Thèse de doctorat : Médecine. Biologie cellulaire : Université de Nantes : 2006. / Bibliogr.

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Evry-Val d'Essonne : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Biologie : Evry-Val d'Essonne : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La réussite de la thérapie cellulaire à l'aide des cellules souches embryonnaires, nécessite une bonne compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent leur différenciation. Une des voies de signalisation, impliquée dans le contrôle de la différenciation des cellules souches, est la voie p38MAPK. Dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la différenciation précoce des cellules ES, nous avons réalisé un criblage sur puces à ADN. Les résultats du criblage ont montré que certains gènes régulés différentiellement, comme le gène Bcl2, sont des cibles communes de p38MAPK et de p53. En plus de son rôle de répresseur de tumeur, p53 a été impliqué dans le développement embryonnaire et dans la biologie des cellules ES. Ainsi, il est connu que p53 agit comme un répresseur du gène de pluripotence, Nanog. Il est également connu que p53 interfère avec le processus de reprogrammation des cellules adultes ; et que son activité transcriptionnelle augmente avec l'entrée des cellules ES en différenciation. En revanche, son rôle dans la différenciation et dans la formation des différents lignages issus des cellules ES, reste inconnu. Nous avons trouvé que le traitement des cellules ES sauvages avec l'inhibiteur spécifique de p53, la pifithrine-α, durant le processus de différenciation, inhibe les lignages mésodermiques, et à l'inverse, stimule la neurogenèse. De plus, la transfection transitoire des cellules ES avec des siRNAs spécifiques, dirigés contre p53 ainsi que l'utilisation des cellules ES déficientes pour le gène p53, montrent que l'absence de p53, affecte les lignages cardiaques, du muscle lisse et du muscle squelettique. / Embryonic stem cells (ESCs) differentiate in vitro into all cell lineages. We previously found that p38MAPK controls two independent successive steps during the early mesodermal commitment of ESCs. The first one is Brachyury dependent, a master gene of mesoderm formation whereas the second one is not. In order to understand the molecular mechanism implicated in the second step, we treated ESCs with the p38 specific Inhibitor PD169316 and performed microarray experiments on mRNAs extracted from treated versus untreated cells. Our results show that many regulated genes are common targets of p38MAPK and p53 transcription factor. In addition to its role as a tumor suppressor and cell cycle checkpoint control, p53 has been involved in embryonic development, but its role in ESC differentiation is still unknown. We found that treatment of wild type ESCs with the p53 specific inhibitor pifithrin α during the differentiation process inhibits mesodermal lineages and, by contrast, stimulates neurogenesis. Likewise, ESCs Transfected with p53 siRNAs and p53 KO ESCs show an inhibition of cardiac, endothelial, smooth muscle and skeletal muscle lineage formation. Furthermore, p38MAPK inhibition by PD169316 for 24h induces a strong decrease of p53 protein level. Our results suggest that p53 mediates the p38MAPK control of the commitment of ESCs towards mesodermal lineages. The involvement of the various p53 isoforms in this process will be discussed.

Avec leurs caractéristiques d'auto-renouvellement illimité et de pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent une source infinie de cellules pour la thérapie cellulaire de maladies, telle que la dystrophie musculaire de Duchenne. Des études ont démontré que les hESC pouvaient être différenciées en cellules musculaires squelettiques, mais les techniques employées sont longues et inefficaces. Ce mémoire décrit un nouveau protocole de différenciation des hESC en cellules musculaires squelettiques à l'aide d'un adénovirus exprimant le gène MyoD sous le contrôle du promoteur CAO (Ad.CAO-MyoD). L'efficacité de ce virus pour induire la myogenèse des hESC a été mise en évidence par la présence de divers marqueurs myogéniques. Ensuite, le potentiel de fusion de ces cellules a été illustré par le marquage de la MyHC et par l'observation de quelques myotubes. Ces résultats préliminaires semblent indiquer que l'Ad.CAO-MyoD est un outil prometteur pour différencier les hESC en cellules musculaires squelettiques.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont capables de se multiplier de façon autonome en l’absence de facteurs de croissance et de cytokines, un état appelé “état fondamental de pluripotence”. Le cycle cellulaire des cellules ES se caractérise : (i) par une expression élevée et uniforme de la cycline E et des complexes Cycline E-CDK2 au cours de la progression dans le cycle cellulaire et (ii) par une phase G1 très courte (1 heure) dont la traversée ne dépend ni des MAPK ni des points de contrôles régulés par la protéine du rétinoblastome (RB) et p53. Ces observations soulèvent la question de l’existence d’un lien de cause à effet entre ce phénomène de réplication autonome et la pluripotence. Mon projet de thèse se construit autour de trois axes qui montrent que : 1/ la phase G1 des cellules ES de souris est une phase de sensibilité accrue aux inducteurs de différenciation. 2/ la balance entre autorenouvellement et différenciation est perturbée, (i) quand l’expression de la cycline E est altérée, ou (ii) quand l’association de la cycline E avec la kinase CDK2 et le centrosome est bloquée. 3/ La signalisation par le LIF contrôle la formation et l’activation des complexes Cycline E/CDK2. Dans les cellules ES naïves Rex1+, l’allongement de la durée de la phase G1 induit par la privation de LIF précède, ou est concomitante, à la diminution de l’expression de marqueurs de pluripotence et à l’activation des marqueurs les plus précoces de la différenciation. Finalement, nous proposons un modèle dans lequel la signalisation par le LIF régule la transition G1/S et permet le maintien de l’autorenouvellement des cellules ES murines / Pluripotency can be captured and propagated in vitro from the epiblast of the pre-implantation blastocysts in the form of embryonic stem cells (ESCs). ESCs are capable of unlimited proliferation in an undifferentiated state while maintain the potential to differentiate into cells of all three germ layers in the embryo, including the germline. Two key features the ES cell mitotic cycle are (i) a vastly elevated and uniform expression of Cyclin E and Cyclin E/CDK2 complexes throughout the cell cycle and (ii) a short G1 phase characterized by the lack of RB- and p53-dependent checkpoints, and reduced dependency on MAPK signalling. During my PhD project, we explored whether and how the regulation of the cell cycle actively sustains self-renewal of mouse ESCs (mESCs). We demonstrated that: 1/ the G1 phase of mESCs is a phase of increased susceptibility to differentiation inducers. Thus shortening of G1 might shield undifferentiated cells from differentiation inducers and help ESCs to self-renew in the pluripotent state. 2/ Cyclin E opposes differentiation and supports self-renewal of mESCs by two independent mechanisms, one of which being independent of CDK2 activation. 3/ LIF signalling regulates Cyclin E/CDK2 kinase activity therefore accelerating the G1 to S phase transition. Finally, we propose a model in which LIF signalling stimulates the G1 to S phase transition to shield mESCs from undesired differentiation signals and help them to self-renew in the pluripotent state

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif. / Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state.