Le corépresseur nucléaire NCOR1 est impliqué dans la régulation transcriptionnelle en interagissant avec les récepteurs à hormones thyroïdiennes et rétinoïques ainsi qu’avec les facteurs de transcription AP-1 et NF-κB au niveau des gènes cibles impliqués dans la réponse inflammatoire intestinale. Par une approche d’immunoprécipitation (IP) couplée à la spectrométrie de masse, CHD8 a été découverte pour agir de manière complémentaire à NCOR1. CHD8 est impliquée dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation du cycle cellulaire. Ainsi, le projet de recherche visait à comprendre l’interaction et les rôles fonctionnels de CHD8 et de NCOR1 ainsi que l’impact physiologique de la perte d’expression de NCOR1 face à un stress épithélial. Pour commencer, nous avons confirmé l’interaction entre CHD8 et NCOR1 dans différents types cellulaires tels que les 18Co, Caco-2/15 et HT-29. Ensuite, nous avons diminué l’expression de NCOR1 et CHD8 dans les cellules HT-29 et Caco-2/15 à l’aide de shRNA et nous avons observé une diminution de croissance cellulaire intermédiaire pour la perte de CHD8 comparativement à une diminution plus drastique pour NCOR1. L’effet intermédiaire sur la croissance cellulaire peut être dû à un effet de compensation par la petite forme de CHD8 (CHD8S) puisque le shRNA utilisé cible uniquement la grande forme de CHD8 (CHD8L). Avec cette diminution commune de croissance cellulaire, une question s’est imposée à savoir quelle est l’implication de l’interaction entre CHD8 et NCOR1 dans ce phénomène. Nous avons séparé NCOR1 en protéines correspondant à ces différents domaines et par IP suivies d’immunobuvardages, nous avons déterminé que le premier domaine de répression de NCOR1 (RD1) interagissait avec la forme complète de CHD8 au niveau du noyau. Nous avons ensuite utilisé un modèle murin où il y a une perte d’expression de NCOR1 (NCOR1ΔE11ΔCEI) avec l’aide d’un modèle où la Cre-recombinase est exprimée sous le promoteur de la villine. Nous avons ensuite traité les souris NCOR1ΔE11ΔCEI et contrôles au DSS 3% afin d’induire des lésions aux cellules épithéliales intestinales. Ceci permet l’étude de la suceptibilité au DSS des souris contrôles et NCOR1ΔE11ΔCEI. Ainsi, CHD8 et NCOR1 ont des rôles fonctionnels communs qui pourrait être attribué à leur interaction, CHD8-NCOR1 (RD1). Cette nouvelle mécanistique permettrait donc de réguler la transcription de certains gènes cibles impliqués dans le cancer colorectal.

Das CHARGE-Syndrom ist ein autosomal dominant vererbtes Dysmorphiesyndrom. Meistens handelt es sich um sporadische Fälle. Nur für ca. 2/3 der Betroffenen konnte als Ursache eine Mutation im CHD7-Gen nachgewiesen werden.  In dieser Arbeit wurde eine Familie untersucht, in der zwei Kinder gesunder Eltern von einem CHARGE-Syndrom betroffen sind und die Mutation c.7302dupA heterozygot aufweisen. Die  ursächliche Mutation c.7302dupA ließ sich in den väterlichen Spermien nachweisen. Ein Gonadenmosaik konnte somit beim Vater der betroffenen Kinder bestätigt werden.  Eine Methode zur DNA-Analyse an Einzelspermien wurde etabliert, mittels derer der Grad des Mosaiks näher bestimmt werden konnte. In einer Stichprobe des untersuchten Falles trugen 16 von 59 der untersuchten Einzelspermien die Mutation c.7302dupA. Aus diesem Ergebnis lässt sich ein deutlich erhöhtes Wiederholungsrisiko bei einem weiteren Kind ableiten. Eine Interaktion von CHD7 mit CHD8 konnte durch einen direkten Yeast-Two-Hybrid nachgewiesen werden. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch den Nachweis der Ko-Lokalisation der beiden Proteine sowie durch ein Signal in einem bimolekularen Fluoreszenzkomplement-Assay. Im direkten Yeast-Two-Hybrid ließ sich die Interaktionsstelle im CHD7 auf den AS Bereich 1950–2172 mit den Domänen SANT und CR3 mit distalen und proximalen Überhängen eingrenzen.  Durch das Einfügen einer bei einem CHARGE-Patienten identifizierten Missense-Mutation p.Trp2091Arg in den entsprechenden CHD7-Abschnitt ließ sich keine Interaktion mit CHD8 im direkten Yeast-Two-Hybrid mehr nachweisen. Die Bedeutung dieser Missense-Mutation beim Wegfall der Interaktion zwischen CHD7 und CHD8 als Ursache für das CHARGE-Syndrom ist in diesem Fall anzunehmen.

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Background: Cardiovascular diseases are currently the leading cause of death in humans. The high mortality of cardiac diseases is associated with myocardial ischemia and reperfusion (I/R). Recent studies have reported that microRNAs (miRNAs) play important roles in cell apoptosis. However, it is not known yet whether miR-141-3p contributes to the regulation of cardiomyocyte apoptosis. It has been well established that in vitro hypoxia/reoxygenation (H/R) model can follow in vivo myocardial I/R injury. This study aimed to investigate the effects of miR-141-3p and CHD8 on cardiomyocyte apoptosis following H/R. Results: We found that H/R remarkably reduces the expression of miR-141-3p but enhances CHD8 expression both in mRNA and protein in H9c2 cardiomyocytes. We also found either overexpression of miR-141-3p by transfection of miR-141-3p mimics or inhibition of CHD8 by transfection of small interfering RNA (siRNA) significantly decrease cardiomyocyte apoptosis induced by H/R. Moreover, miR-141-3p interacts with CHD8. Furthermore, miR-141-3p and CHD8 reduce the expression of p21. Conclusion: MiR-141-3p and CHD8 play critical roles in cardiomyocyte apoptosis induced by H/R. These studies suggest that miR-141-3p and CHD8 mediated cardiomyocyte apoptosis may offer a novel therapeutic strategy against myocardial I/R injury-induced cardiovascular diseases.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Under normal conditions, smooth muscle cells do not replicate, or proliferate, and provide a means of contraction for many internal organs, including blood vessels and the gut. However, under abnormal or disease conditions, such as congenital heart disease and cancer, smooth muscle cells acquire the ability to replicate, to make extracellular matrix proteins and to migrate. Thus, determining how smooth muscle cells regulate these processes is crucial to understanding how the cells can switch between normal and diseased states. Serum response factor (SRF) is a widely expressed protein that plays a key role in the regulation of smooth muscle differentiation, proliferation and migration. It is generally accepted that one way that SRF can distinguish between these functions is through pathway-specific co-factor interactions. A novel SRF co-factor, chromodomain helicase DNA binding protein 8 (CHD8), was originally isolated from a yeast two-hybrid assay. CHD8 is widely expressed in adult tissues including smooth muscle. Data from in vitro binding assays indicate that the N-terminus of CHD8 can interact directly with the MADS domain of SRF. Co-immunoprecipitation assays verified the ability of these two proteins to interact within cells. Adenoviral-mediated shRNA knockdown of CHD8 in smooth muscle cells resulted in statistically significant 10-20% attenuation of expression of SRF-dependent, smooth muscle-specific genes. Similar experiments revealed that knockdown of CHD8 did not affect the SRF-dependent induction of immediate early genes required to promote proliferation. In contrast, knockdown of CHD8 in A10 vascular smooth muscle cells resulted in a marked induction in of apoptosis, characterized by increases in apoptotic markers such as phospho-H2A.X, cleaved PARP and activated caspase-3. These data suggest that CHD8 may play a specific role in modulating SRF’s activity toward anti-apoptotic genes, thereby regulating smooth muscle cell survival.

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