδείχτηκαν σταθερότερα. Σύμφωνα με την παραπάνω μεθοδολογία συντέθηκαν 24 τελικά προϊόντα, από τα οποία 14 είναι διϋδροϊνδολικά παράγωγα και 10 ινδολικά, ενώ από τα τελευταία τα τρία φέρουν ελεύθερο πυρρολικό –ΝΗ. Εκτός από τα τελικά προϊόντα κατέστη εφικτό να συντεθούν και σημαντικά συνθετικά ενδιάμεσα. Τα α-μεθοξυ και α-αιθοξυκαρβονυλο- 4- ή 7-οξοτετραϋδροϊνδολικά παράγωγα παραλήφθηκαν με εφαρμογή διαφορετικής πειραματικής μεθοδολογίας και συντέθηκαν, επιπρόσθετα, τα α-υδροξυμεθυλεν-4-οξο-τετραϋδροϊνδολικά παράγωγα. Τα προαναφερθέντα συνθετικά ενδιάμεσα δύνανται να οδηγήσουν σύμφωνα με διαφορετικά συνθετικά σχήματα σε νέα τρικυκλικά ανάλογα. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι πειραματικές συνθήκες κάθε σταδίου της μεθοδολογίας με σκοπό τη βελτιστοποίηση των τελικών αποδόσεων. Μερικά από τα τελικά τρικυκλικά ανάλογα, τα οποία δεν έφεραν υποκατάσταση στις θέσεις 2- και 3- του πυρρολικού δακτυλίου, προωθήθηκαν σε in vitro βιολογικές μελέτες. Εξετάστηκαν, καταρχήν, όσον αφορά την ικανότητά τους να αναστέλουν την επαγόμενη από νιτροπρωσσικό νάτριο δραστηριότητα της sGC σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις, 1 μΜ και 100 μΜ. Όλες οι υπό μελέτη ενώσεις αποδείχτηκαν αναστολείς του ενζύμου και παρουσίασαν ισχυρότερη δράση, με μία εξαίρεση, στην υψηλότερη συγκέντρωση. Οι ενώσεις 74 και 81 αποδείχτηκαν οι ισχυρότεροι αναστολείς με δοσοεξαρτώμενη δράση. Η ένωση 81 εξετάστηκε στη συνέχεια όσον αφορά στην εκλεκτικότητά της για την sGC σε μία μελέτη που περιελάμβανε επαγόμενη από τον ANF παραγωγή cGMP. Από την τελευταία μελέτη αποδείχτηκε ότι η παραπάνω ένωση δεν αναστέλει τις pGCs, υποδεικνύοντας ότι πιθανότατα η νέα σειρά ενώσεων δεν επιδρά στα άλλα μέλη της οικογένειας των κυκλασών, τις pGCs και τις ACs, και παρέχοντας μια ένδειξη για πιθανό μηχανισμό δράσης παρόμοιο με αυτό του ODQ. Η τελευταία υπόθεση ενισχύεται και από το γεγονός ότι οι υπό μελέτη ενώσεις δεν μεταβάλλουν τη βασική δραστηριότητα της sGC. Τα αποτελέσματα των πρωταρχικών βιολογικών μελετών επαληθεύουν τον κύριο στόχο της παρούσας μελέτης που ήταν η σύνθεση νέων αναστολέων της sGC. Η επιλογή του ινδολικού δακτυλίου, ως τον βασικό σκελετό των νέων ενώσεων, επιβεβαιώνει την υπόθεση του αρχικού σχεδιασμού, παρέχοντας αναστολείς με νέα δομικά χαρακτηριστικά. Πρώιμες μελέτες δομής-δράσης επισημαίνουν τη βελτιωμένη δράση που παρουσιάζουν τα επίπεδα ινδολικά προϊόντα έναντι των μη επίπεδων διϋδροϊνδολικών, αν και δεν είναι ακόμη δυνατό να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα σχετικά με την επίδραση της δομής του τρίτου ετεροκυκλικού δακτυλίου. Περαιτέρω βιολογική αποτίμηση των υπόλοιπων προϊόντων της μελέτης καθώς και σύνθεση νέων τροποποιημένων αναλόγων θα εξυπηρετήσει την εξαγωγή λεπτομερέστερων συμπερασμάτων από μελέτες χημικής δομής-βιολογικής δραστικότητας και, πιθανότατα, την ανακάλυψη νέας ένωσης-οδηγού στο πεδίο της αναστολής της sGC. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από την παρούσα μελέτη όσον αφορά στη χημική σύνθεση ενδιαμέσων και τελικών προϊόντων αλλά και στη βιολογική αποτίμηση επιλεγμένων τελικών ενώσεων μπορούν να αποδειχτούν χρήσιμο εργαλείο για το μελλοντικό σχεδιασμό, εφαρμογή και σύνθεση νέων ενώσεων με τα απαραίτητα χαρακτηριστικά για αποτελεσματική αναστολή της sGC. Ανάλογες ενώσεις είναι δυνατό να αποδειχτούν όχι μόνο χρήσιμα πειραματικά εργαλεία αλλά και βιοδραστικά μόρια με πιθανή κλινική εφαρμογή σε συγκεκριμένες παθολογικές καταστάσεις, όπου η sGC υπερλειτουργεί, όπως στη σήψη. / Modern strategies in the field of drug discovery and development of new therapeutic agents are aiming mostly at well-characterized molecular targets in order to stimulate or inhibit specific biological actions without undesirable side-effects. Soluble guanylate cyclase (sGC) is such a molecular target that has been, among others, intensively reviewed during the last decade. Although it has been discovered as a member of the cyclase family four decades ago, the research regarding the enzyme hasn’t followed the progress made with its sibling, the adenylate cyclase. Some of the reasons for this delayed progress are summarized in the difficulties concerning the isolation, purification and manipulation of the protein as a result of its low intracellular concentration and the lack of an efficient expression system. In addition, only after the discovery of nitric oxide (NO) as a signaling molecule and its recognition as the endothelium-derived relaxing factor (EDRF) at the late ’80s, was any significant progress made in the field of sGC biological activities. The purification of the heterodimeric enzyme and the discovery of the presence of one molecule of heme per dimer shed light in the mechanism of activation of sGC by NO and the consequent catalysis of the conversion of GTP into cyclic GMP, although no exact mechanism has been proved until today. The identification of the NO/sGC/cGMP signaling pathway served the discovery that drugs such organic nitrates, which have been used for the treatment of angina pectoris for over a century, practically act as NO-donors through bioconversion and exert their actions through activation of sGC and generation of the second messenger cGMP. The above results led to the establishment of NO as a significant signaling molecule in the physiology of cardiovascular system. The following progress concerning the study of the sGC-cGMP signaling cascade revealed a broad presence in almost all the mammalian cells and an implication in many substantial physiological processes, such as cardiac homeostasis, vascular and non-vascular smooth muscle relaxation, inhibition of platelet accumulation and coagulation, peripheral and central neurotransmission, immune response, transduction of light signals and regulating function in the gastrointestinal and urogenital systems. Apart from the physiological function, the NO/sGC/cGMP pathway is implicated in the pathophysiology of certain conditions as well, such as arterial and pulmonary hypertension, heart failure, arteriosclerosis and thrombosis, diabetes, kidney fibrosis and failure, inflammatory and neurodegenerative diseases, gastrointestinal disorders, sepsis and cancer, where it could be down- or up-regulated. Due to the significance and the severity of cardiovascular disorders where the expression or the activity of the pathway substituents is downregulated, most of the following drug discovery research focused on developing new agents that activate sGC, affording not only improved NO-donors but, additionally, two new categories of NO-independent activators, involving structurally diverse compounds. Regarding the inhibition of the enzyme, progress could not be considered as high, in spite of the tremendous utility of inhibitors in elucidating the cGMP-dependent biological processes. Among other compounds such as methylene blue, LY83583, organic phosphates, nucleotide derivatives, porphyrin analogues, the most potent and selective sGC inhibitor is ODQ, which is suggested to act through oxidation of the heme iron and consequent abolishment of the enzyme NO-activation ability. ODQ’s selectivity disadvantage, though, to inhibit in vivo not only the soluble guanylate cyclase but other hemoproteins as well, results in an urgent need for new selective sGC-inhibitors. According to the above facts, the aim of the present study involves the design, synthesis and biological evaluation of new possible sGC-inhibitors. Using the chemical structure of ODQ as a lead-compound, new tricyclic analogues were designed, bearing the basic indole or dihydroindole skeleton. The choice of the indole ring against the quinoxaline framework of ODQ aimed at the evaluation of how the new heterocyclic skeleton could contribute in the maintenance or the enhancement of the biological activity of the lead-compound. Moreover, the impact of non-flat molecules against ODQ was intended to be examined by the use of dihydroindole ring. Additionally, a series of different heterocyclic rings, diverse from the oxadiazolone ring of ODQ, fused to the basic skeletons were designated in order to study any possible influence based on the structure in inhibitory activity. Consequently, the synthetic methodologies for the synthesis of the final products were investigated, as well as the preparation of key molecules which could be used in the future as synthetic intermediates for the synthesis of additional modified derivatives. The synthesis of final dihydroindole tricyclic analogues was accomplished under cyclization conditions reacting hydroxylamine or various hydrazines with the α-hydroxymethylen-keto-intermediates, which were prepared from 4-keto-tetrahydroindole derivatives and ethyl formate. The corresponding indole final products were prepared from the dihydroindole ones under dehydrogenation conditions using DDQ. Due to the synthetic conditions applied for the synthesis of the key intermediate compounds, the substitution of the pyrrole nitrogen atom with a proper protecting group was considered crucial for the progress of the synthetic plan. Aiming to study the impact of the unsubstituted indole ring on the biological activity, the cleavage of the protecting group from the final products was necessary. Although, a number of protecting groups and of cleavage conditions were examined, the dihydroindole tricyclic products proved unstable. We only attempted to cleave one protecting group, the SEM group, and only in fully aromatized products, which proved more stable. 24 final products were synthesized following the aforementioned procedures, fourteen dihydroindole derivatives, ten indole derivatives among of which three bear unsubstituted pyrrole nitrogen atom. Apart from the final products, some significant synthetic intermediates were managed to be prepared. The α-methoxy- or α-ethyoxycarbonyl- 4- or 7-oxo-tetrahydroindole derivatives were synthesized according to different experimental procedures, as well as the a-hydroxymethylen-4-oxo-tetrahydroindole derivatives. The above synthetic intermediates may lead following different synthetic pathways to new tricyclic indole final compounds. In addition, the experimental conditions in each single step of the synthetic plan were investigated and determined on the purpose of improved yields. Some of the final tricyclic analogues, bearing no substituent at positions 2- and 3- of the pyrrole ring, were initially tested in in vitro biological assays. Firstly, they were tested concerning their inhibitory ability against SNP-induced sGC-activity using two different concentrations (1 μΜ and 100 μΜ). All the tested compounds proved to be sGC-inhibitors, being more potent at the higher concentration, except of one compound. Derivatives 74 and 81 were the most potent inhibitors and their inhibitory activity was dose-responded. Product 81 was then examined regarding its selectivity towards sGC by an in vitro assay involving ANF-induced cGMP production. The last assay proved that the above compound does not inhibit pGCs, suggesting that possibly the new series of compounds does not have any impact on either pGC or AC, determining a possible ODQ mechanism of action. Another conclusion from the biological assays that reinforces the last hypothesis is that the new compounds do not inhibit the basal sGC activity. The preliminary results of the biological evaluation confirm the main purpose of the present study which is the synthesis of new sGC-inhibitors. The choice of the indole ring as the basic skeleton of the new compounds verifies the initial design suggesting inhibitors with new structural characteristics. Preliminary SAR studies highlight the improved potency of flat fully aromatized indole derivatives in comparison with the non-flat dihydroindole ones, while there could not yet be safe conclusions derived regarding the structure of the third heterocyclic ring. Further biological evaluation of the rest of the products as well as the synthesis of new additional modified compounds will serve more detailed structure-activity relationship studies and possibly the development of a new lead-compound in the field of sGC-inhibition. Conclusions related with the chemical synthesis of the intermediate and final products, as well as conclusions regarding the biological evaluation of selected tricyclic derivatives might be proved useful for the future design, application and synthesis of new molecules with all the appropriate structural characteristics for effective sGC-inhibition. Such compounds not only could be proved useful experimental tools but possible pharmacological modulators as well in certain conditions, like sepsis, where sGC is overexpressed.

Les glycosyltransférases (GTs) sont une famille importante d’enzymes responsable de la biosynthèse des chaînes de glycosaminoglycane (GAG) des protéoglycanes, composants clés de la matrice extracellulaire et de la membrane plasmique cellulaire impliqués dans la communication, l'adhésion, la migration et la prolifération cellulaires. Les GTs jouent donc un rôle central dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques tels que les cancers ou encore les maladies dégénératives et génétiques. Parmi ces GTs, la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) est une cible thérapeutique potentielle puisqu'elle : i) catalyse une étape précoce et majeure de la biosynthèse des chaînes de GAG, ii) est impliquée dans une forme rare de maladie génétique des tissus conjonctifs, le syndrome d’Ehlers-Danlos, iii) prend en charge des xylosides exogènes modulant son activité in vitro et in vivo. Ce travail de thèse s'organise sur une étude structure/fonction de cette enzyme afin de cerner les résidus d'acides aminés clés dans l'interaction de l'enzyme avec un substrat modèle, le 4-methylombelliferyl-ß-D-xylose (4-MOX). Les résidus Y194, Y196 et Y199 ont ainsi été identifiés comme clés dans l'architecture du site de fixation du substrat accepteur et dans l'interaction de l'enzyme avec le xyloside. Au contraire, les résidus H195, R226 et le résidu R270, muté dans la forme progéroïde du syndrome d'Ehlers-Danlos, apparaissent comme des résidus « modulant » l'activité de l'enzyme, notamment du fait d'interactions moléculaires impliquant leur squelette peptidique pour H195 et R226 et une boucle flexible pour R270. Ces travaux ont permis de guider la synthèse d’analogues xylosidiques visant à inhiber l'activité de la ß4GalT7 humaine. Parmi les propositions, un dérivé fluoré du 4-MOX apparaît comme un inhibiteur efficace de la ß4GalT7 in vitro et in cellulo. Faiblement cytotoxique, ce dérivé réduit la prolifération des cellules de lignées cancéreuses SW1353 et MB MDA 231. Ces résultats ouvrent la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant les xylosides comme agents potentiels dans le traitement de cancers ou encore des maladies génétiques des tissus conjonctifs / Glycosyltransferases (GTs) are an important family of enzymes involved in the biosynthesis of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans which are key components of cell plasma membranes and of the extracellular matrix, and are thus implicated in cell communication, adhesion, migration and proliferation. GTs are thus key players in numerous pathophysiological processes such as cancers, degenerative and genetic diseases. Among these GTs, ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) is a potential therapeutic target since : i) it catalyzes a rate-limiting step in the early phase of the GAG chains biosynthesis, ii) it is implicated in a rare genetic connective tissue disorder (Ehlers-Danlos Syndrome), iii) its in vitro and in vivo activity can be modulated by exogenous xyloside molecules. This PhD work is focused on a structure/function study of the enzyme aiming to identify key amino acid residues that interact with 4-methylumbelliferyl-ß-D-xylose (4-MUX), taken as reference substrate. Y194, Y196 and Y199 have been identified as key residues for the architecture of the acceptor substrate binding site and establish interactions with 4-MUX. By contrast, H195, R226 and R270, a residue mutated in the progeroid form of Ehlers-Danlos Syndrome, should rather be considered as “modulating” residues towards the ß4GalT7 activity, H195 and R226 interacting with 4-MUX with their polypeptide backbone, and R270 via a flexible loop. This work guided the design of xylosidic compounds that would potentially inhibit the ß4GalT7 activity. Thus, a fluorinated derivative of 4-MUX appeared as an efficient in vitro and in cellulo inhibitor of the enzyme. Poorly cytotoxic, this compound also reduced the proliferation rate of cancer cells SW1353 and MB MDA 231. Altogether, these results offer new therapeutic strategies using xylosides as potential therapeutic agents in the treatment of cancer or rare genetic disorders