Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / Les uridines diphospho-glucuronosyltransférases (UOT) sont des enzymes qui catalysent la réaction de glucuronidation. C'est un mécanisme majeur de détoxification chez les mammifères. La formation de dérivés stéroïdiens glucuronides dans les tissus extrahépatiques, tels que la prostate, est un excellent marqueur de l'activité androgénique périphérique. Les enzymes impliquées dans la conjugaison des hormones stéroïdiennes, principalement les androgènes, sont les UOTs de la sous-famille 2B. L'analyse d'ADN génomique humain a permis de caractériser tous les gènes UGT2B, UGT2B7 et UGT2B15, ainsi que cinq nouveaux gènes dont ces derniers portent des mutations dans leurs exons 1 correspondants aux premiers pseudo gènes de cette sous-famille d'enzymes. Ce clonage a démontré un haut degré de conservation dans la structure génomique des gènes UGT2B et a révélé la présence d'éléments dans leur région promotrice potent~ellement responsables de la régulation de leur expression. Ainsi, nous avons effectué la caractérisation des promoteurs d'UGT2B15 et d'UGT2B17 en utilisant le modèle cellulaire in vitro de prostate, les LNCaP. Les données recueillies ont permis d'illustrer que de nombreux facteurs de transcription ont un rôle dans l'expression basale des gènes tandis que d'autres facteurs ont un impact soit positif ou négatif sur la régulation transcriptionnelle. Par ailleurs, ces deux gènes hautement homologues ont démontré une régulation au niveau de la transcription par des effecteurs endogènes, dont les androgènes et les cytokines, utilisant des mécanismes communs et/ou spécifiques à chacun.

Le métabolisme de phase II est assuré par les UDP-glucuronosyltransférases (UGT), qui sont des enzymes régulant l'inactivation de nombreux médicaments et molécules endogènes. Cette voie métabolique est caractérisée par une variabilité interindividuelle significative, tant au niveau de l’expression génique qu’au niveau de l’activité de glucuronidation. La mesure des capacités de glucuronidation et la compréhension des mécanismes participant à cette variabilité dans les tissus humains sont un enjeu important. Cependant, le manque de spécificité des substrats des UGT, la grande similarité des séquences protéiques et le manque de corrélation entre l’expression en ARNm et en protéine, rend la mesure de la voie de glucuronidation difficile et complexe. En réponse à ces problèmes, des techniques de quantification des UGT par spectrométrie de masse ont été récemment développées. Il est alors possible de déterminer si les profils d’expression protéique des UGT ainsi obtenus par ces quantifications permettent de prédire le potentiel de glucuronidation dans les tissus humains. En plus d’une grande variabilité interindividuelle, mes travaux montrent que les profils d’expression protéique des UGT des tissus hépatiques et rénaux sont corrélés avec les activités de glucuronidation de quatre enzymes UGT pour lesquelles des substrats spécifiques sont connus. Par ailleurs, nous avons également démontré que la capacité de glucuronidation des tissus rénaux est fortement diminuée dans les tumeurs comparativement aux tissus normaux. Bien que de nombreux mécanismes de régulation des UGT aient été décrits, une fraction significative de la variabilité d’expression des ARNm, des protéines et de l’activité des UGT demeure inexpliquée et peut impliquer des mécanismes épigénétiques, tels que la régulation par microARN. Ainsi, nous avons identifié quatre microARN (miR-331, miR-376c, miR-409, et miR-494) comme des régulateurs potentiels des UGT2B15/2B17. Parmi ces microARN, nous avons mis en évidence l’implication de miR-376c dans la régulation de ces deux UGT, et déterminé que ces microARN pourraient influencer la biodisponibilité de la dihydrotestostérone (DHT) dans les cellules de cancer de la prostate in vitro et dans les tumeurs prostatiques de patients. / Phase II metabolism is conveyed by UDP-glucuronosyltransferases (UGT), which are enzymes regulating the inactivation of many drugs and endogenous molecules. This metabolic pathway is characterized by a significant interindividual variability at the level of gene expression and activity. The measurement of glucuronidation capacity and understanding of the mechanisms involved in this variability in human tissues are an important issue. However, the lack of substrate specificity for most UGT enzymes, the high similarity of their protein sequences and the lack of correlation between mRNA and protein expression complexifies accurate measurements of glucuronidation capacities in human tissues. To circumvent these issues, UGT quantification techniques by mass spectrometry have been recently developed. This allow us to determine whether expression patterns of UGT proteins, thus obtained by these quantifications, predict the potential of glucuronidation in human tissues. The results of our studies show a wide interindividual variability, but that the protein expression profiles of four UGT in liver and kidney tissues correlate with glucuronidation activities of their respective probe substrates. Furthermore, we also demonstrated that the glucuronidation capacity in tumor kidney tissues is greatly diminished relative to normal kidney tissues. Although many UGT regulatory mechanisms have been described, a significant part of their variability in mRNA, protein expression and activity remains unexplained and may involve epigenetic mechanisms, such as a regulation by microRNAs. Thus, we identified four microRNAs (miR-331, miR-376c, miR-409 and miR-494) as potential regulators of UGT2B15 / 2B17. Among these microRNAs, we have demonstrated the involvement of miR-376c in the regulation of UGT2B15 / 2B17, and determined that microRNAs could thus influence the bioavailability of dihydrotestosterone (DHT) in prostate cancer cells in vitro and prostatic tumors in vivo.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2014-2015 / La réaction de glucuronidation prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases est une voie majeure du système de détoxification cellulaire qui influence la biodisponibilité de molécules endogènes et exogènes. Notre laboratoire a récemment découvert l’existence de nouvelles protéines UGT nommées i2 dérivées de l’épissage alternatif du gène UGT1A. Ces protéines sont dépourvues d’activité transférase. Nous avons démontré par immunohistochimie que les enzymes i1 et les protéines alternatives i2 sont coexprimées dans plusieurs tissus du tractus gastro-intestinal, ainsi que dans les mêmes types cellulaires de ces tissus. Les i2 sont localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) avec les i1, mais sont également présentes dans le cytosol. Étant donné la proximité physique des i1 et i2 au RE, nous avons généré des modèles cellulaires surexprimant différentes combinaisons d’enzymes i1 et de protéines i2. Nos données démontrent que la coexpression de ces deux types de protéines diminue l’activité de glucuronidation de 20 à 80 % dépendamment du substrat et de l’enzyme testés. Par co-immunoprécipitation, nous avons démontré que cette répression survient via l’interaction physique des i1 avec les i2. À l’inverse, l’augmentation de l’activité de glucuronidation suite à la répression des formes i2 endogènes a permis de confirmer ce rôle de modulateur négatif des i2. Il semble aussi que les i2 soient en mesure de moduler significativement l’activité UGT même lorsque leur niveau d’expression est inférieur à celui des i1, tel que retrouvé dans plusieurs tissus humains. Nos données supportent également l’influence de ces protéines alternatives sur la réponse pharmacologique. En effet, la répression de l’expression des i2 endogènes dans une lignée de cancer de côlon entraîne un avantage de survie sous traitement chimiothérapeutique. Enfin, l’identification de l’interactome tissulaire des isoformes des UGT1A démontre qu’elles ont le potentiel d’interagir avec des enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la migration cellulaire. Nos données supportent que les i2 ont même la capacité de modifier le potentiel migratoire de cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les i2 ont la capacité de moduler le stress oxydatif cellulaire, entre autres via l’interaction avec des protéines antioxydantes, telle la catalase. En conclusion, nos résultats démontrent que les protéines alternatives i2 auraient le potentiel de moduler le système de défense cellulaire à plusieurs niveaux, en plus d’influencer la réponse aux médicaments. / The glucuronidation reaction mediated by the UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes is a major pathway of cellular detoxification system and has a clear effect on xenobiotic and endobiotic bioavailability. We have recently discovered nine new UGT proteins, named i2, which are derived from UGT1A alternative splicing. Those proteins are devoid of transferase activity. Using immunohistochemistry, we have demonstrated that i1 enzymes and i2 alternative proteins are coexpressed in multiple tissues of the gastrointestinal tract and also in the same cell types. Alternative i2 are localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane along with i1, but are also detected in the cytosol. Given the physical proximity of i1 and i2 at the ER, we have generated cellular models overexpressing different combinations of enzymes and i2 alternative proteins. Our data revealed that coexpression of those two types of proteins leads to a decrease of 20 – 80 % of the glucuronidation activity depending on the substrate and enzyme tested. By co-immunoprecipitation experiments, we have demonstrated that this modulation occurs via the physical interaction of i1 and i2. We have confirmed the negative modulator function of i2 alternative proteins by RNA interference. Our results demonstrates that repression of endogenous i2 leads to a significant increase of cellular glucuronidation activity. Data also support the importance of expression ratio of i2 :i1. Indeed, even an expression of i2 below the level of i1, as found in several tissues, consistently resulted in a significant modulation of UGT activity. Our data also support the role of i2 alternative proteins on pharmacological response. Repression of endogenous i2 in a colon cancer cell line leads to an increased cell viability under chemotherapeutic treatment. Furthermore, identification of UGT1A endogenous interactome reveals their capacity to physically interact with protein implicated in energy metabolism and cell migration. Our data support that i2 alternative proteins have the capacity to modulate migration potential of cancer cells. We have also demonstrated that i2 alternative proteins are able to modulate cellular oxidative stress, in part via protein-protein interaction with anti-oxidant proteins, such as catalase. In conclusion, our results demontrate that i2 alternative proteins have the potential to modulate the cellular defense system at multiple levels in addition to influence pharmacological response.

L'uridine-diphosphoglucuronosyltransférase 1A3 (UGT1A3) est un des enzymes les plus efficaces dans la conjugaison de l'estrone (Ei), un précurseur pour la biosynthèse de l'estradiol (E2) dans les tissus périphériques. Nous avons identifié certains mécanismes génétiques qui pourraient contribuer à la variation individuelle de l'expression UGT1A3 et de son activité. L'exon 1 et le promoteur ont été séquences chez 249 Canadiens-Français. Nous avons identifié 17 polymorphismes : 7 localisés au promoteur et 10 dans l'exon 1, dont 6 mènent à un changement d'acide aminé. Une réduction de l'activité transcriptionnelle a été associée à chacun des 6 promoteurs variables. Des analyses plus détaillées suggèrent que les polymorphismes -148 T>C et -581 C>T affectent des sites de reconnaissance de deux facteurs de transcription hépatique (HNF-la et HNF-4a). Par la suite, l'activité de conjugaison de l'Ei a été évaluée pour les 11 formes de protéines polymorphiques identifiées. Nous avons observé trois phénotypes : UGT1A3*1, * 2 (Wl IR, V47A) et * 3 (Wl IR) avec des valeurs de clairance intrinsèque (CLjnt) élevée ; UGT1A3*5 (Q6R, Wl IR), * 7 (FI 101), * 9 (WllR, M208L), * 10 (V47A) et * 11 (WllR, V47A et M114I) avec une CL,,, intermédiaire (réduction de 2 fois à 10 fois par rapport à * 1), tandis qu'UGTl A3*4 (R45W), * 6 (Wl 1R, V47A, M270V) et * 8 (A 158V) ont une CLinttrès faible (réduction de plus de 10 fois par rapport à * 1). Les analyses de diplotypes indiquent que plus de 20% de la population sont porteurs de deux alleles affectant l'expression UGT1A3 et/ou l'activité de la protéine. Bien que ce travail n'ait pas étudié l'association génotype-phénotype, les résultats suggèrent que certaines des variations génétiques identifiées et caractérisées pourraient contribuer à la variabilité de l'inactivation d'E| par UGT1A3 et donc, à une modification de l'exposition aux estrogènes chez les individus porteurs.

L'enzyme UGT2B7 est un membre de la superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT), impliquée dans la glucuronidation. Cette réaction de conjugaison de l'acide glucuronique permet l'inactivation et l'élimination de certains composés alimentaires, polluants environnementaux, substances endogènes ainsi que d'environ 35% des médicaments présentement sur le marché. L'activité enzymatique de cette voie métabolique est sujette à une importante variabilité interindividuelle qui, dans le cas d'UGT2B7, n'est pas expliquée par la présence de polymorphismes génétiques. De nouvelles évidences suggèrent que l'épissage alternatif est un mécanisme qui pourrait contribuer à cette variabilité interindividuelle via la formation de nouveaux transcrits d'ARN messagers et de peptides pouvant avoir des rôles opposés, une fonction régulatrice ou encore une distribution tissulaire différentielle dans le cas des UGT. L'objectif de mon projet de recherche était de caractériser l'épissage alternatif du gène UGT2B7 humain avec l'objectif futur d'établir si ce phénomène est à l'origine de la variabilité de cette voie métabolique.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / L'une des principales voies du métabolisme des médicaments est prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT). Nos récentes découvertes ont mis à jour l'existence de nouvelles protéines nommées isoformes 2 (i2) produites par épissage alternatif du gène UGT1A humain. Ces produits d'épissage ne possèdent pas d'activité enzymatique mais démontrent une distribution tissulaire similaire à celles des isoformes 1 actives. Les enzymes i 1 et les nouvelles formes i2 sont présentes notamment au foie, dans le tractus digestif et le rein et leur localisation subcellulaire est similaire. Par immunohistochimie, nous avons également pu observer leur présence dans les tissus tumoraux. Basé sur les profils d'expression tissulaire, nous avons démontré un impact significatif de l'expression hétérologue stable d'i2 sur la conjugaison de divers médicaments, en présence d'il. Nous avons établi diverses lignées cellulaires surexprimant différentes combinaisons d'il et i2. Une réduction significative de 20 à 82% de la production de metabolites glucuronides est observée en essais enzymatiques pour plusieurs substrats dont l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. Les expériences de co-immunoprécipitation supportent que cette répression survient via l'interaction directe des protéines il et i2 dans la membrane du reticulum endoplasmique, formant ainsi des complexes inactifs. La fonction répressive d'i2 sur l'activité UGT a en parallèle été validée par des expérimentations en cellules intactes visant la répression des isoformes i2 endogènes par interférence à l'ARN qui entraînaient pour leur part une augmentation significative de l'activité de glucuronidation. Ce phénomène pourrait donc avoir une importance physiologique et pharmacologique significative, alors que l'abondance relative des formes il et i2 interagissant sous la forme de complexes actifs (il-il) et inactifs il-i2) serait déterminante de l'activité de glucuronidation cellulaire. Nous avons également identifié la présence de sept nouvelles isoformes d'UGT2B4 qui sont inactives. Toutefois, la co-expression de trois d'entre elles avec la forme active classique d'UGT2B4 (il) provoque une diminution de l'activité de conjugaison. En conclusion, nos résultats démontrent que des événements d'épissage alternatif des gènes UGT humains influencent la voie de glucuronidation suggérant un mécanisme d'auto-régulation, et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement de plusieurs pathologies telles que le cancer.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Le mycophénolate mofétil (MMF) est un immunosuppresseur utilisé en prophylaxie du rejet dans le cadre de greffes de rein, de poumon et de cœur. La pharmacocinétique de ce médicament est sujette à une importante variabihté interindividuelle d'origine inconnue. Mon projet de maîtrise avait pour but d'approfondir les connaissances relatives au métabolisme de l'acide mycophénolique (MPA), le metabolite actif du MMF, en regard de sa voie principale de biotransformation, soit la glucuronidation par les enzymes UDPglucuronosyltransférases (UGT). Mes travaux ont contribué à l'identification des trois isoformes UGT principalement impliquées dans la formation des deux dérivés glucuronides du MP A, soit les isoformes UGT1A8, UGT1A9 et UGT2B7. Une première étude a permis l'identification de variations génétiques (polymorphismes) du gène UGT1A9 associées à une altération de l'activité de conjugaison du MP A. Dans une seconde étude, des polymorphismes de la région codante des gènes UGT1A8 et UGT2B7 ont démontré une modification importante de l'efficacité catalytique de la protéine UGT pour la formation des glucuronides phénolique et acyl du MP A. À ce jour, nos résultats suggèrent que certains polymorphismes des enzymes UGT pourraient être responsables de la variabilité interindividuelle observée dans la pharmacocinétique du MMF en clinique.

Contexte: L’inactivation des androgènes est majoritairement régulée par des enzymes du métabolisme de la famille des UDP-glucuronosyltransferase (UGT). Ce procédé métabolique permet de contrôler la biodisponibilité des hormones stéroïdiennes systémiques et locales. Objectif : L’objectif était d’étudier la relation entre l’expression de l’enzyme UDP-glucuronosyltransferase 2B polypeptide 28 (UGT2B28), impliquée dans la biotransformation des hormones, avec les niveaux hormonaux circulants, et les caractéristiques clinico-pathologiques dans le cancer de la prostate (CaP). Conception et participants : Nous avons utilisé dans cette étude la technique d’immunohostochimie à grande échelle (tissue microarray) sur les tissus de 239 patients ayant un CaP localisé. L’étude des 51 patients additionnels ne possédant pas l’enzyme UGT2B28 dans leur génome, a été effectuée pour confirmer l’importance de cette enzyme sur les niveaux hormonaux circulants. Résultats : La surexpression de l’enzyme UGT2B28 a été associée à des niveaux d’antigène prostatique spécifique (APS) au diagnostic plus faibles, à un score de Gleason plus élevé, à des marges et statuts nodaux positifs, et fut associée de façon indépendante au risque de progression. La surexpression de l’enzyme fut également associée à des niveaux circulants de testostérone (T) et dihydrotestostérone (DHT) plus élevés. Les patients n’exprimant pas le gène UGT2B28 avaient des niveaux plus bas de T (19%), de DHT (17%), de métabolites glucuronidés (18-38%), et des niveaux plus élevés du précurseur surrénalien androsténédione (36%). Conclusion : L’enzyme UGT2B28 modifie les niveaux circulants de T et DHT, et sa surexpression est associée avec un CaP à plus haut grade. Notre étude a permis de découvrir un nouveau rôle d’UGT2B28, celui de régulateur de la stéroïdogenèse, et a souligné l’interconnexion entre les capacités de biotransformation hormonale des cellules cancéreuses, des niveaux hormonaux, des caractéristiques clinicopathologiques et du risque de progression. / Background : Androgen inactivation occurs mainly through the glucuronidation conjugative reaction mediated by UDP-glucuronosyltransferases (UGTs). This metabolic process is involved in the control of systemic and local androgen bioavailability. Objective : To examine the relationship among expression of the androgen-inactivating UGT2B28 enzyme, circulating steroid hormone levels, and clinical phenotype in prostate cancer (PCa). Design, setting, and participants : We conducted an analysis of a high-density prostate tumor tissue microarray consisting of 239 localized PCa cases. The study of 51 additional PCa patients with no copies of UDP glucuronosyltransferase 2B subfamily, polypeptide B28 (UGT2B28) in their genomes was performed to confirm the importance of the enzyme on circulating hormone levels. Outcome measurements and statistical analysis : Steroid hormones were measured by mass spectrometry. Multivariate Cox proportional hazard models assessed the influence of UGT2B28 on progression, and general linear model regression evaluated variations in hormone levels. Results and limitations : Tumor overexpression of UGT2B28 was associated with lower prostate-specific antigen levels at diagnosis, higher Gleason scores, margin and nodal invasion status, and it was shown to be an independent prognostic factor associated with progression. Enzyme overexpression correlated with 30% higher circulating levels of testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT). Patients with no copies of UGT2B28 in their genomes have lower levels of T (19%), DHT (17%), its glucuronide metabolites (18–38%), and enhanced levels of the adrenal precursor androstenedione (36%). Conclusions : The UGT2B28 steroid-inactivating pathway modifies circulating T and DHT levels, and UGT2B28 overexpression is associated with high-grade PCa. Our work has uncovered the role of UGT2B28 as a regulator of steroidogenesis and underscores the interconnectivity among the steroid-inactivation capacity of cancer cells, hormone levels, disease characteristics, and the risk of cancer progression.

La superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT) est constituée de glycoprotéines résidant au réticulum endoplasmique et sujettes aux modifications post-traductionnelles (PTM, post-translational modifications). L’enzyme UGT2B7 est d’un intérêt particulier vu son action sur une grande variété de médicaments. La plupart des études actuelles n’ont pour sujet que les variants communs de cette enzyme et n’examinent donc qu’une fraction de la diversité génétique de celle-ci. En effet, les variants rares (fréquence allélique en deçà de 1%) peuvent potentiellement avoir un effet considérable puisqu’ils sont prédits comme étant bien plus nombreux que les variants communs au sein du génome humain. La présente étude fait état de la découverte d’un variant rare d’UGT2B7 possédant un intérêt pharmacogénétique potentiel et encodant une substitution d’acide aminé au codon 121. Cette variation peu fréquente, retrouvée chez deux individus au sein d’une population de 305 sujets sains, mène à la traduction d’une asparagine (Asn) plutôt qu’un acide aspartique (Asp) au codon 121 (UGT2B7 p.D121N). Cette substitution est prédite comme créant un motif de N-glycosylation NX(S/T) subséquemment validé par traitement à l’endoglycosidase de fractions microsomales issues de surexpressions dans des cellules HEK293 et par inhibition à la tunicamycine de la N-glycosylation d’UGT2B7 produites de façon endogène dans des HEK293. De plus, la présence d’un oligosaccharide additionnel sur l’enzyme UGT2B7, affectant potentiellement son repliement, résulte en la diminution, respectivement par 49 et 40%, de la formation de glucuronides à partir de la zidovudine et de l’acide mycophénolique. Une analyse de la base de données dbSNP a permis la découverte de 32 variants rares pouvant potentiellement créer ou abolir des motifs de N-glycosylation au sein d’enzymes UGT2B. Ensemble, ces variants ont le potentiel d’augmenter la proportion de la variance de la voie des UGT qui est expliquée par des modifications post-traductionnelles telles la N-glycosylation, affectant ainsi le métabolisme des médicaments. / The UDP-glucuronosyltransferase (UGT) superfamily consists of glycoproteins resident of the endoplasmic reticulum membranes that undergo post-translational modifications (PTM). UGT2B7 is of particular interest because of its action on a wide variety of drugs. Most studies currently survey common variants and are only examining a small fraction of the genetic diversity. However, rare variants (frequency < 1%) might have significant effect as they are predicted to greatly outnumber common variants in the human genome. Here, we discovered a rare single nucleotide UGT2B7 variant of potential pharmacogenetic relevance that encodes a nonconservative amino acid substitution at codon 121. This low-frequency variation, found in two individuals of a population of 305 healthy volunteers, leads to the translation of an asparagine (Asn) instead of an aspartic acid (Asp) (UGT2B7 p.D121N). This amino acid change was predicted to create a putative N-glycosylation motif NX(S/T) subsequently validated upon endoglycosidase H treatment of microsomal fractions and inhibition of N-glycosylation of endogenously produced UGT2B7 with tunicamycin from HEK293 cells. The presence of an additional N-linked glycan on the UGT2B7 enzyme, likely affecting proper protein folding, resulted in a significant decrease, respectively by 49 and 40%, in the formation of zidovudine and mycophenolic acid glucuronides. A systematic survey of the dbSNP database uncovered 32 rare and naturally occurring missense variations predicted to create or disrupt N-glycosylation sequence motifs in the other UGT2B enzymes. Collectively, these variants have the potential to increase the proportion of variance explained in the UGT pathway due to changes in PTM such as N-linked glycosylation with consequences on drug metabolism.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006