Abstract: Concomitant chemoradiation therapy based on platinum chemotherapeutic drugs (Pt-drugs) is a common treatment modality for several types of cancers and has dramatically improved patient survival. The radiosensitization capacity of Pt-drugs results essentially from their binding to nuclear DNA. Although several mechanisms such as increase in the radiation damage to DNA and inhibition of their repair have been proposed, the contribution and efficiency of the underlying molecular mechanisms of the radiosensitization remain unknown. This PhD thesis determines the relative efficiency of Pt-drugs, in terms of the type of drug and the quantity of Pt-DNA adducts, in the sensitization of DNA to the direct and indirect effects of ionizing radiations, and elucidates the major mechanism responsible for this radiosensitization. In particular, it addresses the role of low-energy electrons (LEEs), hydroxyl radicals and hydrated electrons in the radiosensitization of DNA modified by Pt-drugs. This thesis includes a review of the literature on the molecular basis of radiotherapy, Pt-based chemotherapy, and their combination in cancer treatment. Five articles, on which I am first author, are presented, and followed by a comprehensive discussion that integrates all results and their implications in the clinic and future research. With respect to the direct effect of radiation, LEEs are found to be the main species responsible for the enhancement in DNA damage, particularly cluster damage including DSB and interduplex cross-links. Irradiation of a 3199-bp plasmid DNA modified by an average of 2 Pt-drug adducts with 10-eV electrons results in significant increases in DSB formation by factors of 3.1, 2.5 and 2.4, respectively, for carboplatin, cisplatin and oxaliplatin relative to unmodified DNA. Irradiation of these samples with subexcitation-energy electrons (i.e., 0.5 eV) generates substantial number of DSB in the modified DNA, while no DSB is observed in the unmodified DNA. Since 0.5 eV is well below that energy required for the electronic excitation of organic molecules, dissociative electron attachment must be the main mechanism responsible for the formation of strand breaks in the presence of Pt-adducts. For indirect effects of radiation, our results show that both hydroxyl radicals and hydrated electrons are responsible for the enhanced formation of damage in modified DNA. In the presence of Pt-adducts, hydroxyl radicals mainly contribute to the SSB formation, while hydrated electrons are the main species responsible for the DSB formation. Our results indicate that carboplatin and oxaliplatin have higher efficiency than cisplatin in the enhancement of radiation damage to DNA. At low frquencies of Pt-DNA adducts (i.e., less than 3.1x10-4 adducts per nucleotide), radiosensitization of DNA, in terms of the damage per adduct, increases by an order of magnitude compared with that at large frquencies of adducts. In conclusion, Pt-drug modification is an extremely efficient means of enhancing the formation of DNA DSBs by both LEEs and hydrated electrons created by ionizing radiation.//Résumé: La radiochimiothérapie concomitante, basée sur les médicaments antinéoplasiques platinés (Pt-antinéoplasiquesm), est une modalité de traitement utilisé contre plusieurs types de cancers et a considérablement amélioré la survie des patients. Parmi ces médicaments anticancéreux, les analogues de platine sont les plus couramment utilisés. Leur capacité à radiosensibiliser résulte essentiellement de leur liaison à l'ADN nucléaire. Bien que plusieurs mécanismes aient été proposés telles que l'augmentation des dommages induits à l'ADN et l'inhibition de leur réparation, la contribution et l’efficacité des mécanismes moléculaires sous-jacents à la radiosensibilisation restent inconnus. La présente étude examine l'efficacité Pt-antinéoplasiques à sensibiliser l'ADN aux rayonnements ionisants et détermine le rôle des électrons secondaires, des radicaux d'hydroxyles et des électrons hydratés dans ce processus. Cette thèse comprend un revue des données scientifiques concernant la base moléculaire de la radiothérapie, de la chimiothérapie Pt-antinéoplasiques et de leur combinaison dans le traitement de cancer. Cinq articles, donc je suis premier auteur, sont présentés suivis d'une discussion qui intègre mes résultats et leurs implications dans la clinique et la recherche future. En ce qui concerne l'effet direct des radiations, les électrons de faible énergie s'avèrent être la principale espèce responsable de l’augmentation des dommages à l’ADN, en particulier les dommages multiples localisés, les CDBs et les pontages inter-brin. L'irradiation de plasmides de 3199 paires de bases, contenant en moyenne deux adduits Pt-ADN, avec des électrons de 10 eV conduit à une augmentation significative des CDBs par des facteurs de 3.1, 2.5 et 2.4, respectivement, pour le carboplatine, le cisplatine et l'oxaliplatine par rapport à l’irradiation des plasmides non modifiés. L'irradiation avec des électrons de 0.5 eV genère un nombre substantiel de CDBs dans les plasmides modifiés, alors qu'aucune CDB n'est observée dans les plasmides non modifiés. Puisque 0.5 eV est une énergie bien inférieure à celle nécessaire à l'excitation électronique des molécules organiques, l'attachement dissociatif de l’électron doit être le principal mécanisme responsable de la formation de cassures en présence de Pt-antinéoplasiques. Pour les effets indirects des rayonnements, nos résultats montrent que les radicaux hydroxyles et les électrons hydratés sont, tous les deux, responsables de la formation accrue des dommages dans l'ADN modifié. En présence d'adduits Pt-ADN, les radicaux hydroxyles contribuent principalement à la formation de cassures simple brin, tandis que les électrons hydratés sont les principales espèces responsables de la formation de CDBs. Nos résultats indiquent que le carboplatine et l'oxaliplatine sont plus efficaces que le cisplatine pour augmenter les dommages à l'ADN. À faible concentration de Pt-ADN (soit moins de 3.1x10[indice supérieur -4] adduit par nucléotide), la radiosensibilisation de l'ADN, en termes de dommages par adduit, est d'un ordre de grandeur supérieure à celle aux concentrations élevées. En conclusion, l’ajout de Pt-antinéoplasiques est un moyen extrêmement efficace d'augmenter la formation de CDBs dans l’ADN par l’intermédiaire des électrons de faible énergie et des électrons hydratés produits par les rayonnements ionisants. [symboles non conformes]

Le tissu adipeux (TA) joue un rôle majeur dans les maladies métaboliques induites par l’obésité. L’activation de l’anti-oncogène p53 dans l’adipocyte a été impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline lors de l’obésité. Cependant, les causes et les conséquences de cette activation étaient encore inconnues. Nos travaux montrent que, chez des souris obèses, le niveau d'oxydation de l'ADN est plus élevé et la longueur des télomères réduite dans le TA épididymaire. Nous observons également une augmentation des dommages à l’ADN dans les adipocytes. Ces dommages à l’ADN provoquent l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN puisque nous avons observé une activation de la voie p53 (stabilisation de la protéine et expression d’une cible p21). De manière intéressante, nous avons démontré que les dommages à l’ADN et l’activation de la voie p53 dans les adipocytes sont des événements précoces lors du développement de l’obésité qui pourraient être la conséquence d’une augmentation également précoce du stress oxydatif dans le tissu adipeux et les adipocytes. De plus, l’augmentation des dommages à l’ADN et l’activation de p53 dans les adipocytes précèdent l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline systémique. Nous apportons également des arguments en faveur d’un rôle causal des dommages à l’ADN et de l’activation de p53 dans l’adipocyte dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux et la résistance à l’insuline adipocytaire. In vitro, nous montrons que la création expérimentale de dommages à l’ADN avec de la doxorubicine et l’activation pharmacologique de p53 avec l’inhibiteur de l’ubiquitine ligase Mdm2, la nutline3a, dans des adipocytes humains et murins en culture inhibent la signalisation insulinique, le transport de glucose et la translocation de Glut4 stimulés par l’insuline. Ils perturbent également l’activité sécrétoire des adipocytes. En particulier, le sécrétome de ces adipocytes possède une activité chimioattractive pour les neutrophiles et les macrophages. Des résultats préliminaires indiquent qu’il pourrait également affecter les préadipocytes en perturbant leur survie et leur différenciation en 8 adipocytes. In vivo, l’injection de doxorubicine à des souris provoque l’infiltration de neutrophiles et de macrophages dans le TA, l’inflammation du TA, et la résistance à l’insuline adipocytaire. Nous montrons également une induction précoce du locus CDKN2A dans le TA lors de l’obésité. Ce locus code pour p16INK4A, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines CDK4/6, et p19ARF, un inhibiteur de Mdm2. Nous confirmons que la surexpression de p19ARF dans des adipocytes en culture permet la stabilisation de p53 et étudions actuellement l’impact de l’absence de p19ARF dans les adipocytes in vivo dans le développement des maladies métaboliques lors de l’obésité. En résumé, nos travaux démontrent que les dommages à l’ADN observés précocement dans les adipocytes lors du développement de l’obésité ont le potentiel de déclencher des signaux dépendants de p53 impliqués dans l'altération du métabolisme adipocytaire et de sa fonction sécrétoire conduisant à une inflammation du TA, un dysfonctionnement des adipocytes, et la résistance à l'insuline. / Non disponible

Les dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans nos sociétés modernes, la presbyacousie, perte de l'audition liée au vieillissement, prend une place de plus en plus importante. Outre le vieillissement de la population, la prévalence de la presbyacousie est accentuée par l'exposition à des bruits toujours plus forts (concerts, baladeurs, environnement de travail, ...) et la prise de médicaments ototoxiques (cisplatine, aminoglycosides, ...). À ce jour, le lien entre l'endommagement de l'ADN, le stress oxydant et l'inflammation avec l'apparition précoce de certaines maladies liées au vieillissement (Alzheimer, démence, Parkinson, …) a été démontré. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires et trop peu d'études témoignent de l'existence d'un stress oxydant dans la presbyacousie.Le premier objet de ce travail a donc été d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traités au cisplatine (CDDP). Cet antinéoplasique tire sa cytotoxicité de sa capacité à causer directement des dommages dans l'ADN et est connu pour ses effets nocifs sur l'audition en induisant la dégénérescence des cellules cochléaires. Enfin, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures double brin dans l'ADN des cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM/DNA¬PK-Chk2-p53, de la formation de foyers βH2AX et 53BP1 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Les cellules ciliées internes, plus résistantes au CDDP que les cellules ciliées externes, présentent une signalisation moins intense et un nombre inférieur de cassures double brin, un phénomène qui pourrait expliquer leur plus faible sensibilité. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient les pertes d'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. Le second objectif a porté sur l'étude des effets délétères du vieillissement sur l'audition et les mécanismes moléculaires associés à cette pathologie. Pour ce faire, nous avons choisi les souris SAMP8 (senescence accelerated mice prone 8), un modèle bien établi de sénescence précoce et des maladies liées au vieillissement. Nous avons combiné des approches fonctionnelles, morphologiques, moléculaires et cellulaires pour phénotyper ces souris et identifier l'origine de l'atteinte de leur audition au cours du vieillissement. L'étude des souris SAMP8 nous a permis de montrer qu'elles sont un excellent modèle de presbyacousie mixte (atteinte de la strie vasculaire, de l'organe de Corti et du ganglion spiral), résumant la pathologie humaine. La dégénérescence des structures cochléaires que nous avons observée chez ces souris provient d'une profonde dysfonction mitochondriale, de l'augmentation du stress oxydant et des processus inflammatoires, d'un stress autophagique et de l'endommagement de l'ADN. Les mécanismes moléculaires aboutissant à la perte des cellules cochléaires constituent autant de cibles thérapeutiques à explorer dans l'avenir afin de tenter de prévenir les troubles de l'audition imputables à l'exposition au bruit ou aux médicaments ototoxiques et au vieillissement. / Our modern society is confronted with a dramatic increase in the number of patients suffering from presbycusis or age related hearing loss. Besides aging, presbycusis prevalence increases with exposition to loud noise (concerts, Walkman, work environment …) and ototoxic drugs (cisplatin, aminoglycosides …). It was reported that the early onset of some aging related diseases (Alzheimer, dementia, Parkinson …) are linked mechanistically to DNA damage, oxidative stress and inflammation. However, the role of DNA damages in cochlear cells degeneration is totally unknown and only few studies have investigated the implication of oxidative stress in presbycusis.The first goal of this study consisted in clarifying the role of DNA damage in cochlear cell degeneration. For this purpose, we used molecular and cellular biology approaches to identify the activation of DNA damage response pathways in cisplatin (CDDP) treated 3 days postnatal mouse cochlear explants in culture. Indeed, the cytotoxicity of CDDP arises from its capacity to directly damage DNA. It is also well known that one of the major dose limiting side effects of CDDP is its ototoxicity. Finally, we investigated the role of p53, a key effector of the DNA damage response pathway, in vivo by treating p53 knockout mice with CDDP. Our results show that CDDP induces double strand breaks leading to the activation of ATM-/DNA PK¬ Chk2 p53 pathway, βH2AX and 53BP1 foci formation and, in fine, apoptotic cell death. Inner hair cells, which are more resistant to CDDP treatment than outer hair cells, show a less intense signaling and fewer double strand breaks. This phenomenon could explain their weaker sensitivity to CDDP treatment. In vivo, p53 deletion prevents hearing loss and outer hair cells degeneration induced bay intraperitoneal injection of CDDP.The second goal consisted in studying the deleterious effects of aging on hearing and the molecular mechanisms involved in this pathology. Here, we studied the mechanism of presbycusis using the senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) which is a useful model to probe the effects of aging on biological processes. Based on complementary approaches combining functional, morphological, biochemistry, cellular and molecular biology, we found that the SAMP8 strain displays premature hearing loss and cochlear degeneration recapitulating the processes observed in human presbycusis (i.e. strial, sensory and neural degeneration). The molecular mechanisms associated with premature presbycusis in SAMP8 mice involve oxidative stress, mitochondrial dysfunction, chronic inflammation, autophagic stress and DNA damages. Molecular mechanisms leading to cochlear cells loss represent therapeutic targets of interest to explore in the future in order to prevent hearing impairments due to loud sound or ototoxic drugs exposure and due to aging.

Les travaux effectués au cours de cette thèse ont été réalisés dans le cadre du développement d'une plateforme d'irradiation protons dédiée aux études en radiobiologie (Radiograaff) à partir de l'accélérateur Van de Graaff 4 MV de l'Institut de Physique Nucléaire de Lyon. Ceci, grâce à une collaboration étroite et interdisciplinaire entre les physiciens et ingénieurs de l'Institut de Physique Nucléaire de Lyon (IPNL) et des biologistes du Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire (LRCM) du CHU de Lyon Sud. Afin de présenter le développement de la plateforme Radiograaff, ce manuscrit se découpera en trois chapitres. Le premier chapitre présente les fondements de l'hadronthérapie et le contexte scientifique du projet. Nous traiterons, dans une première partie, de l'interaction ions-matière vivante afin de mieux cerner les concepts théoriques associés à l'hadronthérapie. Et nous présenterons, dans un second temps, les intérêts scientifiques et les objectifs du projet Radiograaff. Le deuxième chapitre concernera les développements instrumentaux de la ligne d'irradiation. Après avoir discuté du mode de délivrance et d'extraction du faisceau ainsi que des méthodes de simulation que nous avons employées pour le dimensionnement théorique la ligne d'irradiation, nous présenterons le système de contrôle de la dosimétrie. Le chapitre 2 sera conclu par les résultats de l'évaluation et de la qualification de la plateforme. Enfin, dans le troisième chapitre, après une brève présentation de quelques aspects de biologie et de radiobiologie, nous présenterons les premiers résultats obtenus concernant l'efficacité biologique relative des protons délivrés par la plateforme Radiograaff. Nous discuterons des protocoles, des conditions expérimentales ainsi que des méthodes d'analyse des résultats / The work done in this thesis has been made in the development of a proton irradiation platform dedicated for radiobiological studies from the 4 MV Van de Graaff accelerator of the Institut de Physique Nucléaire de Lyon (IPNL). These developments have been made through a close interdisciplinary collaboration between physicists and engineers from IPNL and biologists from the Laboratoire de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire (LRCM, CHU Lyon Sud). To present the development of Radiograaff platform, this manuscript will split into three chapters. The first chapter introduces the basics of hadrontherapy and the scientific context of the project. In the first part of this chapter, we present the interactions between ion and matter in order to better understand the theoretical concepts associated with the hadrons. Then, we present the scientific interests and objectives of the Radiograaff project. The second chapter concerns the instrumental developments of the beam line. After discussing the delivery mode and beam extraction in air and simulation methods that we used to design the theoretical line radiation, we present the dosimetric monitoring system. The chapter 2 is concluded by the results of the evaluation and qualification of the platform. Finally, in the third chapter, after a brief presentation of some aspects of biology and radiobiology, we present the first results on the relative biological effectiveness of protons delivered by the Radiograaff platform. We discuss the protocols, experimental conditions and methods for analysing results

Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) sont une famille de polluants atmosphériques issus de la combustion incomplète de la matière organique. Le chauffage domestique, la fumée de tabac ainsi que certaines activités industrielles sont les principales sources d'émission environnementale. Certains HAP sont connus ou suspectés d'être cancérigènes pour l'homme, comme le benzo[a]pyrene (BaP), à travers la formation de dommages à l'ADN. La majorité des études se sont focalisées sur l'étude d'un HAP pur alors que l'exposition est toujours en lien avec des mélanges. Ce travail vise à évaluer in vitro sur un modèle d'hépatocytes humains (lignée HepG2) la modulation de la génotoxicité des HAP en mélanges à travers l'utilisation de deux biomarqueurs : le test des comètes mesurant les cassures de l'ADN et le dosage par HPLC/MS/MS des adduits à l'ADN du BPDE, métabolite principal du BaP. Dans un premier temps, les dommages induits par le BaP pur ou en mélange binaire avec d'autres HAP particulaires sont évalués. L'étude est ensuite étendue d'une part à des mélanges atmosphériques réels prélevés dans l'environnement ou en milieu industriel, et d'autre part à la fraction d'HAP particulaires reconstituée correspondante. Dans une dernière partie, l'intérêt de ces tests in vitro pour le suivi de l'exposition des populations à des agents génotoxiques associés à divers types d'environnements a été évaluée. Ce travail met en avant la nécessité d'approfondir les connaissances sur les mécanismes à l'origine des interactions entre les composés ainsi que l'intérêt du recours à la modélisation comme outil d'évaluation des dangers liés à l'exposition des populations aux HAP en mélanges.

L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1.

Abstract : Regulation of transcription is crucial for the appropriate development and function of eukaryotic cells. In eukaryotes, DNA is organized into a dynamic, complex, nucleoprotein structure called chromatin. Chromatin structure provides markedly restricted access of transcription factors to regulatory sites. Several mechanisms have evolved to modulate chromatin dynamics in order to regulate proper gene expression. One of the most intriguing mechanisms that modulate chromatin structure is the exchange of canonical histones with histone variants by chromatin remodeling complexes. Among the histone variants, H2A.Z is an essential regulator of gene transcription. H2A.Z is enriched at regulatory regions but significant levels of the histone variant can also be found within gene bodies. However, the role of H2A.Z within the gene bodies is still not well understood. Recent evidence suggests that active recruitment of H2A.Z within gene bodies is required to induce gene repression. In contrast to this view, we show that global inhibition of transcription results in H2A.Z accumulation at gene transcription start sites, as well as within gene bodies. Our results indicate that accumulation of H2A.Z within repressed genes can also be a consequence of the absence of gene transcription rather than an active mechanism required to establish repression. The second part of my Ph.D. project was to investigate the potential role of BRD8 - a subunit of the p400/Tip60 complex - in p53-mediated signaling. We find that knockdown of BRD8 leads to p21 induction and concomitant cell cycle arrest in G1/S. We further demonstrate that the p53 transcriptional pathway is activated in BRD8-depleted cells, and this accounts for upregulation of not only p21 but also proapoptotic genes, an event that leads to consequent apoptosis. Importantly, the DNA damage response is induced upon depletion of BRD8 and DNA damage foci are detectable in BRD8-depleted cells under normal growth conditions, as indicated by immunostaining for γ-H2AX. Notably, H4K16 acetylation is reduced in BRD8-depleted cells suggesting that BRD8 may have a role in recruiting and/or stabilizing the p400/Tip60 complex within chromatin, thus facilitating DNA repair. Consistent with the activated DNA damage response, we find that in BRD8-depleted cells, CHK2 is activated but, surprisingly, CHK1 protein levels are severely reduced. Taken together, our results suggest that BRD8 is involved not only in mediating p53-dependant gene suppression, but also in mediating the DNA damage response. In the last part of my Ph.D. project, I investigated the possible mechanisms involved in recruitment of the p400 chromatin remodeler complex to chromatin. I showed that histone variant H2A.Z is essential for efficient recruitment of p53 and p400 to the distal p53 binding element of the p21 promoter. Furthermore, using double knockout (DKO) MEFs for p300/CBP I showed that the depletion of p300/CBP lead to a severe decrease in the recruitment of p400 at p21 promoter. Further studies are necessary to fully understand the role of p300/CBP in targeting p400 to chromatin. In conclusion, my studies provide insights into the molecular mechanisms involved in chromatin regulation by histone variant H2A.Z and chromatin remodeler complex p400. / Résumé : La régulation de la transcription est un mécanisme crucial pour le bon développement et fonctionnement des cellules eucaryotes. Chez les eucaryotes, l'ADN est organisé dans une structure dynamique de nucléoprotéines appelée chromatine. La structure de la chromatine forme une barrière qui contrôle l'accès des facteurs de transcription à leurs sites de fixation sur l’ADN. Plusieurs mécanismes ont été acquis au cours de l'évolution pour moduler la dynamique de la chromatine afin de réguler de manière adéquate l'expression des gènes. Un des mécanismes les plus intriguant qui module la structure de la chromatine est le remplacement des histones canoniques par des variants d'histones. Il est effectué par des complex de remodelage de la chromatine. Parmi les variants d'histones, H2A.Z est un régulateur essentiel de la transcription des gènes. H2A.Z est enrichi aux régions régulatrices des gènes, mais des niveaux significatifs de ce variant d'histone peuvent aussi être observés au cœur des gènes. Le rôle de H2A.Z localisé a lèintérieur gènes n'est, pour l'instant, pas bien compris. Des résultats récents suggèrent que le recrutement actif de H2A.Z dans les gènes est requis pour induire leur répression. En opposition à ces résultats, nous montrons que l'inhibition globale de la transcription conduit à l'accumulation de H2A.Z aux sites d'initiation de la transcription, mais aussi au cœur des gènes. Nos résultats indiquent que l'accumulation de H2A.Z dans les gènes réprimés serait une conséquence de l'absence de transcription plutôt qu'un mécanisme actif requit pour établir la répression. La seconde partie de mon doctorat a été dédiée à l'étude du rôle de BRD8 (une sous-unité du complexe p400/Tip60) dans la signalisation contrôlée par p53. Nous avons trouvé que la déplétion de BRD8 conduit à l'induction de p21 et à l'arrêt concomitant du cycle cellulaire en phase G1/S. Nous montrons aussi que le circuit transcriptionnel de p53 est activé dans les cellules déplétées en BRD8. Cela résulte en l'induction de p21, mais aussi de gènes proapoptotiques, ce qui conduit la cellule en apoptose. De manière marquante, la voie de réponse aux dommages de l'ADN est induite suite à la déplétion de BRD8, ce qui est observée par l'apparition de foci de dommages à l'ADN révélés par immunocoloration de γ-H2AX. De plus, l'acétylation de H4K16 est réduite dans les cellules déplétées en BRD8, suggérant que BRD8 pourrait avoir un rôle dans le recrutement et/ou la stabilisation du complexe p400/Tip60 dans la chromatine, et pourrait donc faciliter la réparation de l'ADN. En accord avec le fait que la réponse aux dommages de l'ADN soit activée, nous trouvons que dans les cellules déplétées en BRD8, CHK2 est activé mais étonnamment le niveau de la protéine CHK1 était fortement diminué. Ensemble, nos résultats suggèrent que BRD8 est impliqué non seulement dans la répression des gènes régulés par p53, mais aussi dans la réponse aux dommages de l'ADN. Finalement, dans la dernière partie de mon doctorat j'ai étudié le mécanisme qui pouvait être responsable du recrutement du complexe p400 au niveau de la chromatine. Nous avons montré que le variant d'histone H2A.Z est essentiel pour le recrutement de p53 et de p400 au site distal de fixation de p53 sur le promoteur de p21. De plus, en utilisant des cellules MEF DKO pour p300/CBP, nous avons montré que la déplétion de p300/CBP conduit à une diminution sévère du recrutement de p400 au promoteur de p21. En conclusion, mes études permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la chromatine par l'histone H2A.Z et le complexe de remodelage de la chromatine p400.

L'étude des interactions entre un pathogène et son hôte, bien qu'ayant généralement pour objectif de contrôler l'infection par le pathogène, permet parfois de découvrir des éléments fondamentaux sur le fonctionnement de l'hôte. J'ai choisi d'étudier les fonctions cellulaires d'une protéine initialement identifiée comme un facteur de restriction du VIH-1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) est une protéine exprimée dans la plupart des tissus humains. Elle est capable d'hydrolyser les déoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) cellulaires et possède une activité nucléase ciblant différents acides nucléiques dont les ARN simple brin in vitro. Des mutations dans le gène SAMHD1 entraînent le développement d'une maladie auto-immune pouvant conduire à la mort précoce des nourrissons, ce qui suggère un rôle de la protéine correspondante dans la régulation de la réponse immunitaire. Il a été montré que SAMHD1 est un facteur de restriction capable d'empêcher l'infection de cellules ne se divisant pas par le VIH-1. La protéine virale Vpx, exprimée par le VIH-2, est capable d'induire la dégradation de SAMHD1 par le protéasome et permet de rendre permissives les cellules initialement résistantes à l'infection par le VIH. SAMHD1 est en réalité capable de restreindre l'infection par des virus aussi différents que les rétrovirus et le virus de l'herpès simplex 1. Néanmoins, le mécanisme permettant à SAMHD1 de contrecarrer différents virus reste aujourd'hui sujet à controverse. Initialement considéré comme agissant en dégradant les dNTP cellulaires, SAMHD1 semble également capable de dégrader l'ARN génomique du VIH-1. Si de nombreux travaux portent sur l'activité antivirale de SAMHD1, peu de données sont disponibles concernant la fonction cellulaire de cette protéine. Or SAMHD1 est capable de réguler la quantité de dNTP cellulaires et d'interagir avec certains acides nucléiques. Ces données font de SAMHD1 un acteur potentiel de différents processus cellulaires fondamentaux sensibles à la quantité intracellulaire de dNTP, notamment la réplication du génome ou la réparation des dommages à l'ADN. J'ai montré au cours de mon doctorat que SAMHD1 module le cycle cellulaire et notamment que la surexpression de cette protéine ralentit la prolifération cellulaire. J'ai également observé que la surexpression de SAMHD1 augmente la sensibilité des cellules aux agents induisant des ruptures double brin de l'ADN. De plus, j'ai découvert qu'en cas de ruptures double brin de l'ADN cellulaire, SAMHD1 est régulé de façon spécifique par phosphorylation sur sa thréonine 592 et est recruté aux sites de cassures. D'autres travaux ont confirmé l'importance de la régulation de SAMHD1 au cours du cycle cellulaire, sa surexpression et sa réduction induisant toutes deux un ralentissement de la prolifération cellulaire. En complément de mes résultats, quelques études suggèrent que SAMHD1 joue un rôle dans le maintien de l'intégrité du génome, qui pourrait être dû à son effet sur la réponse aux dommages à l'ADN. Dans l'ensemble, ces résultats font de SAMHD1 un garant de l'homéostasie cellulaire. J'ai de plus montré que l'expression de SAMHD1 est réduite chez environ 80% des patients souffrant de leucémie lymphoïde chronique. La perte de cette protéine est donc corrélée à l'apparition d'une maladie découlant de la perturbation du fonctionnement cellulaire. L'étude d'échantillons d'autres types de tumeurs montre que, dans de moindres proportions, l'altération de l'expression de SAMHD1 est une caractéristique générale des cancers. Mes travaux de doctorat soulignent ainsi le rôle fondamental de SAMHD1 dans le maintien de l'intégrité cellulaire. / Understanding host pathogen interactions reveals not only important information regarding the replication cycle of the pathogen but it often leads to the discovery and better understanding of key biological processes of the host. The aim of my PhD was to decipher the cellular functions of the HIV-1 restriction factor SAMHD1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) is expressed in most human tissues. This protein is able to hydrolyze cellular deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) and possesses a nuclease activity primarily against single stranded RNA. Mutations in SAMHD1 have been described in patients suffering from an auto-immune disease causing premature death of newborns. This phenotype suggests a role of SAMHD1 in the control of immune response. Moreover, SAMHD1 restricts HIV-1 in non-cycling cells. The HIV-2 accessory protein Vpx induces SAMHD1 degradation by the proteasome, conferring cell permissiveness to HIV. In fact, the antiviral activity of SAMHD1 has been extended to other viruses including Herpes Simplex Virus 1 and Hepatitis B virus. Nevertheless, the mechanism by which SAMHD1 restrict HIV replication is debated. It was initially thought to act by depleting the dNTP pool but recent studies highlighted a potential role of SAMHD1 nuclease function in degrading HIV-1 genomic RNA. Many studies aiming at understanding the antiviral activity of SAMHD1 are being pursued, whereas little is known about the cellular function of this protein. The fact that SAMHD1 is able to regulate the cellular dNTP pool and to interact with nucleic acids suggests a key role of this protein in cellular processes, such as DNA replication and repair. During my PhD, I showed that SAMHD1 modulates the cell cycle, as the overexpression of this protein slows down cell proliferation. I also observed that SAMHD1 overexpression increases cellular sensitivity to double strand DNA breaks-inducing agents. Moreover I discovered that, after double strand breaks induction, SAMHD1 is specifically regulated by phosphorylation on its threonine 592 and recruited at the damaged sites. Other studies confirmed the importance of SAMHD1 regulation along the cell cycle as its overexpression and depletion both decrease cell proliferation. In addition to my observations, some studies suggested that SAMHD1 is important to maintain genomic integrity, presumably through its implication in DNA repair. Altogether, these results promote SAMHD1 as a key player in cellular homeostasis. I additionally showed that SAMHD1 expression is reduced in 80% of patients suffering from chronic lymphocytic leukemia (CLL). SAMHD1 loss is therefore correlated to the development of a disease due to disturbances of cellular integrity. Looking at samples from different types of tumors, I showed that SAMHD1 loss is shared between all tested cancers, although at lesser extent than in CLL. My PhD work underlines the central role of SAMHD1 to maintain cellular integrity.