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Les BMPs (Boue Morphogenetic Proteins) sont des morphogènes membres de la superfamille du TGF-[bêta] qui interagissent avec des récepteurs de surface cellulaire à activité sérine/thréonine kinase. L'interaction des BMPs avec ces récepteurs entraîne l'activation d'une cascade de signalisation cellulaire impliquant les facteurs de types R-Smads (Smad1, 5 et 8). La voie de signalisation des BMPs joue des rôles cruciaux dans des processus biologiques tels que l'embryogenèse et l'organogenèse des tissus ainsi que des processus cellulaires tels que la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire. De plus, ces derniers semblent aussi impliqués dans les processus de mort cellulaire et dans la tumorigenèse. Malgré un intérêt grandissant pour la signalisation des BMPs, il existe très peu d'études sur les rôles spécifiques joués individuellement par les différents Smads dans la morphogenèse de l'intestin in vivo . Ceci est principalement dû au fait que la délétion classique des différents effecteurs de la voie des BMPs entraîne la mort in utero à cause de multiples défauts dans l'embryogenèse. Le système Cre/loxP, sous le contrôle d'un promoteur tissu spécifique, a été utilisé dans notre laboratoire, dans le but de générer une lignée murine possédant une délétion conditionnelle de l'effecteur Smad5 strictement au niveau de l'épithélium intestinal. Une analyse comparative à l'aide d'un modèle de délétion conditionnelle du récepteur BmpR1a au niveau de l'épithélium intestinal a été effectuée afin de décortiquer spécifiquement le rôle de l'effecteur Smad5 dans le développement de cet organe. Afin de valider les résultats obtenus in vivo nous avons généré un modèle cellulaire nous permettant de mimer l'effet de la délétion de l'effecteur Smad5 à l'aide de la technologie du shRNA.Les résultats obtenus dans les deux modèles suggèrent que Smad5 serait un facteur clé impliqué dans la régulation de la migration cellulaire des entérocytes. En effet, l'invalidation de la voie des BMPs et plus particulièrement de l'effecteur Smad5 dans les souris entraîne une augmentation de la vitesse de migration des cellules le long de l'axe crypte villosité. Ces résultats sont corroborés dans un modèle cellulaire dans lequel l'expression de Smad5 a été inhibée par interférence d'ARN. Dans ce modèle, la migration se fait de façon beaucoup plus compacte en comparaison aux cellules contrôles. L'augmentation de la vitesse de migration cellulaire pourrait être due à un phénomène de relocalisation des protéines de jonctions adhérentes ainsi qu'à une modulation de l'actine filamenteuse. Ce phénomène pourrait faire intervenir les petites protéines G Rho/Rac ainsi que les kinases Src. En plus de l'actine filamenteuse, différentes protéines impliquées dans la formation des complexes de jonctions adhérentes semblent relocalisées dans nos deux modèles (E-cadhérine/[bêta]-caténine). En conclusion, les différents résultats recueillis au cours de mes travaux de maîtrise dans le laboratoire du Dr. Nathalie Perreault nous suggèrent que l'effecteur Smad5 de la voie des BMPs serait un facteur impliqué dans la stabilité des complexes de jonctions adhérentes, régulant ainsi la migration des cellules le long de l'axe crypte villosité.

PTEN est une protéine dotée d'une activité phosphatase qui déphosphoryle les phosphatidylinositols issus de l'activation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Des mutations germinales du gène PTEN ont été mises en évidence dans le syndrome de Cowden, une maladie caractérisée par le développement de polypes le long du tube digestif et associée à un risque accru de cancer. De plus, la perte d'un allèle de Pten chez la souris conduit à la formation d'hyperplasie et de dysplasie du tractus gastro-intestinal ainsi qu'à des tumeurs notamment au niveau du côlon. Ces observations suggèrent que PTEN joue un rôle important dans le tube digestif. Cependant, ses mécanismes d'action dans les cellules épithéliales intestinales sont peu connus. Nos travaux nous ont permis de mieux caractériser les rôles de PTEN dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons d'abord analysé l'effet d'un shRNA inhibant spécifiquement l'expression de PTEN dans les cellules Caco-2/15, une lignée cancéreuse colorectale qui a la particularité de se différencier suite à l'atteinte de la confluence en adoptant un phénotype semblable aux cellules absorbantes de l'intestin grêle. La perte d'expression de PTEN stimule la prolifération de ces cellules. Cette augmentation de la prolifération semble résulter d'une diminution de l'expression de p21 et de p27 ainsi que d'une hausse des cyclines D2 et E. De plus, le shRNA contre PTEN inhibe la différenciation fonctionnelle et morphologique des Caco-2/15. Cela découle partiellement de l'inhibition de l'expression des facteurs de transcription CDX2, HNF-1? et HNF-4?. Les jonctions serrées sont également altérées dans ces cellules. En effet, une réduction importante de l'expression des claudines et une augmentation de la perméabilité transépithéliale a été observée. Une augmentation de la synthèse protéique a aussi été remarquée. De plus, nos résultats laissent également croire que PTEN pourraient jouer un rôle dans la carcinogenèse colorectale. Nous avons effectivement constaté une augmentation du potentiel tumorigénique des Caco-2/l5 exprimant le shRNA contre PTEN suite à l'injection des cellules dans des souris nues. De plus, ces cellules ont des capacités de migration et d'invasion accrues. Nous avons également constaté que les niveaux de PTEN sont plus faibles dans plusieurs lignées cancéreuses colorectales comparativement aux cellules épithéliales intestinales normales. Nous avons aussi analysé le phénotype d'une lignée de souris possédant une délétion du gène Pten exclusivement au niveau de l'épithélium intestinal, générée à l'aide du système Cre/loxP. Macroscopiquement, une organomégalie de l'intestin grêle et du côlon a été observé chez les souris déficientes pour Pten. Histologiquement, nous avons constaté une désorganisation de l'architecture épithéliale intestinale caractérisée par un allongement des villosités et par la présence d'embranchements villositaires. De plus, un épaississement important des couches musculaires a été remarqué. Il y a également une augmentation du nombre de cellules prolifératives au niveau des cryptes intestinales corrélant avec une augmentation des niveaux de ?-caténine et des cyclines D. Finalement, une augmentation du contenu protéique par cellule a également été observée ainsi qu'une activation de la voie mTOR. En conclusion, nos résultats montrent que la phosphatase PTEN est impliquée dans l'établissement de l'architecture générale de l'intestin et qu'elle contrôle la synthèse protéique, la migration, le cycle cellulaire ainsi que la différenciation des cellules épithéliales intestinales. De plus, nos résultats indiquent que la perte d'expression de PTEN pourrait influencer la progression des cancers colorectaux. [Symboles non conformes]

Clavicipitaceous fungal endophytes provide several ecological benefits to their hosts. Besides improving host’s growth characteristics, Neotyphodium coenophialum, the endophyte of tall fescue (Lolium arundinaceum), produces ergot alkaloids that have been proposed to be involved in fescue toxicosis. One approach to address the toxicosis problem is to genetically manipulate and modify N. coenophialum by knocking out a pair of homologous genes, (dmaW1 and dmaW2), encoding dimethylallyltryptophan synthase, the enzyme for the first and determinant step in ergot-alkaloid biosynthesis. In this study, disruption of dmaW2 was attempted using several disruption methods. Out of 1522 transformants screened, three putative knockouts were identified. Southern blot analysis of digested genomic DNA indicated that homologous gene replacement at dmaW2 locus took place while dmaW1 was still present. Chromosome separation followed by Southern-blot hybridization showed that the dmaW genes in N. coenophialum are located on different chromosomes. The aim of this study was to obtain a nontoxic endophyte free of marker genes that could be used to inoculate popular tall fescue cultivars. Therefore the Cre/loxP system developed in this study allows reusing the marker gene for sequential transformations. Protoplasts from Neotyphodium coenophialum, Neotyphodium uncinatum, or Epichloë festucae isolates, containing a floxed hygromycin phosphotransferase (hph) gene (loxP::hph::loxP), were transfected with a Crerecombinase expression plasmid and then cultured without selection. The marker was excised in 0.5-2% of the colonies, leaving a single loxP sequence. This strategy will help to reduce the concerns related to field release or commercialization of economically important grasses associated with manipulated fungal strains. It is expected that the technology will likely be adapted and applied in other fungal species. Manipulation of the ergot alkaloid (EA) gene cluster from C. purpurea and C. fusiformis by introducing and expressing its genes in different fungal-grass symbionts was also investigated. Heterologous expression of the ergot alkaloid cluster could result either in the synthesis of compounds similar to the ones produced by the host or in synthesis of novel compounds with new modes of action. Even though the results indicated that several EA genes were expressed in the new symbiota, none of the ergot alkaloids intermediates were detected.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

1 Abstract Diabetes mellitus is characterized by the dysfunction and reduction of insulin-producing cells, resulting in hyperglycemia, which in long term harms the organism. For future therapy, it is crucial to understand the function of various factors participating in the differentiation and maturation of endocrine pancreatic cells. The aim of this study was to unravel the functional role of ISL1 during the development of the pancreas. ISL1 is expressed in all endocrine cells of the islets of Langerhansbut its function remains unclear, especially during early pancreatogenesis. As the global deletion of this gene is embryonically lethal, we used the tissue specific deletion of Isl1 in Neurod1 possitive cells using the Cre-loxP system. In this work we studied the effect of this deletion on the structure of islets of Langerhans, the formation of endocrine cell types and relative expression of genes during early pancreatic development. A defective achitecture of islets together with postnatal absence of α-cells was found in the Isl1 deletion mutant. Also, the expression of genes important for the specification of α-cell lineage and their subsequent function was decreased. The secondary outcome was the optimalization of a protocol for effective sorting of endocrine cells using fluorescent flow cytometry, which...

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Mammals cannot re-form heavily damaged bones as in large fracture gaps, whereas zebrafish efficiently regenerate bones even after amputation of appendages. However, the source of osteoblasts that mediate appendage regeneration is controversial. Several studies in zebrafish have shown that osteoblasts are generated by dedifferentiation of existing osteoblasts at injured sites, but other observations suggest that de novo production of osteoblasts also occurs. In this study, we found from cell-lineage tracing and ablation experiments that a group of cells reserved in niches serves as osteoblast progenitor cells (OPCs) and has a significant role in fin ray regeneration. Besides regeneration, OPCs also supply osteoblasts for normal bone maintenance. We further showed that OPCs are derived from embryonic somites, as is the case with embryonic osteoblasts, and are replenished from mesenchymal precursors in adult zebrafish. Our findings reveal that reserved progenitors are a significant and complementary source of osteoblasts for zebrafish bone regeneration.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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