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Le cancer colorectal (CCR) représente une des premières causes de mortalité par cancer au Canada. Des analyses d'expression différentielles ont démontré que le gène codant pour l'ostéopontine (OPN) était plus exprimé dans les tumeurs colorectales par rapport au tissu sain adjacent, en corrélation avec l'agressivité tumorale. L'OPN est une glycophosphoprotéine non collagénique de la matrice extracellulaire membre de la famille SIBLING, caractérisée par un domaine RGD (arginine, glycine, aspartate) liant les intégrines. De plus, le clivage de l'OPN peut activer le récepteur CD44 et induire un signal pro-tumorigénique. Plusieurs études expérimentales suggèrent des voies par lesquelles l'OPN participe à la progression tumorale, l'angioinvasion et la métastase. L'expression de l'OPN chez les rongeurs est reconnue dans certains modèles pour être sous le contrôle de facteurs de transcription impliqués dans le cancer, dont c-jun, c-myc, PEA3, Spl, Nurrl, ERR[alpha], PPAR[gamma] et VDR. PPAR[gamma], corrélant à un bon pronostique du cancer colorectal, réprime l'expression de l'OPN dans des lignées monocytaires leucémique alors que le récepteur à la vitamine D entraîne une surexpression de l'OPN dans la lignée tumorale mammaire RAMA37 de rat. Par ailleurs des résultats du laboratoire suggèrent qu'ERR[alpha] est impliqué dans la croissance tumorale colorectale. Notre objectif est de déterminer si ERR[alpha] régule l'expression de l'OPN dans ce contexte. Nous avons réalisé une étude immunohistochimique sur une micromatrice tissulaire (MMT) comportant 85 échantillons de CCR et 8 adénomes avec les marges de résections correspondantes. On a observé que l'expression nucléaire d'ERR[alpha] était significativement augmentée (p<0.001) dans 61,2 % des tumeurs avec un score deux fois supérieur à celui de la marge de résection non tumorale. L'expression de l'OPN était augmentée dans 58,8 % des tumeurs avec un score d'immunoréactivité cytoplasmique de 1,5 fois plus intense (p<0.001) que le tissu non tumoral. Dans 55,3% des cas, l'expression d'ERR[alpha] était en corrélation avec telle de l'OPN (Kappa pondéré=0.27, p=0.0117) incluant une augmentation synergique dans 40% des adénocarcinomes étudiés. Cependant nous n'avons pas observé de corrélation d'expression des deux protéines en fonction du stade des tumeurs.Le marquage des deux protéines était faible dans les adénomes et comparable à celui du tissu de la marge de résection. En conditions expérimentales, l'infection de la lignée tumorale colique HT29 par un ARN interferant de type sh dirigé contre ERR[alpha] (sh5) entraîne une baisse de l'expression de l'OPN au niveau messager et protéique. En essai luciférase, nous avons observé qu'ERR[alpha], en présence de son coactivateur préféré PGC1[alpha], augmente l'activité du promoteur de l'OPN alors que la transfection concomitante de l'sh5 ou le traitement des cellules par le XCT790, un agoniste inverse d'ERR[alpha], entraîne dans les deux cas une baisse significative de l'activité luciférase comparée à leurs contrôles respectifs, shC et DMSO. Nous avons identifié par analyse bioinformatique du promoteur de l'OPN trois éléments de réponse incomplets (ERRE-S1, ERRE-S2 et ERRE-S3) pouvant lier ERR[alpha]. La mutation différentielle de ces éléments a montré qu'ERR[alpha] se lie principalement à l'élément de réponse ERRE-S2, alors que sa liaison au site ERRE-S1 est plus faible. Par contre il ne se lie pas au 3ème site du promoteur de l'OPN. In vivo, dans la lignée HT29, l'immunoprécipitation de la chromatine a confirmé qu'ERR[alpha] se lie bien au promoteur de l'OPN. Les résultats d'immunohistochimie indiquant une augmentation synergique d'ERR[alpha] et de l'OPN dans 40% des adénocarcinomes étudiés, la modulation de l'expression de l'OPN par ERR[alpha] dans la lignée tumorale colique HT29 ainsi que les résultats de biologie moléculaire identifiant au moins un élément de réponse pour ERR[alpha] dans le promoteur de l'OPN, suggèrent qu'ERR[alpha] serait un régulateur transcriptionnel de l'expression de l'OPN dans le cancer colorectal. La régulation de l'expression de l'OPN pourrait être un des mécanismes par lesquels ERR[alpha] favorise la progression tumorale. ERR[alpha] et l'OPN pourraient donc être utilisés comme marqueurs diagnostiques et pronostiques et constituer des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement du cancer colorectal.

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Le cancer colorectal est issu des cellules de l’épithélium et se définit comme une pathologie induite par une accumulation d’altérations génétiques. Des mutations de type gain-de-fonction dans les gènes KRAS, NRAS et BRAF sont retrouvées dans plus de 60% des cancers colorectaux entraînant potentiellement l’activation constitutive de la signalisation en aval, notamment le sentier MEK/ERK. Dans cette thèse, nous avons évalué les mécanismes moléculaires par lesquels l'activation du sentier MEK/ERK régularise la différenciation épithéliale et la tumorigénèse intestinale. Dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs), nos résultats montrent que les kinases ERK1/2 doivent être inactivées pour permettre l’induction du processus de différenciation entérocytaire. En effet, l'expression d’une forme constitutive active de MEK1 (caMEK1) est suffisante pour bloquer la différenciation tant morphologique que fonctionnelle. Une augmentation de la phosphorylation du facteur de transcription Cdx2 sur la sérine 60, qui diminue son activité transcriptionnelle, constituerait un des mécanismes impliqués. Dans des cellules cryptales intestinales indifférenciées, l’expression du caMEK1 induit une transition épithélium-mésenchyme (EMT), un processus associé au cancer colorectal. Cette EMT confère aux CEIs des capacités invasives et métastatiques in vivo associées à la sécrétion de protéases extracellulaires (MMP2/9). Nous avons identifié plusieurs autres cibles moléculaires de l’activité MEK/ERK impliquées dans l’EMT et l’invasion tumorale. Nous avons démontré l’implication des cascades Fra-1/Snail2 et EGR-1/Snail1 dans la répression transcriptionnelle de la E-cadhérine, une étape clé de l’EMT. Ce mécanisme de répression est également présent dans les lignées cancéreuses colorectales humaines possédant la mutation oncogénique de KRAS. L’analyse comparative par micropuce d'ADN Affymetrix dans les CEIs transformées par caMEK1 a permis d’identifier le gène encodant pour la serpineE2, un inhibiteur de protéases, comme le gène le plus fortement induit. Nous avons démontré que la serpineE2 est une cible moléculaire directe de l'activité oncogénique de la voie KRAS/BRAF/MEK/ERK et démontré son importance dans la migration et l’invasion tumorale par l'utilisation d'ARN interférents. On observe d’ailleurs une très forte expression de la serpineE2 dans des tumeurs colorectales humaines en comparaison à la marge saine adjacente. Nous avons aussi démontré que la transformation des CEIs induite par l’expression des formes actives de KRAS ou de MEK1 stimule la voie signalisation Wnt/β-caténine, dont la fréquente dérégulation constitue un évènement majeur menant au développement du cancer du côlon. La phosphorylation MEK-dépendante de LRP6 (S1490/T1572) semble être responsable de l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de la β-caténine, associée à une augmentation de sa présence au noyau. Cette interconnexion entre les voies KRAS/MAP kinase et Wnt/β-caténine a également été observée dans des cellules cancéreuses colorectales humaines mutées pour KRAS ou BRAF. Finalement, une augmentation du niveau de phosphorylation de LRP6 a été observée dans les adénomes et tumeurs colorectales humaines, supportant l’idée que la phosphorylation de LRP6 puisse être impliquée dans la progression tumorale.

L’isoforme p200CUX1 est un répresseur transcriptionnel qui est clivé dans les NIH3T3 par la cathepsin L en isoforme pllOCUXl laquelle acquiert alors la capacité d’activer la transcription des gènes cibles. Dans le système digestif, CUX1 est exprimé dans l’iléon et le côlon proximal chez la souris adulte. Aucun rôle dans le contexte de l’épithélium colique n’a été attribué à ce jour aux isoformes p200CUX1 et p110CUX1. Le but de cette Thèse a donc été d’investiguer l’implication de p200CUX1 et p110CUX1 dans l’épithélium colique ainsi que dans la carcinogenèse colorectale. Une étude différentielle par criblage de micropuces à ADN a permis d’identifier le gène PLZF comme cible transcriptionnelle de CUX1 dans le côlon. Une analyse informatique a prédit 15 sites de liaison potentiels pour CUX1 dans la portion 5’-UTR et dans une région de 776 p.b. du promoteur du gène PLZF. Des essais de gel de rétention et d’immunoprécipitation de la chromatine ont démontré une interaction de CUX1 avec certains sites prédits du gène PLZF in vitro et in vivo. Des essais transcriptionnels ont rapporté une diminution de deux fois de l’activité transcriptionnelle du promoteur du gène PLZF par CUX1. Les sites # 13, 14 et 15 du promoteur du gène PLZF ont été identifiés comme étant les sites préférentiellement liés par CUX1. Une analyse Western a permis d’établir un patron d’expression réciproque entre les cellules qui expriment CUX1 et celles qui expriment PLZF. Ces travaux ont également permis d’identifier un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la production de l’isoforme p11OCUX1. Un traitement des cellules 293T, T84 et Caco2/15 avec deux inhibiteurs du protéasome, soit le MG132 et le bortezomib, résulte en une diminution de l’expression de l’isoforme p11OCUX1. Une rapide accumulation de l’isoforme p200CUX1 est observée après 4 heures de traitement des cellules T84 au MG132. L’utilisation d’extraits de protéines cytoplasmiques et nucléaires suggère que la protéolyse limitée de l’isoforme p200CUX1 en p11OCUX1 prend place dans le noyau. Une expérience de dégradation in vitro confirme que le protéasome est la seule protéase responsable du clivage protéolytique. Une analyse informatique de la séquence en acides aminés de CUX1 a prédit quatre régions susceptibles d’être clivées par le protéasome. Enfin, le présent travail a tenté de démystifier le rôle de p11OCUX1 dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques. Les résultats montrent que l’isoforme p110CUX1 n’est pas un agent transformant. Sa surexpression dans les cellules IEC-6 et DLD-1 ne mène pas à une modulation de la vitesse de prolifération cellulaire. Aucune polype n’est visible au niveau de l’intestin grêle et/ou du côlon suite à la surexpression de p11OCux1 et ce, même après une période latente de 12 mois. L’abolition de l’expression des isoformes de CUX1 par interférence à l’ARN dans les cellules IEC-6 conduit à une diminution significative de la prolifération cellulaire, alors que dans les cellules T84 et DLD-1, il y a un ralentissement modeste de la croissance cellulaire. Les cellules DLD-1 shCUX1 ne forment pas moins de colonies en indépendance d'ancrage. Les résultats de cette étude démontrent que le gène PLZF est une cible de CUX1, que le protéasome est impliqué dans la protéolyse limitée de p200CUX1 en p110CUX1 et que p110CUX1 n’est pas impliquée dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques et de cancer du côlon chez l’humain.

Le corépresseur nucléaire NCOR1 est impliqué dans la régulation transcriptionnelle en interagissant avec les récepteurs à hormones thyroïdiennes et rétinoïques ainsi qu’avec les facteurs de transcription AP-1 et NF-κB au niveau des gènes cibles impliqués dans la réponse inflammatoire intestinale. Par une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à la spectrométrie de masse, CHD8 a été découverte pour agir de manière complémentaire à NCOR1. CHD8 est impliquée dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation du cycle cellulaire. Ainsi, le projet de recherche visait à comprendre l’interaction et les rôles fonctionnels de CHD8 et de NCOR1 ainsi que l’impact physiologique de la perte d’expression de NCOR1 face à un stress épithélial. Pour commencer, nous avons confirmé l’interaction entre CHD8 et NCOR1 dans différents types cellulaires tels que les 18Co, Caco-2/15 et HT-29. Ensuite, nous avons diminué l’expression de NCOR1 et CHD8 dans les cellules HT-29 et Caco-2/15 à l’aide de shRNA et nous avons observé une diminution de croissance cellulaire intermédiaire pour la perte de CHD8 comparativement à une diminution plus drastique pour NCOR1. L’effet intermédiaire sur la croissance cellulaire peut être dû à un effet de compensation par la petite forme de CHD8 (CHD8S) puisque le shRNA utilisé cible uniquement la grande forme de CHD8 (CHD8L). Avec cette diminution commune de croissance cellulaire, une question s’est imposée à savoir quelle est l’implication de l’interaction entre CHD8 et NCOR1 dans ce phénomène. Nous avons séparé NCOR1 en protéines correspondant à ces différents domaines et par IP suivies d’immunobuvardages, nous avons déterminé que le premier domaine de répression de NCOR1 (RD1) interagissait avec la forme complète de CHD8 au niveau du noyau. Nous avons ensuite utilisé un modèle murin où il y a une perte d’expression de NCOR1 (NCOR1ΔE11ΔCEI) avec l’aide d’un modèle où la Cre-recombinase est exprimée sous le promoteur de la villine. Nous avons ensuite traité les souris NCOR1ΔE11ΔCEI et contrôles au DSS 3% afin d’induire des lésions aux cellules épithéliales intestinales. Ceci permet l’étude de la suceptibilité au DSS des souris contrôles et NCOR1ΔE11ΔCEI. Ainsi, CHD8 et NCOR1 ont des rôles fonctionnels communs qui pourrait être attribué à leur interaction, CHD8-NCOR1 (RD1). Cette nouvelle mécanistique permettrait donc de réguler la transcription de certains gènes cibles impliqués dans le cancer colorectal.

Le corépresseur nucléaire NCOR1 est un répresseur transcriptionnel qui régule l’expression génique en s’associant à des récepteurs nucléaires ou à des facteurs de transcription comme AP-1 et NF-B. Ce projet de recherche visait à déterminer comment NCOR1 régule la prolifération et la réponse inflammatoire dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). Nous avons utilisé deux modèles murins de délétion du gène Ncor1 (Ncor1ID et Ncor1Exon11) ainsi que la Cre-recombinase sous le contrôle du promoteur du gène Vil1 (12.4KbVilCre) afin d’invalider le gène Ncor1 au niveau des CEIs (Ncor1IDΔCEI et Ncor1Exon11ΔCEI). Nous avons induit une réponse inflammatoire dans les CEIs en utilisant de l’IL-1 et du LPS. Nous avons observé que l’expression de NCOR1 est augmentée dans les CEIs lors de la réponse inflammatoire. Nous avons également traité les souris invalidées pour le gène Ncor1 avec du DSS afin d’induire une colite chimique expérimentale. Nous avons observé que les animaux Ncor1IDΔCEI et Ncor1Exon11ΔCEI sont plus susceptibles que les témoins. Nous avons analysé l’expression génique chez les animaux Ncor1IDΔCEI et Ncor1Exon11ΔCEI. L’analyse des gènes modulés dans les animaux Ncor1IDΔCEI a révélé que l’expression de la Retnlb est augmentée chez ces animaux, ce qui suggère un dérèglement dans la microflore. Dans les animaux Ncor1Exon11ΔCEI, nous avons noté que l’expression du gène Ido1, un puissant immunosuppresseur, est augmentée et permettrait possiblement à ces animaux de se maintenir dans un état homéostatique en absence de stress. Lorsque nous avons diminué l’expression de NCOR1 dans les CEIs à l’aide de shARN (shNCOR1_655), nous avons observé que celles-ci arrêtent de proliférer et sont sénescentes. De plus, nous avons remarqué une induction de molécules inflammatoires associées au SASP dans ces cellules. Nous avons analysé le transcriptome des cellules shNCOR1_655. Nous avons identifié le facteur de pluripotence SOX2 comme étant induits lorsque l’expression de NCOR1 est diminuée. Finalement, nous avons utilisé la technologie SILAC et la spectrométrie de masse afin de déterminer la composition du complexe de répression de NCOR1 dans les CEIs. Nous avons identifié de nouveaux partenaires d’interaction potentiels de NCOR1.

Metformin is the most common type 2 diabetes therapy, and may also reduce colorectal cancer growth. Currently, two mechanisms driving reduced cancer growth are considered: 1) Regulation of glucose and insulin levels, which may support cancer growth, and 2) Direct entry into cancer cells to activate the AMP-activated kinase (AMPK) protein, and inhibit cell growth pathways. The gut microbiome is the community of commensal microorganisms in the gastrointestinal tract. It is also affected by metformin, and may elevate production of short-chain fatty acids (SCFAs). Therefore, this thesis aimed to clarify how metformin may inhibit colorectal cancer growth and if the microbiome is involved. The hyperglycemic-responsive, murine-derived MC38 colon cancer cell line was used to test these effects. This model was confirmed to experience growth stimulation caused by high-fat diet (HFD) feeding in mice. Daily i.p. injections of metformin (100mg/kg) had no measurable effect on glucose and insulin sensitivity, or MC38 tumor growth. Oral metformin (250mg/kg) improved glucose tolerance and inhibited MC38 tumor growth in HFD-fed mice. To see if the gut microbiome is required for this effect, the antibiotic ampicillin was used to limit the gut microbiome. The addition of ampicillin blunted metformin’s glucose sensitization and tumor inhibition effects. A fecal microbiome transfer model was then used to isolate the role of the microbiome. Conventional mice fed HFD and gavaged with feces from metformin-treated donors experienced no glucose or insulin tolerance improvements. However, tumor growth was decreased by 30%, and serum SCFAs concentrations were elevated. The SCFA butyrate inhibited in vitro MC38 colony growth, but did not activate AMPK. These data suggest that metformin alters the gut microbiome, and fecal transfer from metformin-treated animals can uncouple MC38 tumor growth inhibition from the glucose homeostasis effects of metformin. These novel findings support a new mechanism for metformin to prevent cancer growth and development. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD) / Metformin is the most commonly used type 2 diabetes therapy, and may also reduce colorectal cancer growth. Anti-cancer effects may be caused by: 1) decreased glucose and insulin levels, which support cancer growth; or 2) entry into cancer cells to directly decrease cell growth. The gut microbiome, microorganisms that live symbiotically in the gastrointestinal tract, is also affected by metformin. This thesis aimed to clarify how metformin can inhibit cancer, and if the microbiome is involved. Mice treated with metformin had improved glucose metabolism and decreased colorectal tumor growth; when an antibiotic was introduced, this effect was lost. A fecal microbiome transfer model was used to determine if the microbiome is driving this effect. Mice receiving feces from metformin treated mice also experienced tumor growth inhibition. This suggests that the gut microbiome is involved in the anti-cancer effects of metformin, and is a new potential mechanism of action.

UGT1A1 est responsable de l’inactivation du SN-38, métabolite actif de l’irinotécan utilisé en première intention dans le traitement du cancer colorectal métastatique. Certains facteurs génétiques du gène UGT1A1 sont en partie responsables des variations dans la réponse à cette thérapie. Parallèlement, nous avons émis l’hypothèse qu’un mécanisme épigénétique module les niveaux intratumoraux d'UGT1A1 ainsi que les taux d’inactivation du SN-38 à son site d’action. Nos données démontrent que la méthylation d’îlots CpG spécifiques dans le promoteur et l’exon 1 d’UGT1A1 est associée à la répression de son expression, à la diminution du taux de protéine et d’inactivation du SN-38 dans les cellules tumorales de côlon in vitro. De plus, l’hyperméthylation de ces régions corrèle avec la faible expression du gène dans les tumeurs primaires du côlon de patients. Ces données soulèvent la possibilité que le profil de méthylation du gène UGT1A1 pourrait déterminer la concentration tumorale du métabolite actif et ainsi aider à prédire l’efficacité de la thérapie. / UGT1A1 is the main enzyme involved in the hepatic and tumoral inactivation of SN-38, an anticancer agent used in first line treatment of metastasic colorectal cancer. UGT1A1 genetic factors determine response to irinotecan therapy. We hypothesised that an epigenetic mechanism, more specifically methylation, is involved in tumoral regulation of UGT1A1 levels. Specific CpG islands in the UGT1A1 gene are hypermethylated and linked to the repression of gene expression and to lower levels of SN-38 glucuronidation in colon tumor cells in vitro. In addition, methylation of specific CpG was linked to lower expression of UGT1A1 gene in primary colon tumors from patients. Our data support that methylation profile of the UGT1A1 gene determine SN-38 tumoral concentration and may help to predict tumoral response to irinotecan.