Les histones désacétylases HDAC1 et HDAC2 catalysent le retrait d’un groupement acétyle de résidus lysine, dans des protéines histones et non-histones. Les HDAC contrôlent la prolifération, la mort et la différenciation cellulaire. Des propriétés anti-inflammatoires et anti-tumorales ont été attribuées à des inhibiteurs contre les HDAC (HDACi), notamment dans les cellules épithéliales intestinales (CEI). Nous supposons que différents niveaux de HDAC1 ou HDAC2 dans les CEI induisent différentes réponses dans le maintien de l’homéostasie intestinale. Nous avons donc généré des souris hétérozygotes avec un seul allèle de Hdac1 ou Hdac2 dans le contexte de la délétion de l’autre. Les résultats indiquent que les souris Hdac1-/-;Hdac2+/- Villine-Cre présentent un phénotype similaire à celui d’un double mutant, à savoir des défauts d'architecture dans le jéjunum et le côlon, de la dysplasie et hyperplasie, une réduction du nombre de cellules à mucus, mais sans modification du nombre de cellules de Paneth et de la perméabilité épithéliale. Un allèle de Hdac2 n'est donc pas suffisant pour maintenir une homéostasie normale en l'absence de Hdac1. Nous avons aussi vérifié l’effet de la délétion de Hdac1 et Hdac2 à l’âge adulte dans le modèle inductible AhCre. Dans ce contexte, la perte de Hdac1 et Hdac2 entraîne une mortalité accrue après 8 jours, avec un arrêt de prolifération et l’induction de dommages à l’ADN. Nous avons alors exploré l’impact moléculaire de la perte des deux Hdac dans les CEI par une approche protéomique et transcriptomique. Nous avons observé des changements notables dans plusieurs voies de signalisation, associées à la prolifération, à des mécanismes de stress, au métabolisme, surtout lipidique. Ces changements sont en partie régulés post-traductionnellement. Bien que très instructifs, les modèles in vivo ne permettent pas de déterminer si les modifications de l’expression des gènes observées sans Hdac1 et/ou Hdac2 sont intrinsèques aux CEI ou si ces changements dépendent de signaux extrinsèques de la muqueuse ou de la lumière intestinale. Nous avons donc établi des cultures d’entéroïdes à partir de la crypte intestinale, ce qui permet la croissance, l'expansion et la différenciation des CEI progénitrices, sans l’influence de l’environnement. Nous avons entrepris des analyses protéomiques de type SILAC, suite à une inhibition pharmacologique des HDAC de type I, le CI994, ou suite à une délétion génétique de Hdac1 ou Hdac2. L’inhibition pharmacologique entraine un arrêt de prolifération associé à une différenciation altérée en faveur des cellules absorbantes, rappelant le modèle murin sans Hdac1 et Hdac2. Les voies liées à la réplication de l’ADN et au cycle cellulaire sont diminuées. Même si la perte de Hdac1 ou Hdac2 n’affecte pas notablement la croissance et la différenciation des entéroïdes, des voies associées au métabolisme et aux réponses à l’environnement sont augmentées. Au contraire, des entéroïdes sans Hdac1 et Hdac2 ne croissent pas en culture et dégénèrent en moins de 3 jours. Ceci suggère que l’environnement mucosal pourrait soutenir les CEI Hdac1-/-;Hdac2-/- de la niche épithéliale in vivo. Nos données suggèrent que des variations intrinsèques ou extrinsèques de l'activité de HDAC1 et HDAC2 modifient la réponse des CEI à l’environnement et entraînent des perturbations de l'homéostasie intestinale.

Les BMPs (Boue Morphogenetic Proteins) sont des morphogènes membres de la superfamille du TGF-[bêta] qui interagissent avec des récepteurs de surface cellulaire à activité sérine/thréonine kinase. L'interaction des BMPs avec ces récepteurs entraîne l'activation d'une cascade de signalisation cellulaire impliquant les facteurs de types R-Smads (Smad1, 5 et 8). La voie de signalisation des BMPs joue des rôles cruciaux dans des processus biologiques tels que l'embryogenèse et l'organogenèse des tissus ainsi que des processus cellulaires tels que la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire. De plus, ces derniers semblent aussi impliqués dans les processus de mort cellulaire et dans la tumorigenèse. Malgré un intérêt grandissant pour la signalisation des BMPs, il existe très peu d'études sur les rôles spécifiques joués individuellement par les différents Smads dans la morphogenèse de l'intestin in vivo . Ceci est principalement dû au fait que la délétion classique des différents effecteurs de la voie des BMPs entraîne la mort in utero à cause de multiples défauts dans l'embryogenèse. Le système Cre/loxP, sous le contrôle d'un promoteur tissu spécifique, a été utilisé dans notre laboratoire, dans le but de générer une lignée murine possédant une délétion conditionnelle de l'effecteur Smad5 strictement au niveau de l'épithélium intestinal. Une analyse comparative à l'aide d'un modèle de délétion conditionnelle du récepteur BmpR1a au niveau de l'épithélium intestinal a été effectuée afin de décortiquer spécifiquement le rôle de l'effecteur Smad5 dans le développement de cet organe. Afin de valider les résultats obtenus in vivo nous avons généré un modèle cellulaire nous permettant de mimer l'effet de la délétion de l'effecteur Smad5 à l'aide de la technologie du shRNA.Les résultats obtenus dans les deux modèles suggèrent que Smad5 serait un facteur clé impliqué dans la régulation de la migration cellulaire des entérocytes. En effet, l'invalidation de la voie des BMPs et plus particulièrement de l'effecteur Smad5 dans les souris entraîne une augmentation de la vitesse de migration des cellules le long de l'axe crypte villosité. Ces résultats sont corroborés dans un modèle cellulaire dans lequel l'expression de Smad5 a été inhibée par interférence d'ARN. Dans ce modèle, la migration se fait de façon beaucoup plus compacte en comparaison aux cellules contrôles. L'augmentation de la vitesse de migration cellulaire pourrait être due à un phénomène de relocalisation des protéines de jonctions adhérentes ainsi qu'à une modulation de l'actine filamenteuse. Ce phénomène pourrait faire intervenir les petites protéines G Rho/Rac ainsi que les kinases Src. En plus de l'actine filamenteuse, différentes protéines impliquées dans la formation des complexes de jonctions adhérentes semblent relocalisées dans nos deux modèles (E-cadhérine/[bêta]-caténine). En conclusion, les différents résultats recueillis au cours de mes travaux de maîtrise dans le laboratoire du Dr. Nathalie Perreault nous suggèrent que l'effecteur Smad5 de la voie des BMPs serait un facteur impliqué dans la stabilité des complexes de jonctions adhérentes, régulant ainsi la migration des cellules le long de l'axe crypte villosité.

Le cadmium (Cd) est un métal lourd auquel la population en générale est exposée par l'alimentation. L'épithélium intestinal accumule beaucoup de Cd ingéré et représente un organe cible. Étant donné le rôle de cet épithélium dans la biotransformation de xénobiotiques ingérés, l'objectif de notre étude était d'évaluer dans quelle mesure une exposition chronique au Cd peut perturber l'expression des enzymes de biotransformation lors de la différenciation des entérocytes. Comme modèle in vitro, nous avons utilisé la lignée cellulaire humaine Caco-2 qui développe spontanément un phénotype entérocytaire. Le Cd étant connu pour troubler certaines voies de signalisation cellulaires, nous avons testé les hypothèses suivantes : 1) ce métal pourrait modifier l'expression (niveaux et/ou profil) des enzymes de biotransformation; 2) il serait susceptible d'altérer le processus de différenciation. Le profil d'expression d'enzymes de biotransformation (CYP1A1, CYP3A4 et GSTP1) a été caractérisé par RT-PCR en fonction du temps de culture : les niveaux d'ARNm de la GSTP1, de la P-gp et du CYP1A1 augmentent durant la différenciation. Parallèlement, nous avons estimé par mesure d'activité MTT (viabilité cellulaire), la LC5, soit la concentration d'exposition menant à 5% de mortalité. Lorsque les cellules sont exposées durant la phase de prolifération, une période de récupération augmente considérablement la viabilité (LC5 = 87 ± 4 vs. 15.2 ± 0.7 µM). Une LC5 de 36 ± 2 µM est obtenue lorsque les cellules sont traitées pendant la phase de différenciation montrant que la période de sensibilité maximale est pendant la prolifération. Étant donné les profils d'expression obtenus selon le temps de culture des quatre enzymes d'intérêt dans les cellules Caco-2 témoins, nous avons choisi la LC5 de 36 ± 2 µM comme concentration d'exposition pendant la phase de différenciation pour tester l'effet du Cd. Une exposition chronique à cette concentration de Cd perturbe le profil d'expression d'enzymes. De plus hauts niveaux d'ARNm de GSTP1 et de la P-gp sont alors observés mais cette induction par le Cd est diminuée en présence de vitamine D3 ou de NAC, toutes deux antioxydantes. Ainsi, l'effet du Cd sur la GSTP1 et la P-gp serait médié par un déséquilibre rédox. Des mesures d'activités enzymatiques de CYP1A1 et de GSTP1 ont été effectuées afin de corréler l'effet du Cd sur les niveaux d'ARNm aux activités. Une activité extrêmement faible d'environ 0,290 pmol/min/mg de protéines microsomales a été mesurée dans les cellules contrôles et traitées au Cd de 21 jours, soit presque 100 fois moins que ce qui est rapporté dans la littérature, mais plusieurs études ont révélé l'effet inhibiteur du Cd sur l'activité EROD. Deux types de réponses sont observées quant à l'effet du Cd sur l'activité de la GST: (1) une légère stimulation, (2) une faible inhibition. Nous avons également mesuré une diminution de la résistance électrique transépithéliale confirmant ainsi que le Cd affecte l'intégrité de l'épithélium intestinal en augmentant la perméabilité paracellulaire. Par ailleurs, nos récents résultats suggèrent que le Cd diminue l'activité de la phosphatase alcaline, un marqueur de différenciation. Néanmoins, les enzymes de biotransformation n'étaient pas toutes affectées de la même façon, l'effet du Cd sur ces enzymes n'est pas le résultat (indirect) d'une action "non spécifique" sur le processus global de différenciation. Nos résultats montrent que l'exposition intestinale au Cd pourrait avoir des répercussions sur le métabolisme de premier passage des médicaments et autres xénobiotiques absorbés oralement. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules Caco-2, épithélium intestinal, cadmium, entérocyte, CYP1A1, CYP3A4, GSTP1

Le Zinc (Zn) est un métal important pour de nombreux processus physiologiques, notamment dans le métabolisme osseux. Cette étude a pour objectif d'évaluer l'implication possible de transporteurs de zinc (ZIP) dans l'influx de Cd dans la cellule. Le cadmium (Cd), métal cancérigène pour l'homme est suspecté d'emprunter certains ZIP, en particulier ZIP4 responsable de l'absorption intestinale du Zn, par mimétisme ionique. Des études montrent que ZIP8 participe à l'accumulation de Cd dans certains tissus. Parallèlement à la lignée cellulaire intestinale Caco-2, indifférenciés (J7) et différenciés (J21), la lignée ostéoblastique MG63 a été choisie. L'expression d'acide ribonucléique messager (ARNm) de ZIP 1, 4, 8 et hZTL1 a été déterminée par transcription inverse et polymérisation en chaîne (RT-PCR). Dans les cellules Caco-2, l'expression de ZIP8 et de hZTL1 est stable, celle de ZIP4 augmente avec la différenciation tandis que l'expression de ZIP1 diminue avec celle-ci. Les cellules MG63 expriment les ZIP et hZTL1 à des niveaux comparables. La détection par immunofluorescence de ZIP4 à la membrane des cellules Caco-2 confirme les résultats obtenus par RT-PCR. Le transport de 109Cd (0.5 µM) a été mesuré dans plusieurs conditions expérimentales afin de tester une éventuelle compétition entre le Zn, le Cd et le manganèse (Mn). Dans les cellules Caco-2 (J7, J21), les pourcentages d'inhibition (70% du transport saturable) par le Zn et le Mn sont comparables. Dans les cellules MG63, l'accumulation de 109Cd est plus fortement inhibée par le Zn que par le Mn. L'ajout de HCO3- augmente l'inhibition par le Zn et le Mn. Ces résultats suggèrent que ZIP8 et ZIP4 sont impliqués en partie dans l'accumulation de Cd. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellules Caco-2, cellules MG63, zinc, ZIP4, ZIP8, cadmium

GATA-4 est un facteur de transcription essentiel dans la formation du tube cardiaque primitif. Dans l'intestin, GATA-4 joue un rôle dans le développement et dans le maintien de l'identité jujéno-iléale. L'analyse par micropuce à ADN effectuée sur des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 suggère un rôle de GATA-4 dans la réponse inflammatoire et des études antérieures réalisées au laboratoire ont permis de confirmer l'implication de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire C/EBPdépendante. L'objectif de mon projet était de déterminer si GATA-4 module la réponse inflammatoire par d'autres mécanismes que ceux déjà découverts au laboratoire et de générer des mutants de GATA-4 pour caractériser l'implication de certains domaines et sites spécifiques de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire intestinale. Des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 ou des mutants de GATA-4 de façon stable, induites ou non à l'IL-1[béta] ont été utilisées comme modèle. L'activation des voies MAPK et Akt a été vérifiée par immunobuvardage de type Western. La liaison à l'ADN des facteurs de transcription AP-1, C/EBPs et NF-[kappa]B a été vérifiée par gel de rétention. L'expression de certains gènes de réponse inflammatoire a été vérifiée par RT-PCR. Finalement, des lignées cellulaires exprimant des mutants de GATA-4 ont été partiellement caractérisées. Mes résultats montrent qu'une surexpression de GATA-4 dans les IEC-6 traitées à l'IL-1[béta] réduit la phosphorylation de p42/p44 et d'Akt. Les facteurs de transcription AP-1, C/EBP et NF-[kappa]B sont davantage recrutés à l'ADN. La nature de leurs complexes semble être également affectée. Cette induction de liaison coïncide avec une baisse d'expression des gènes pro-inflammatoires CCL5 et iNOS. La caractérisation des mutants de GATA-4 suggère que le premier doigt de zinc (216-240) pourrait moduler la morphologie cellulaire et que la région basique (294-336) pourrait contribuer à la vitesse de prolifération augmentée des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4. En somme, mes résultats suggèrent que GATA-4 pourrait participer à l'instauration d'une tolérance immunitaire prenant place lors de la différenciation entérocytaire.

Les tumeurs sont caractérisées par une croissance exacerbée ainsi qu’une capacité à pouvoir se disséminer dans l’organisme. Ces deux aspects sont assurés en partie par une expression et une sécrétion soutenues de protéases. Plus particulièrement, une expression importante et une délocalisation de la protéase à cystéine cathepsine B corrèle avec les pouvoirs métastatiques de plusieurs types de tumeurs. La cathepsine B est une protéase lysosomale dont le rôle majeur est de dégrader les protéines en fin de vie. Dans les cancers colorectaux, l’épithélium colique possède une importante activité cathepsine B dès l’apparition d’adénomes précoces, mais aussi dans des tumeurs avancées et métastatiques. Par ailleurs, une expression et une activité importante de cette enzyme sont des indices de mauvais pronostics de survie chez les patients atteints de cancers colorectaux. Le but de ce travail a été d’évaluer l’importance de la cathepsine B dans les processus tumorigéniques de lignées cancéreuses colorectales. Pour cela, nous avons analysé les statuts d’expression, de sécrétion et d’activité de la cathepsine B dans les cellules normales HIEC comparativement à sept lignées cancéreuses colorectales humaines. La cathepsine B est sécrétée par les lignées cancéreuses et par les cellules HIEC qui expriment néanmoins de hauts niveaux de cathepsine B intracellulaire et sécrètent la forme non-active de la cathepsine B. Par ailleurs, nous avons employé la technique d’interférence à ARN ciblant spécifiquement les transcrits de la cathepsine B dans deux lignées cancéreuses colorectales afin d’en évaluer l’impact sur leurs capacités de croissance et d’invasion. Le ciblage de la cathepsine B réduit de manière modeste la croissance sur plastique de ces deux lignées cancéreuses ; cependant, leur potentiel à former des colonies en indépendance d’ancrage ainsi que leur capacité à migrer et envahir la matrice extracellulaire sont drastiquement affectés par la baisse de cathepsine B. En parallèle, le ciblage pharmacologique des formes actives et sécrétées de la cathepsine B réduit les pouvoirs d’invasion des cellules cancéreuses sans interférer avec leur capacité à former des colonies en indépendance d’ancrage. De plus, nous avons pu montrer que le ciblage moléculaire de la cathepsine B dans les deux lignées cancéreuses réduit de manière importante leurs capacités tumorigéniques chez la souris. L’analyse biochimique des tumeurs sous-exprimant la cathepsine B révèle des niveaux plus importants de l’inhibiteur du cycle cellulaire p27[indice supérieur Kip1] ainsi qu’une réduction de la cycline B. Enfin, nous avons montré que la cathepsine B a la capacité de cliver directement l’inhibiteur p27[indice supérieur Kip1], contribuant ainsi à sa dérégulation dans le cancer colorectal. De plus, la génération d’un mutant de p27[indice supérieur kip1] non clivable par cette enzyme permet d’augmenter de manière significative la stabilité de l’inhibiteur. En résumé, l’ensemble de ces travaux montre que la cathepsine B est un acteur important dans les caractères tumoraux des cellules cancéreuses colorectales et que son ciblage moléculaire et/ou pharmacologique pourrait être une approche valide pour réduire l’expansion de ces tumeurs chez l’humain.

Des pathologies lourdes, telles que les dystrophies de la rétine et certains cancers, impliquent une désorganisation de l'épithélium et la famille Crb, dont la protéine apicale Crumbs3 (isoformes Crb3A et Crb3B) fait partie. Les protéines transmembranaires Crb possèdent un domaine intracellulaire fortement conservé et des partenaires communs. Il est donc essentiel de comprendre comment ces protéines Crb sont régulées afin de mieux appréhender ces pathologies. Pour cela, j'ai étudié le complexe de polarité apical Crb3A (Crb3A, Pals1, PATJ) impliqué dans l'établissement et le maintien de la polarité apico-basale. Je me suis, tout d'abord, intéressée à la régulation des isoformes de Crb3 par leurs partenaires (Pals1 et PATJ), puis, à la régulation des protéines de la membrane apicale, dont Crb3A, par la Drebrine E2, un nouveau partenaire de Crb3A impliqué dans l'organisation du cytosquelette d'actine et la morphogenèse apicale. Mon travail a permis de mettre en évidence: 1) la régulation de la dynamique membranaire des isoformes de Crb3 par PATJ dans les cellules Caco-2/TC7, une lignée épithéliale intestinale humaine, mais aussi, 2) d'identifier une nouvelle fonction de la Drebrine E2 dans la régulation du trafic de plusieurs protéines de la membrane apicale dans ces cellules, dont, par exemple, la DPPIV (DiPeptidyl Peptidase IV). Dans les cellules déplétées en Drebrine E2, l'expression des protéines apicales est diminuée et leur endocytose est augmentée, puis, elles sont relocalisées dans le compartiment majeur de dégradation, le lysosome. / Some serious diseases like retinal dystrophies and some cancers involve epithelial cells disorganization and the Crumbs (Crb) proteins family. The apical Crb3 (Crb3A and Cr3B isoforms) protein belongs to Crb family. The transmembrane proteins Crb have a conserved intracellular domain with common partners. It is unclear how Crb proteins are regulated by their partners and this information is required to better understand these pathologies. Here, we decided to study the apical polarity Crb3A complex (Crb3A, Pals1, PATJ) which is involved in apico-basal polarity establishment and maintenance. First, I investigated Crb3 isoforms regulation by their partners (Pals1 and PATJ). Then, I studied the regulation of apical membrane proteins, such as Crb3A, by Drebrin E2, a new partner of Crb3A which is involved in actin cytoskeleton remodeling and apical morphogenesis. During my thesis, I demonstrated: 1) the regulation of Crb3 isoforms dynamics by PATJ in Caco-2/TC7 human intestinal epithelial cells, but also, 2) a new function for Drebrin E2 in regulating the trafficking of apical membrane proteins, like DPPIV (DiPeptidyl Peptidase IV). In Drebrin E2 KD cells, apical membrane proteins expression is decreased and we observe an increased endocytosis. This leads to relocalization of the apical membrane proteins to the main degradative compartment, the lysosome. These new datas suggest a role for Drebrin E2 in the regulation of apical membrane proteins recycling pathway. The Drebrin E2 KD cells phenotype is reminiscent of the microvillar inclusions disease (MVID). Now, I am trying to investigate the link between theses pathways.

Les particules de dioxyde de titane (TiO2) sont utilisées dans de nombreux secteurs industriels du fait de leurs propriétés physiques et chimiques intéressantes. Depuis une dizaine d’années, elles sont également utilisées sous forme nanoparticulaire car la taille nanométrique leur apporte de nouvelles propriétés, recherchées dans certaines applications industrielles. Elles sont par exemple utilisées comme colorant blanc dans le secteur de la cosmétologie, de la pharmacologie et dans les industries agroalimentaires. Dans ces dernières, l’utilisation de ces particules est autorisée car le TiO2 est un composé insoluble et relativement inerte. Le colorant alimentaire E171, autorisé depuis 1966, est ainsi constitué de particules de TiO2, initialement sous forme micrométrique, mais il s’avère que selon les procédés de fabrication, entre 10 et 43 % (selon les études) de ces particules présentent un diamètre inférieur à 100 nm, i.e. sont sous forme nanométrique. Ce n’est pas un nanomatériau du point de vue de la définition européenne, il n’est donc pas soumis à l’obligation d’étiquetage dans les produits alimentaires. Le E171 est présent dans de nombreux aliments sans que son impact sur la santé humaine, après ingestion, n’ait été clairement documenté. De plus en plus d’études s’intéressent à la toxicité des nanoparticules (NPs) après leur ingestion, mais peu d’entre elles ont été menées avec le E171 à proprement parler. Les études in vivo et in vitro publiées à ce jour démontrent que les NPs de TiO2 sont peu toxiques. Leur absorption intestinale et leur translocation vers le système sanguin puis des organes secondaires est faible. Les principaux effets décrits sont une augmentation des espèces réactives de l’oxygène associées à un stress oxydant, l’induction de marqueurs de l’inflammation, et plus récemment l’induction du stress du réticulum endoplasmique. Des effets sont également rapportés sur différents paramètres de la barrière intestinale, i.e. le microbiote, le mucus, les transporteurs membranaires, les jonctions cellulaires et l’immunité intestinale. Chez certaines personnes, cette barrière est compromise, elles sont donc potentiellement plus sensibles aux micros et nanos-particules contenues dans l’alimentation. Leur épithélium intestinal est enflammé, et à long terme, ces personnes peuvent développer des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et dans les cas les plus graves, des cancers.L’objectif de cette thèse est d’étudier la toxicité du colorant alimentaire E171 et d’approfondir les connaissances relatives à l’impact des NPs de TiO2 sur le système gastro-intestinal. Pour cela, nous avons travaillé avec différents modèles cellulaires d’épithélia intestinaux humain, un modèle d’épithélium jointif composé d’entérocytes Caco-2, un modèle d’épithélium sécrétant une couche de mucus, composé de cellules Caco-2 et HT29-MTX et enfin un modèle d’épithélium bordant les plaques de Peyer, composé des cellules Caco-2(C1) et RajiB. Ces modèles cellulaires ont été exposés de façon aigüe (6 h, 24 h et 48 h) ou chronique (21 jours), au colorant E171 ainsi qu’à deux NPs de TiO2 : A12, qui a la même structure cristalline que le E171 et P25, une NP très documentée dans la littérature. Nos résultats montrent que le E171 et les NPs de TiO2 sont modérément toxiques, ils n’engendrent pas de mortalité cellulaire ni de dommages à L’ADN. Néanmoins, ils provoquent une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène intracellulaires et modulent certains marqueurs impliqués dans le stress oxydant, le stress du réticulum endoplasmique et l’inflammation. Ils impactent également la sécrétion et la composition de la couche de mucus, l’expression des transporteurs ABC, qui sont des paramètres impliqués dans la fonction de barrière de l’épithélium intestinal, le rendant possiblement plus vulnérable aux agressions extérieures. / Micro-sized titanium dioxide (TiO2) particles are used for years by industrials for their attractive physical and chemical properties. The use of TiO2 nanoparticles (NPs) is also constantly increasing, because the nanometric size gives new interesting properties to particles which industrials are looking for. In some daily-life products including paints, plastics, paper, medicines and food, micro-sized TiO2 particles are used as a pigment for their opacifying and whitening capacities. The use of TiO2 as a food additive, i.e. E171 in the EU, has been authorized in most countries since the 60ies, without any established acceptable daily intake, because of their low toxicity and intestinal absorption. However, it was recently shown that E171 can contain up to 43% of particles with diameter ranging from 1 to 100 nm, i.e. NPs. Still, E171 is not a nanomaterial as described in the European recommendation of definition because it contains less than 50% of NPs (in number). Food grade TiO2 is present in a wide range of food products while little is known about its toxicological impact to human health. The toxicity of ingested TiO2, either nano- or micro-sized, is increasingly documented, still E171 itself is rarely used in these studies.According to in vivo and in vitro studies, TiO2 particles were proven relatively safe for intestinal cells, no cytotoxicity neither genotoxicity were reported. Nevertheless, particles were often reported to increase reactive oxygen species (ROS) cell content, to impair autophagic processes and modulate gene expression and the content of proteins involved in oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and inflammatory response regulation. Interestingly, their reported impact on intestinal cells suggests alteration of almost all the components of the intestinal barrier function, i.e. microbiota, mucus, cell junctions and transporters. This intestinal barrier function is altered in patients suffering from intestinal bowel diseases, these persons are thus possibly more sensitive to mineral particulate in food.The present study aimed at improving knowledge on the toxicity of food-grade TiO2. To this purpose, the impact of E171 was evaluated on in vitro cell models representative of the human intestinal epithelium, i.e. a model of differentiated Caco-2 enterocytes, a model of mucus-secreting epithelium obtained by coculture of Caco-2 and HT29-MTX mucus-secreting cells and a model of the follicle-associated epithelium, which lines Peyer patches, obtained by coculture of Caco-2(C1) and RajiB cells. These cell models were either acutely exposed for 6 h, 24 h and 48 h or chronically exposed for 21 days to E171. In parallel, they were exposed to two model TiO2-NPs, A12 which has the same crystalline structure as E171 and P25, a well-documented TiO2-NPs. Our results show that E171 and TiO2-NPs induced no overt cell mortality but significant oxidative stress, and that they oxidatively damage DNA. They modulate the expression of genes involved in oxidative stress and endoplasmic reticulum stress regulation. They also modulate the expression of genes, as well as the content of proteins from mucus, ABC transporters and inflammatory markers, which are the main players of the intestinal barrier function and presumably increase epithelium sensitivity to xenobiotics. These data suggest that they may be implicated in the development or aggravation of inflammatory bowel diseases.

L'épithélium intestinal se renouvelle tous les 4 à 6 jours chez les mammifères grâce aux cellules souches localisées au fond des cryptes. Le renouvellement dépend des signaux émis par le microenvironnement et requiert une phase de prolifération des cellules souches, de différenciation et d'apoptose/desquamation des cellules épithéliales. La signalisation Wnt, joue un rôle majeur dans l'homéostasie intestinale par l'action de deux gradients inversés le long de l'axe crypte/lumière ; la signalisation Wnt canonique, active au fond des cryptes, contrôle la prolifération alors que la signalisation non-canonique, active vers le haut des cryptes contrôle la différenciation. Il a été montré que ces deux voies contrôlent l'activité de la GTPase atypique RhoU/Wrch1. RhoU fait partie des GTPases qui s'activent spontanément, son activité est donc directement proportionnelle à son niveau d'expression dans la cellule. Enfin, cette GTPase atypique est sous exprimée dans de nombreuses tumeurs gastriques et colorectales.Compte tenu de ces données, nos objectifs étaient donc de caractériser les changements morphologiques induits par l'invalidation conditionnelle de RhoU dans l'épithélium intestinal murin et d'en déterminer les mécanismes d'action. Nos résultats montrent que la déplétion de RhoU n'est pas létale, cependant elle a induit une augmentation de 20% de la densité cellulaire et une désorganisation de la structure de l'épithélium dans le haut des cryptes du colon. Cette augmentation concerne aussi bien les lignages sécrétoires et absorptifs, cependant, l'absence de RhoU a induit une sur-représentation du lignage sécrétoire. Dans la lignée de tumeur colorectale DLD-1, nous avons montré que l'absence de RhoU mime le phénotype d'augmentation de la densité cellulaire observé chez la souris. L'invalidation de RhoU ne modifie pas la distribution des phases du cycle cellulaire ni de celle de la mitose, cependant, elle réduit le nombre des cellules en apoptose dans le colon des souris et dans les cellules DLD-1. L'invalidation de RhoU a réduit la signalisation Hippo et a altéré la contractilité cellulaire via une augmentation de la phosphorylation de la protéine MLC2. Des travaux récents ont montré que la diminution du niveau MLC2 phosphorylée est nécessaire pour l'activation des caspases par un stimulus apoptotique. Ceci suggère que cette perturbation de la contractilité peut être à l'origine de cette diminution de l'apoptose qui est la cause majeure responsable de ce phénotype. En conclusion, RhoU est un régulateur de l'homéostasie intestinale chez la souris via son rôle modérateur de la mort cellulaire. / In Mammals, the intestinal epithelium is renewed every 4-6 days through the stem cells located at the bottom of crypts. The renewal depends on signals from the micro-environment and requires a proliferation phase of stem cells, then a differentiation and apoptosis/desquamation phases of epithelial cells. Wnt signaling plays a major role in intestinal homeostasis by the action of two reversed gradients along the axis crypt/ lumen: canonical Wnt signaling, active in the bottom of crypts, control proliferation while non canonical signaling, active in the top of the crypts control cell differentiation. It was shown that these two pathways are regulator of the atypical GTPase RhoU/Wrch1. The RhoU protein activates spontaneously, its activity is directly proportional to its expression level in the cell and is expressed as in gastric and colorectal tumors. In view of these informations, our objectives were therefore to characterizethe morphological changes induced by conditional invalidation of RhoU in the intestinal epithelium of mice and to determine the mechanisms of action. Our results show that RhoU depletion is not lethal. However, it induces an increase of cell density (+20%) and a disruption of the epithelium structure in the top of the colonic crypts. This increase affects both absorptive and secretory lineages. However, the absence of RhoU induced over-representation of secretory lineage. In colorectal tumor cell line DLD-1, we have shown that the absence of RhoU mimics the phenotype of cell density increase observed in mice. RhoU invalidationdid not change the distribution of cell cycle phases and mitosis, however, it reduces the number of apoptotic cells in the colon of mice and in the DLD-1 cells. RhoU invalidation reduced Hippo signaling and altered cell contractility via the increase of the protein MLC2 phosphorylation. Recent work has shown that the reduction of MLC2-P level is necessary for the caspase protein activation by an apoptotic stimulus. Suggesting that the perturbation of contractility may be the cause of this apoptosis decrease which is the main cause responsible of this phenotype. Finally, RhoU is a regulator of the intestinal homeostasis in micevia its moderating role of cell death.

L’épithélium intestinal est une monocouche de cellules qui tapisse la lumière intestinale, constitué d’un compartiment différencié, les villosités dans l’intestin grêle et les plateaux épithéliaux dans le colon, et d’un compartiment prolifératif, les cryptes de Lieberkühn. Ce tissue se renouvelle de façon rapide et continue tout au long de la vie de l’individu, grâce à la présence de cellules souches adultes dans le fond des cryptes. Ces cellules s’autorenouvellent et donnent naissance à des progéniteurs prolifératifs (capables d’engendrer les différents cytotypes épithéliaux) qui se différencient tout en migrant vers le compartiment différencié. Mon travail de these a porté sur l’étude d’une marqueur putatif de ces cellules souches épithéliales intestinales: Musashi1 (Msi1).Dans ce contexte, mon premier axe d’étude s’est focalisé sur l’isolement et la caractérisation des cellules souches épithéliales intestinales chez la souris. Pour cela, nous avons généré des souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente GFP sous le contrôle du promoteur de Msi1. Les cellules souches intestinales de ces souris coexpriment donc Msi1 et la GFP. Ce modèle a été validé et nous à permis de isoler les cellules GFP/Msi1 positives dans l’intestin. A l'aide de différentes approches cellulaires et moléculaires, nous avons confirmé leur nature de cellules souches et nous avons apporté des nouvelles données sur la composition de la zone proliférative de l’épithélium intestinal murin.Le second axe de mes travaux de thèse a porté sur l’étude de la fonction de Msi1 dans l'homéostasie de l’épithélium intestinal chez la souris, par son sur-expression tous au long de l’épithélium. Nous avons montré que la sur-expression de cette protéine, qui est un régulateur des voies Wnt et Notch, perturbe l’architecture intestinale, a propriétés pro-prolifératives et un potentiel tumorigènique. / The intestinal epithelium is a monolayer of cells surrounding the intestinal lumen. It consists of a differentiated compartment, the villi in the small intestine and a flat surface in the colon, and a proliferative compartment, the crypts of Lieberkühn. This tissue self-renews rapidly and continuously throughout life, due to the presence of adult stem cells in the bottom of the crypts. These cells are capable of self-renewing and give rise to proliferating progenitors (capable of generating all the different epithelial cytotypes) that differentiate and migrate toward the differentiated compartment. My thesis focused on the study of the intestinal epithelial stem cells marker Musashi1 (Msi1).In this context, the first part of my thesis work focused on the isolation and characterization of the intestinal epithelial stem cells that express Msi1 in the mouse. For this, we generated transgenic mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of Msi1. The intestinal stem cells of these mice co-express Msi1 and GFP. This model has been validated and allowed us to isolate GFP+/Msi-expressing cells in the intestine. By using different cellular and molecular approches, we confirmed their nature of stem cells and provided new data on the composition of the proliferative zone in the murine intestinal epithelium.The second part of my thesis has focused on the study of the function of Msi1 in the intestinal epithelium homeostasis in the mouse, by its over- and ectopic expression all along the epithelium. We have shown that the over-expression of this protein, which is a regulator of the Wnt and Notch pathways, perturbs the intestinal architecture, has pro-proliferative properties and tumorigenic potential.