Les tumeurs sont caractérisées par une croissance exacerbée ainsi qu’une capacité à pouvoir se disséminer dans l’organisme. Ces deux aspects sont assurés en partie par une expression et une sécrétion soutenues de protéases. Plus particulièrement, une expression importante et une délocalisation de la protéase à cystéine cathepsine B corrèle avec les pouvoirs métastatiques de plusieurs types de tumeurs. La cathepsine B est une protéase lysosomale dont le rôle majeur est de dégrader les protéines en fin de vie. Dans les cancers colorectaux, l’épithélium colique possède une importante activité cathepsine B dès l’apparition d’adénomes précoces, mais aussi dans des tumeurs avancées et métastatiques. Par ailleurs, une expression et une activité importante de cette enzyme sont des indices de mauvais pronostics de survie chez les patients atteints de cancers colorectaux. Le but de ce travail a été d’évaluer l’importance de la cathepsine B dans les processus tumorigéniques de lignées cancéreuses colorectales. Pour cela, nous avons analysé les statuts d’expression, de sécrétion et d’activité de la cathepsine B dans les cellules normales HIEC comparativement à sept lignées cancéreuses colorectales humaines. La cathepsine B est sécrétée par les lignées cancéreuses et par les cellules HIEC qui expriment néanmoins de hauts niveaux de cathepsine B intracellulaire et sécrètent la forme non-active de la cathepsine B. Par ailleurs, nous avons employé la technique d’interférence à ARN ciblant spécifiquement les transcrits de la cathepsine B dans deux lignées cancéreuses colorectales afin d’en évaluer l’impact sur leurs capacités de croissance et d’invasion. Le ciblage de la cathepsine B réduit de manière modeste la croissance sur plastique de ces deux lignées cancéreuses ; cependant, leur potentiel à former des colonies en indépendance d’ancrage ainsi que leur capacité à migrer et envahir la matrice extracellulaire sont drastiquement affectés par la baisse de cathepsine B. En parallèle, le ciblage pharmacologique des formes actives et sécrétées de la cathepsine B réduit les pouvoirs d’invasion des cellules cancéreuses sans interférer avec leur capacité à former des colonies en indépendance d’ancrage. De plus, nous avons pu montrer que le ciblage moléculaire de la cathepsine B dans les deux lignées cancéreuses réduit de manière importante leurs capacités tumorigéniques chez la souris. L’analyse biochimique des tumeurs sous-exprimant la cathepsine B révèle des niveaux plus importants de l’inhibiteur du cycle cellulaire p27[indice supérieur Kip1] ainsi qu’une réduction de la cycline B. Enfin, nous avons montré que la cathepsine B a la capacité de cliver directement l’inhibiteur p27[indice supérieur Kip1], contribuant ainsi à sa dérégulation dans le cancer colorectal. De plus, la génération d’un mutant de p27[indice supérieur kip1] non clivable par cette enzyme permet d’augmenter de manière significative la stabilité de l’inhibiteur. En résumé, l’ensemble de ces travaux montre que la cathepsine B est un acteur important dans les caractères tumoraux des cellules cancéreuses colorectales et que son ciblage moléculaire et/ou pharmacologique pourrait être une approche valide pour réduire l’expansion de ces tumeurs chez l’humain.

SHP-2 est une tyrosine phosphatase impliquée dans la signalisation intracellulaire déclenchée par des facteurs de croissance, des cytokines pro-inflammatoires et des produits bactériens. Bien que cette phosphatase soit exprimée de manière ubiquiste et donc dans l’épithélium intestinal, son rôle dans ce tissu n'était pas connu. Afin de mieux comprendre les rôles joués par cette phosphatase dans l’intestin, nous avons généré un modèle murin de délétion conditionnelle de Shp-2 spécifiquement dans les cellules épithéliales intestinales (SHP-2[indice supérieur CEI-KO]). Nos résultats montrent que dès l'âge de 1 mois, toutes les souris expérimentales ont développé spontanément de l'inflammation au niveau du côlon. En fait, dans les cellules épithéliales intestinales, SHP-2 contrôle le niveau d’activation d’effecteurs de signalisation importants tels que les kinases ERK1/2 de même que les facteurs de transcription NFκB, STAT3 et β-caténine. En modulant ces voies de signalisation, SHP-2 contrôle des processus cellulaires primordiaux pour le maintien de l’homéostasie intestinale: la détermination des cellules à mucus et des cellules de Paneth, la composition de la flore, la perméabilité paracellulaire et la restitution épithéliale. La dérégulation de ces processus cellulaires peut expliquer l'apparition rapide d'inflammation colique chez les souris SHP-2C[indice supérieur EI-KO]. De plus, l'inflammation chronique observée chez les souris SHP-2[indice supérieur] CEI-KO entraîne avec l'âge le développement de cancer colorectal associé à la colite. Finalement, nos résultats chez l'humain montrent qu'il y a une diminution significative d'expression de SHP-2 chez les patients atteints de maladies inflammatoires intestinales comparativement aux patients témoins. Également, deux polymorphismes de PTPN11 sont retrouvés préférentiellement chez les patients atteints de colite ulcéreuse. En conclusion, nos résultats démontrent que la phosphatase SHP-2 protège l'épithélium intestinal contre l'inflammation et le cancer colorectal associé à la colite.

SOX9 est un facteur de transcription à domaine HMG. Il est impliqué dans de multiples processus biologiques au cours du développement et de la vie adulte. En particulier, SOX9 joue un rôle important dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Nous avons montré que SOX9, cible positive de la voie de signalisation oncogénique Wnt/(beta)-caténine, réprime l'expression de PKC(alpha). Cette répression implique un nouveau mécanisme d'action qui ne nécessite ni la fixation du domaine HMG à l'ADN ni le domaine de transactivation de SOX9. Nous avons également identifié MiniSOX9, un nouveau variant d'épissage de SOX9, résultant de la rétention du second intron. MiniSOX9 est fortement exprimé dans les tumeurs coliques. Il agit en tant que dominant négatif de SOX9, inhibiteur de l'expression du suppresseur de tumeurs PKC(alpha) et activateur de la voie de signalisation oncogénique Wnt/(beta)-caténine. Nos données suggèrent ainsi un rôle primordial de MiniSOX9 dans la tumorigenèse intestinale. Enfin, notre étude protéomique des partenaires de SOX9 et de MiniSOX9 permet d'ouvrir de nouvelles perspectives quant aux rôles de ces deux protéines dans l'homéostasie et la tumorigenèse intestinale / SOX9 is an HMG transcription factor involved in numerous biological processes during development and adult life. It plays an important role especially in the intestinal epithelium homeostasis. In the present study, we demonstrate that SOX9, a positive target of the oncogenic signaling pathway Wnt/(beta)-catenin, represses PKC(alpha) expression. This repression involves a new mechanism of action requiring neither HMG domain binding to DNA nor the transactivation domain of SOX9. We also report the discovery of MiniSOX9, a new SOX9 splice variant, resulting from the second intron retention. MiniSOX9 is highly expressed in colon tumors. It acts as a SOX9 dominant negative, as a repressor of the expression of the tumor suppressor PKC(alpha), and as an activator of the oncogenic signaling pathway Wnt/(beta)-catenin. Our data suggest a crucial role of MiniSOX9 in intestinal tumorigenesis. Finally, a proteomic analysis allowed us to identify potential new SOX9 and MiniSOX9 partners which will be useful to decipher the roles of these two proteins in intestinal homeostasis and tumorigenesis

L’ilot génomique pks de Escherichia coli et d’autres Enterobacteriaceae code des synthases depolycétides et de peptides non ribosomaux qui permettent l’assemblage d’un composé hybride polycétidepeptidenon ribosomal putative. Ce composé nommé colibactine induit des cassures double-brin de l’ADN descellules eucaryotes.La machinerie enzymatique codée par l’ilot pks comporte une protéine essentielle ClbP, atypique dansce type d’ilot. Nous avons montré que ClbP possède une partie N-terminale catalytique et périplasmique, et unepartie C-terminale associée à la membrane cytoplasmique. La structure cristalline de ClbP et des expériences demutagenèse ont révélé un site actif à sérine et des caractéristiques structurales originales, qui sont compatiblesavec une activité peptidase, confirmée par des analyses biochimiques. Dix homologues de ClbP ont été identifiésin silico dans des ilots génomiques de synthases de peptides non ribosomaux d’espèces bactériennes proches etéloignées. Tous les homologues testés ont présenté une promiscuité fonctionnelle avec ClbP. ClbP est donc leprototype d’une nouvelle sous-famille de peptidases, qui sont probablement impliquées dans la maturation decomposés peptidiques non ribosomaux.Par ailleurs, nous avons réalisé deux études épidémiologiques sur la prévalence de l’ilot pks dansl’espèce E. coli dans deux contextes physiopathologiques, l’urosepsis et les cancers coliques et rectaux. L’ilotpks était significativement associé aux souches issues d’urosepsis comparé à des souches commensales, et auxsouches issues de biopsies de tumeurs coliques comparé à des souches commensales ou issues de biopsies detumeurs rectales, de diverticuloses et de lésions iléales de maladie de Crohn. / The pks genomic island of Escherichia coli and other Enterobacteriaceae encodes polyketide andnonribosomal peptide synthases that build a putative hybrid PK-NRP compound. This compound designatedColibactin induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.The pks-encoded enzymatic machinery comprises an essential protein ClbP, atypical for this type ofgenomic islands. We report that ClbP harbors a catalytic and periplasmic N-terminal part, and a C-terminal partassociated to the cytoplasmic membrane. ClbP crystal structure and mutagenesis experiments revealed a serineactivesite and original structural features, which are compatible with peptidase activity confirmed bybiochemical assays. Ten ClbP homologs were identified in silico in NRPS-encoding genomic islands of closeand distant-related bacterial species. All tested ClbP homologs showed functional promiscuity with ClbP. ClbPis therefore a prototype of a new subfamily of peptidases, which are probably involved for the maturation ofNRP compounds.Furthermore, we undertook two epidemiological studies on the prevalence of pks island in E. coli in twopathophysiology contexts; urosepsis and colorectal cancers. The pks island was significantly associated withurosepsis strains compared to commensal strains, and strains isolated from biopsies of colon tumors comparedwith commensal strains or strains isolated from biopsies of rectal tumors, diverticulosis and ileal lesions ofCrohn disease.

Durant l’exécution de l’apoptose, plus de 2 000 protéines sont protéolysées par les caspases, une famille de protéases à cystéine. Le clivage de plusieurs d’entre elles a pour effet d’interrompre les processus régulant le trafic intracellulaire. Durant mes études, je me suis intéressée à deux substrats potentiels des caspases, soit les sorting nexins SNX1 et SNX2. Leur clivage en N-terminal avait auparavant été identifié par protéomie dans des extraits cellulaires apoptotiques, respectivement aux sites LFAD91[flèche vers le bas]A et VSLD84[flèche vers le bas]S. Conjointement avec le complexe rétromère, SNX1 et SNX2 jouent un rôle essentiel dans le transport rétrograde de cargos, tel le récepteur lysosomal CI-MPR, des endosomes vers le TGN, évitant ainsi leur dégradation aux lysosomes. Notamment, l’association entre SNX1 et SNX2 et le complexe rétromère, via la sous-unité Vps35, requerrait leur domaine N-terminal, or, celui-ci est clivé durant l’apoptose. Dans le but de déterminer l’impact de la protéolyse de SNX1 et SNX2 sur la fonction du complexe rétromère et le transport rétrograde, nous avons étudié leur clivage par les caspases. Nos résultats indiquent qu’in vitro, les caspases initiatrices 8, 9 et 10 protéolysent SNX1 et SNX2 tandis que seule la caspase-6 exécutrice clive SNX2. Plusieurs fragments de SNX1 sont générés par le clivage à 16 sites, dont le site LFAD91[flèche vers le bas]A en N-terminal ainsi que plusieurs suivant un résidu glutamate. Durant l’apoptose, SNX2 est entre autres clivée par la caspase-6, et ce au site VSLD84[flèche vers le bas]S en N-terminal. Nous avons par la suite étudié l’effet de la protéolyse de SNX1 et SNX2 sur la fonction du complexe rétromère. Nos résultats démontrent que SNX2 tronquée, imitant le clivage au site VSLD84[flèche vers le bas]S, n’interagit plus avec Vps35, la sous-unité centrale du complexe rétromère. De plus, la déplétion de SNX1 et SNX2, récapitulant potentiellement leur protéolyse, a pour effet de délocaliser Vps26, une autre sous-unité du complexe rétromère. Par ailleurs, nous avons évalué l’effet de la protéolyse de SNX2 sur la régulation du récepteur Met, lequel serait régulé entre autres par SNX1 et SNX2. La déplétion de SNX2 induit une augmentation de la phosphorylation du récepteur Met et de ERK1/2 suivant sa stimulation. De plus, l’ARNm de SNX1 et SNX2 sont tous deux réduits dans les tissus de tumeurs de patients atteints du cancer colorectal (CCR) et une diminution des niveaux de SNX2 corrèle avec une hausse de mortalité chez ces patients. Pour conclure, notre étude démontre un effet direct de la protéolyse de SNX2 sur le complexe rétromère durant l’apoptose et suggère un lien entre SNX2 et la pathogenèse du CCR. / Abstract: During the execution of apoptosis, more than 2,000 proteins are proteolysed by caspases, a family of cysteine proteases. The cleavage of several of them results in the interruption of intracellular trafficking processes. During my studies, I investigated two potential caspases substrates, namely the sorting nexin SNX1 and SNX2. Their cleavage at their N-terminus has previously been identified in apoptotic cell lysates by proteomics, respectively at LFAD91[down arrow]A and VSLD84[down arrow]S sites. Together with the retromer complex, SNX1 and SNX2 play an essential role in the retrograde transport of cargos, such as the lysosomal receptor CI-MPR, from endosomes to TGN, thus avoiding their degradation by lysosomes. In particular, the association between SNX1 and SNX2 and the retromer complex, via the Vps35 subunit, seems to require their N-terminal domain, which is thought to be cleaved during apoptosis. To determine the impact of SNX1 and SNX2 proteolysis on the function of the retromer complex and retrograde transport, we have first studied their cleavage by caspases. Our results indicate that in vitro, initiator caspases 8, 9, and 10 proteolyze SNX1 and SNX2 while only executioner caspase-6 cleaves SNX2. Several fragments of SNX1 are generated by the cleavage of up to 16 sites, including at the N-terminus LFAD91[down arrow]A site and following glutamate residues. During apoptosis, SNX2 is directly cleaved by caspase-6 at the site VSLD84[down arrow]S in its N-terminus. We next investigated the effect of SNX1 and SNX2 proteolysis on the function of retromer complex. Our results demonstrate that truncated SNX2, mimicking cleavage at the VSLD84[down arrow]S site, no longer interacts with Vps35, the central subunit of retromer complex. Furthermore, depletion of SNX1 and SNX2, potentially recapitulating their proteolysis, redistributes Vps26, another retromer subunit. In addition, we evaluated the effect of SNX2 proteolysis on the regulation of Met receptor, which has been shown to be regulated by SNX1 and SNX2. SNX2 depletion induces an increase in Met and ERK1/2 phosphorylation after stimulation. In addition, both SNX1 and SNX2 mRNAs are reduced in tumor tissues of colorectal cancer patients and decreased expression levels of SNX2 correlates with increased mortality. In conclusion, our study demonstrates a direct effect of SNX2 proteolysis on retromer complex association during apoptosis and suggests a link between SNX2 and the pathogenesis of colorectal cancer.

La tyrosine kinase cytoplasmique Src est un régulateur clé de la signalisation induite par les facteurs de croissance et les intégrines. Src présente des propriétés oncogéniques lorsqu'elle est dérégulée, une situation fréquemment retrouvée dans les cancers colorectaux (CCR). Sous sa forme activée, Src participe à la croissance tumorale et à la formation de métastases. Cependant, les mécanismes de dérégulation impliqués sont mal connus. En effet, SRC est rarement muté dans ces cancers. Mon travail de thèse a mis en évidence un nouveau mécanisme de dérégulation de Src via l'inactivation de SLAP. SLAP est une protéine de signalisation de type adaptateur qui régule négativement la signalisation lymphocytaire. De part son association avec l'E3-ligase Cbl, il induit la dégradation de substrats importants de la tyrosine kinase Lck nécessaires à l'activation lymphocytaire. Je montre que SLAP est également exprimé dans le tissu épithélial colique et que son expression est fréquemment perdue au cours de la progression tumorale colorectale. SLAP inhibe la tumorigénicité et le potentiel métastasant des cellules de CCR. Sur le plan moléculaire, SLAP définit une boucle de rétrocontrôle d'une voie oncogénique Src/EphA2/Akt initiée par Src via la dégradation protéasome-dépendante du récepteur EphA2 impliquant l'ubiquitine E4-ligase UBE4A. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d'induction oncogénique de Src, une fonction insoupçonnée de suppresseur de tumeurs de SLAP et montrent l'importance d'une E4-ligase et des protéines adaptatrices dans la régulation négative de la signalisation initiée par les tyrosine kinases dans la progression tumorale. / The cytoplasmic tyrosine kinase Src mediates intracellular signaling induced by growth factors and integrins. When deregulated, Src acquires oncogenic properties. Src deregulation largely occurs in the absence of mutation of the corresponding gene but the underlying molecular mechanisms involved in this process are still unclear. Here I uncovered a novel mechanism of Src oncogenic induction in colorectal cancer (CRC) via SLAP silencing. SLAP is an adaptor protein and signaling molecule that controls lymphocytes activation. By association with E3-ligase Cbl, SLAP induces proteasomal degradation of important components of T cell receptor signaling, which impedes lymphocytes activation. I show that SLAP is also expressed in the epithelial tissue of the colon, but its expression is frequently lost during tumorigenesis. I also show that SLAP controls tumorigenicity and invasiveness of CRC cells. At the molecular level, SLAP specifies a feedback loop of a Src/EphA2/Akt oncogenic signaling that is initiated by Src itself. Precisely, phosphorylation of EphA2 on Tyr594 by Src creates a binding site for SLAP-SH2 to elicit receptor degradation. This novel SLAP function is independent of Cbl but requires its interaction with the E4-ligase UBE4A. SLAP down-regulation observed in cancer cells dramatically increases EphA2 levels and amplifies a Src/EphA2/Akt signaling required for cell tumorigenicity. Thus, SLAP inactivation defines a novel mechanism of Src oncogenic induction in human cancer.

DNA methylation is a major form of epigenetic modification and involves the addition of a methyl group covalently to the 5-position of the cytosine pyrimidine ring, mostly within the context of CpG dinucleotides in vertebrate somatic cells. Methylation of CpG dinucleotides at promoter regions is generally associated with transcriptional repression. In this context, the methyl-CpG binding proteins (MeCPs) that are capable of recognition of methylated CpG dinucleotides are proposed to play a central role in DNA methylation associated transcriptional repression. Methyl-CpG binding domain protein 4 (MBD4) is an MeCP that possesses a glycosylase domain at its C-terminal, which can excise and repair both G:T and G:U mutations derived from DNA deamination at CpG dinucleotides, in addition to its Nterminal MBD binding domain. MBD4 has been associated with a number of pathways including DNA repair, apoptosis, transcriptional repression, and possibly DNA demethylation processes. However, the precise contribution of MBD4 to these processes remains unclear. To explore the functional repertoire of MBD4 I decided to undertake multiple protein interaction studies to identify potential partner proteins. I performed yeast 2-hybrid screens with an 11.5 day mouse embryonic cDNA library and multiple mass spectrometry of immunoprecipitates of tagged versions of MBD4 that were over-expressed in human cell lines. I detected ~380 potential interacting candidates with these assays. A significant number of candidates were detected in both assay systems. Chosen candidates were further validated by reciprocal co-IP of expressed partners and by immunofluorescence (IF) microscopy to determine their potential co-localisation in mouse and human cell lines. Subsequently, I identified the intervening domain of MBD4 as a novel protein interaction region for tested candidates. My analysis suggests that MBD4 can have a role in regulation of post-replication methyl-error repair/methylation machinery through its direct interaction with DNMT1 (previously shown), UHRF1 (novel) and USP7 (novel), as well as possible cross-talk to histone modification and chromatin remodelling pathways, through partners such as PRMT5 and ACF1. Interestingly the transcription regulatory components KAP1 and CFP1 not only interact with but also dramatically influence the stability of exogenously expressed MBD4 in human cells. In general positive validation by IP and IF demonstrates the robustness of the initial screens, and implies that MBD4 may impact upon several transcriptional and epigenetic networks along with a number of nuclear pathways that include transcriptional repression, DNA repair and RNA processing. To test for transcriptional aberration in the absence of Mbd4 function I profiled two independent mouse cell lines that lack MBD4 activity using Illumina MouseWG-6 v2.0 Expression BeadChip arrays. A number of genes were identified that are significantly up- or down- regulated in both Mbd4-/- MEFs. This included mis-expression of insulin-like growth factor-binding proteins and two paternally imprinted genes Dio3 and H19. The cohort of genes that were mis-expressed in the Mbd4-/- MEFs overlap with genes that responsed to tamoxifen exposure in an ER-positive ZR-75-1 xenograft model. In response to this observation I identified a potential interaction between MBD4 and estrogen receptor α (ERα) by co-IP and IF co-localisation. This suggests that MBD4 might potentiate transcription of estrogen regulated genes via a direct interaction with ERα, supporting a possible link between replication repair remodelling and steroid/thyroid hormone receptor transcriptional regulation. Additionally I performed a pathway analysis by which several developmental genes including Sox9, Klf2 and Klf4, were prioritised as possible MBD4 targets. On this basis I propose a role for MBD4 in acquired diseases such as cancers and autoimmune diseases via transcriptional regulation. I also performed a comparison of MBD4 DNA binding activity with MBD4 homologues from the Medaka fish (Oryzias latipes) and the amphibian, Xenopus laevis. I could show that DNA binding specificity to a series of methylated and mismatched probes is conserved regardless of the poor sequence conservation of the MBD domain of MBD4 between the species. I conclude that MBD4 is integrated in multiple pathways in the nucleus that includes DNA repair, chromatin remodelling, transcriptional regulation and genome stability.

Le cancer colorectal (CCR) demeure l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Récemment, une nouvelle immunothérapie basée sur le ciblage du récepteur à activité tyrosine kinase (RTK) EGFR via l'anticorps cetuximab a montré une amélioration significative de la survie des patients atteints de CCR métastatique (CCRm). Cependant, une grande partie de ces patients présente une résistance qui est associée à la présence de mutations gains de fonction dans la voie de signalisation Ras. Dans ce contexte, l'identification de cibles thérapeutiques Ras-indépendantes pourrait avoir un intérêt particulier. Une analyse pharmacologique effectuée au laboratoire démontre que le nilotinib, un inhibiteur de la TK oncogénique BCR-ABL utilisée en clinique pour le traitement des leucémies myéloïdes chroniques, affecte également les propriétés invasives et métastatiques de cellules de CCR. Nous avons identifié la cible majoritaire de cet inhibiteur dans cette réponse tumorale : il s'agit de DDR1, un récepteur au collagène ayant une activité TK intrinsèque. Mon travail de thèse a mis en évidence que DDR1 est fréquemment et fortement activé dans les métastases de patients atteints de CCR. J'ai ensuite analysé la signalisation DDR1-dépendante dans ces cellules tumorales par phosphoprotéomique quantitative. Cette analyse montre la nature Ras-indépendante de cette signalisation et révèle la protéine de signalisation BCR comme un nouveau substrat essentiel de DDR1 pour induire l'invasion cellulaire. Enfin, je montre que l'inhibition de DDR1 par le nilotinib améliore la réponse au cetuximab y compris pour les cellules tumorales ayant une mutation oncogénique de K-Ras ou B-Raf. En conclusion, ces résultats suggèrent que le ciblage de DDR1 par le nilotinib pourrait avoir un intérêt thérapeutique dans le traitement des CCRm. / Colorectal cancer (CRC) is one of the leading causes of cancer-related death in the Western world. Cancer that metastasizes to distant sites is usually not curable, although chemotherapy can extend survival. Recently, a novel immunotherapy approach based on targeting the EGFR tyrosine kinase (TK) via the antibody cetuximab was shown to significantly improve the survival of patients with metastatic CRC (mCRC). However, only patients with wild-type KRAS may hope to gain from EGFR inhibition. The majority of patients expresses oncogenic K-Ras alleles and thus have hyperactive Ras cascade operating independently from EGFR. Therefore, there is an urgent need for discovery of a new Ras-independent target that regulates tumor cell invasion and metastasis in mCRC. A pharmacological approach in the lab revealed that the small inhibitor of the leukemic TK BCR-Abl also inhibits invasive and metastatic abilities of CRC cells. This effect was also observed in cells expressing deregulated KRAS signalling. We next identified the receptor for collagen and atypical TK DDR1 as that the main target of nilotinib in these cells. Accordingly, DDR1 was found frequently and strongly activated in metastatic nodules of CRC patients. I also characterized DDR1 signalling by quantitative phosphoproteomic. This analysis revealed the Ras-independent nature of DDR1 signalling but also the Rho GTPase regulator BCR as an essential DDR1 substrate that leads to cell invasion. Finally, I demonstrate that nilotinib potentiates cetuximab response in CRC cells expressing oncogenic K-Ras signaling. Overall, these results suggest that the targeting of DDR1 by nilotinib may be of therapeutic value in mCRC.

Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1 / The neurotrophin receptor TrkC was recently identified as a dependence receptor, and, as such, it triggers apoptosis in the absence of its ligand, NT-3. Indeed cells that express these receptors are thought to be dependent on ligand availability for their survival, a mechanism that inhibits uncontrolled tumor cell proliferation and migration. TrkC, as a classic tyrosine kinase receptor, is generally considered to be a proto-oncogene. We show that TrkC expression is down-regulated in a large fraction of human colorectal cancers, mainly through promoter methylation. Moreover, we show that TrkC silencing by promoter methylation is a selective advantage for colorectal cell lines to limit tumor cell death. Furthermore, reestablished TrkC expression in colorectal cancer cell lines is associated with tumor cell death and inhibition of in vitro characteristics of cell transformation, as well as in vivo tumor growth. Together, these data support the conclusion that TrkC is a colorectal cancer tumor suppressor. TrkC triggers apoptosis in the absence of its ligand NT-3 : the molecular mechanism for apoptotic engagement involves the double cleavage of the receptor's intracellular domain, leading to the formation of a proapoptotic fragment (TrkC KF). We show that TrkC KF interfacts with Cobra1, a putative cofactor of BRCA1, and that Cobra1 is required for TrkC-induced apoptosis. Cobra1 shuttles TrkC KF to the mitochondria, where it promotes apoptosome-dependent apoptosis. Thus, we propose that, in the absence of NT-3, the proteolytic cleavage of TrkC leads to the release of a killer fragment that triggers mitochondria-dependent apoptosis via the recruitment of Cobra1

L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentielles. / Intracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules.