Titre de l'écran-titre (visionné le 11 septembre 2023) / Dans le testicule, il existe deux populations distinctes de cellules de Leydig, les cellules fœtales (FLC) et adultes (ALC). Elles produisent deux hormones, testostérone et INSL3 (Insulin-like 3) essentielles à la différenciation sexuelle masculine, fertilité et santé osseuse. Les mécanismes régulant la différenciation et la fonction des cellules de Leydig demeurent méconnus en raison de l'absence de modèle de souris exprimant la recombinase Cre afin de cibler exclusivement ces cellules. Puisque le gène Insl3 est exprimé uniquement dans les FLC et ALC, l'approche CRISPR/Cas9 a été utilisée pour insérer le transgène Cre recombinase améliorée (iCre) ou le transgène TdTomato dans le locus Insl3. Cependant la caractérisation de ces lignées de souris et l'expression exclusive du transgène dans les cellules de Leydig restaient à démontrer. Mon objectif était de caractériser certaines des nouvelles lignées de souris et en particulier, Insl3[exposant iCre]. Cette lignée a été croisée avec une souris rapporteuse Rosa26[exposant LoxSTOPLox-TdTomato] et la progéniture mâle issue de ces croisements a été sacrifiée à différents âges embryonnaires et postnataux. Les testicules ont été récoltés, congelés et coupés au cryostat. Des expériences d'immunofluorescence ont été réalisées. Chez la progéniture mâle, la protéine fluorescente rouge, TdTomato, a été observée dans les FLC et ALC (colocalisation avec CYP17A1, un marqueur spécifique des cellules de Leydig) aux âges fœtaux et postnataux examinés. La protéine TdTomato a été détectée dans les FLC dès E13.0, et dès P5 dans les ALC, corrélant avec le premier moment de la différenciation fonctionnelle des FLC et ALC, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée dans d'autres tissus examinés. Cette nouvelle lignée iCre exclusive aux cellules de Leydig représente une avancée majeure dans le domaine de l'andrologie et permettra d'aborder des questions fondamentales sur la biologie et la fonction des gènes dans les cellules de Leydig qui sont restées sans réponse pendant des décennies. / In the testis there are two populations of Leydig cells, fetal (FLC) and adult (ALC) Leydig cells. They produce two hormones, testosterone and INSL3 (Insulin-like 3) that are essential for male sex differentiation, fertility, and bone health. Our knowledge of mechanisms regulating differentiation and function of Leydig cells have remained incomplete because of the absence of a mouse model expressing Cre recombinase to exclusively target Leydig cells. Since INSL3 is uniquely expressed in both FLCs and ALCs, a CRISPR/Cas9 approach was used to knock-in the improved Cre recombinase (iCre) or TdTomato transgene into the Insl3 locus. However, the tissue and cell-specific transgene expression of the resulting mouse lines remained to be studied. My objective was therefore to characterize some of the new mice lines, particularly, Insl3[superscript iCre]. This mouse line was crossed with a Rosa26[superscript Lox-STOP-Lox-TdTomato] reporter mouse line and male off spring resulting from these crosses were euthanized at different embryonic and postnatal ages and the testes were harvested, frozen and cut in cryosections. Immunofluorescence experiments were subsequently performed. In male off spring, TdTomato red fluorescence was detected in both FLCs and ALCs at fetal and postnatal ages examined, as confirmed by immunofluorescence for CYP17A1, a marker of Leydig cells. The TdTomato protein was observed in FLCs as early as E13.0 while it was detected as early as P5 in ALCs, correlating with the earliest times of FLC and ALC differentiation, respectively. No fluorescence was observed in any other fetal or adult tissue examined. The Leydig cell-exclusive iCre line will be invaluable for generating Leydig cell-exclusive gene knockouts. These new genetic tools represent a major advance to the field of andrology that will allow us to address fundamental questions about the biology and gene function of Leydig cells that have remained unanswered for decades.

Les virus herpétiques sont des pathogènes ubiquitaires caractérisés, entre autres, par la persistance de leur génome au sein de l'hôte. Parmi ceux-ci, le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à la mononucléose infectieuse, au carcinome du nasopharynx et au lymphome de Burkitt. L'homologie génomique qui existe entre certains virus herpétiques, principalement entre le gammaherpèsvirus murin 68 (MHV-68) et EBV, est établie depuis plusieurs années. Cette homologie est d'autant plus importante que ces virus sont reconnus par le système immunitaire de manière similaire chez leurs hôtes respectifs. Ce système se décline en deux volets complémentaires, soit l'immunité innée et l'immunité acquise. Les "Toll-like receptors" (TLRs) composent l'une des principales familles de récepteurs impliquées dans l'immunité innée. C'est donc sur cet aspect que le projet s'est concentré, et plus précisément sur l'activation du récepteur membranaire TLR2 par le virus MHV-68. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'activation du TLR2 par MHV-68 mène à une augmentation de l'activité NF-KB. À l'aide de cellules fibroblastiques embryonnaires (MEFs) provenant de souris C57BL6 TLR2⁻/⁻ ou MyD88⁻/⁻, nous avons prouvé que la synthèse d'IL-6 et d'IFN-α induit par MHV-68 est partiellement dépendante du TLR2 et entièrement dépendante de MyD88. L'induction du gène TLR2 par MHV-68 a pu être établie in vivo à l'aide de souris transgéniques exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur du TLR2. L'utilisation de MHV-68 irradiée aux UV a donné des résultats similaires suggérant que la transcription génique et la replication virale ne sont pas essentielles à l'activation ni à l'induction du TLR2. Nous avons par la suite mis en évidence par cytometric de flux que le TLR2 était induit à la suite d'une infection par MHV-68 chez les granulocytes, les monocytes circulants et les monocytes inflammatoires recrutés au poumon. Nous avons finalement observé une diminution de la sécrétion d'IFN-α, d'IFN-β et d'IL-6 dans les poumons et la rate des souris TLR2⁻/⁻ et MyD88⁻/⁻ infectées, comparativement aux témoins (WT), et ce, de façon concomitante avec une augmentation de la charge virale. 11 s'agit de la première étude qui prouve que le virus MHV-68 est reconnu par le récepteur membranaire TLR2 murin.

La cardiomyopathie dilatée est une pathologie affectant la structure du myocarde menant, à terme, à une défaillance cardiaque. Elle constitue la troisième cause la plus importante de défaillance cardiaque. De nombreuses pathologies cardiaques, dont la cardiomyopathie dilatée, résultent de mutations sur le canal sodique voltage-dépendant Nav1.5, responsable de la phase de dépolarisation des potentiels d’action et donc de la contraction. La mutation R219H, sur ce canal, engendre un courant de protons en phase d’hyperpolarisation nommé « courant oméga ». Celui-ci provoquerait une augmentation de la concentration intracellulaire en sodium et en calcium via l’échangeur sodium-calcium à l’origine du remodelage du myocarde dans la cardiomyopathie dilatée. Objectif : La mutation R219H fut détectée chez un patient souffrant de cardiomyopathie dilatée et d’arythmie. Les travaux présentés dans ce mémoire consistèrent à déterminer si le modèle de souris R219H présentait un phénotype cardiaque similaire. Méthode : Une évaluation structurelle des coeurs a été effectuée au moyen de coupes histologiques. La technique de patch clamp servit à caractériser la biophysique de Nav1.5 et à enregistrer le courant oméga. Résultats : Les coupes histologiques permirent de mettre en évidence des dysfonctions structurelles chez les souris hétérozygotes et homozygotes ainsi qu’une désorganisation importante de la structure cellulaire. Les enregistrements d’électrophysiologie montrèrent une activation du canal plus précoce chez les souris hétérozygotes et homozygotes. Une diminution de l’amplitude des potentiels d’action et de la vitesse de conduction fut aussi observée. La présence d’un courant oméga chez les souris portant la mutation fut également confirmée. Les résultats obtenus semblent indiquer que la mutation R219H soit à l’origine du développement de la pathologie, bien que le mécanisme moléculaire sous-jacent reste à déterminer. / Dilated cardiomyopathy is a structural cardiac disorder leading to heart failure. It is the third most common cause of heart failure. Several cardiac pathologies, including dilated cardiomyopathy, result from mutations on the gene encoding the voltage-dependent sodium channel Nav1.5 which is responsible for the upstroke of the action potential and therefore for contraction. The mutation R219H on this channel drives a gating pore current of protons in hyperpolarizing condition called “omega current”. This current ought to induce a rise of the intracellular concentration of sodium and calcium through the sodium-calcium exchanger that might cause the structural remodelling developing in dilated cardiomyopathy. Objective: The mutation R219H has been identified in a patient with a mixed dilated cardiomyopathy and arrhythmia phenotype. In the present study, investigation of heart phenotype and electrophysiology of transgenic R219H mice model was conducted. Method: Histological analysis was used to examine cell structure and tissues. The biophysical properties of the Nav1.5 channel were characterized by means of the patch clamp technique. Results: Histological analysis disclosed structural dysfunctions and loss of structural organization in myocardial cells in both heterozygous and homozygous mice. Finally, a shift of activation in heterozygous and homozygous mice were observed in electrophysiological recordings. A decline of action potential amplitude and conduction velocity was also observed in homozygous mice. The presence of the omega current was confirmed in mice carrying the mutation. Those results suggest that R219H could cause the pathology even if the precise molecular mechanism is not unravelled yet.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative incurable, dont le principal facteur de risque génétique est l’isoforme epsilon-4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOE4). La littérature rapporte une insulinorésistance cérébrale chez les patients atteints de la MA, associe APOE4 à des particularités dans la signalisation de cette hormone et montre que les patients APOE4 ne bénéficient pas d’un traitement intranasal à l’insuline, contrairement aux autres génotypes APOE. L’hypothèse que nous avons émise est qu’il y aurait des différences dans la réponse cérébrale à l’insuline entre les souris transgéniques APOE3 et APOE4. Nous avons vérifié l’effet d’une injection d’insuline sur leur comportement et sur la concentration de différentes protéines impliquées dans la signalisation de l’hormone et le développement de la MA. Nos résultats suggèrent une altération dans la réponse cérébrale à l’insuline chez les souris APOE4, qui pourrait entraîner l’hyperphosphorylation de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la MA. / Alzheimer’s disease (AD) is a incurable neurodegenerative disorder for which epsilon-4 isoform of apolipoprotein E gene (APOE4) is the main genetic risk factor. Previous studies have shown cerebral insulin resistance in AD patients and an association between APOE4 genotype and insulin brain signaling defects. Intranasal insulin treatment improves cognition in non-carriers of APOE4 but has no beneficial effects on APOE4 carriers. We hypothesized that brain insulin response would differ between APOE3 and APOE4 transgenic mice. We verified the effect of a single acute insulin injection on the behaviour and concentration of different proteins involved in insulin signaling and AD development in these mice. The results of our study suggest an altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing the human APOE4 isoform, that could possibly lead to tau hyperphosphorylation, a neuropathological marker for AD.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le tissu adipeux, outre son rôle de réserve énergétique, joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'homéostasie du métabolisme ainsi que dans la physiopathologie de différentes affections, telles que diabète de type 2, dyslipidémies ou athérosclérose. Ce rôle est en partie assuré par des substances sécrétées par le tissu adipeux dans le plasma et regroupées sous le terme d'adipokines. Il s'agit notamment du tumor necrosis factor (TNF)-α, de la leptine, résistine ou encore de l'adiponectine (ApN). L'ApN se distingue des autres adipokines car, contrairement à l'augmentation des concentrations plasmatiques de leptine, de résistine ou de TNF-α observée dans l'obésité, ses taux sont corrélés de façon négative à l'indice de masse corporelle et de façon positive à la sensibilité à l'insuline. L'ApN joue donc un rôle très important dans la modulation du métabolisme lipidique et glucidique et/ou dans la régulation de l'insulinosensibilité. Afin d'étudier les répercussions in vivo d'une expression précoce et chronique d'ApN spécifiquement dans le tissu adipeux, nous avons créé des souris transgéniques où l'ADNc de l'ApN (forme complète) a été placé sous contrôle d'un promoteur adipocytaire. Selon le nombre de copies du transgène intégré dans le génome, nous obtenons des phénotypes forts différents, voire opposés. Dans notre étude réalisée chez des souris ayant intégré un nombre modeste de copies du transgène (6 copies), nous observons une diminution de l'expression (ARNm) et du contenu protéique en ApN du tissu adipeux. Ce rétrocontrôle négatif de la production d'ApN est associé à un phénotype d'intolérance au glucose et d'insulinorésistance, à une adiposité accrue probablement suite à la faible expression des molécules impliquées dans la dissipation d'énergie et à l'accroissement de la lipogenèse. Nous assistons également à une faible expression d'AdipoR2, l'isoforme du récepteur responsable de l'action de l'ApN sous sa forme complète. A l'inverse, les souris ayant intégré un grand nombre (100) de copies du transgène présentent une augmentation de l'expression et du contenu en ApN dans différents sites du tissu adipeux blanc (le phénomène de rétrocontrôle de l'ApN endogène étant masqué par une surexpression plus prononcée de l'ApN exogène). Cette surexpression d'ApN est associée à une amélioration attendue de l'homéostasie glucidique et du profil lipidique. De plus, ces souris présentent une nette réduction de leur adiposité secondaire à une augmentation de la dépense énergétique et, fait original, à une diminution de la différenciation adipocytaire. Le remaniement du tissu adipeux résulte en de petits adipocytes, caractérisés par une diminution d'expression des enzymes lipogéniques et de marqueurs adipocytaires, ainsi que par une augmentation d'expression de protéines découplantes et d'un marqueur préadipocytaire (Pref-1). Chez ces souris, l'expression d'AdipoR2 est accrue, peut-être suite à une réduction locale de TNFα. / Adipose tissue regulates fuel homeostasis and is implicated in the pathophysiology of several components of the metabolic syndrome, such as diabetes of type 2, dyslipidemia or atherosclerosis. The secretion of regulatory peptides, often referred to as adipocytokines, mediates in part these adipose functions. The best-known adipokines include tumor necrosis factor α (TNFα), leptin, resistin and adiponectin (ApN). Unlike the other adipokines, which are elevated in obesity, plasma ApN levels are negatively correlated to body mass index and positively to insulin sensitivity. Thus, ApN plays a fundamental role in regulating lipid and glucose metabolism, and insulin action. To study in vivo the chronic effects of ApN specifically on adipose tissue, we generated transgenic mouse lines allowing persistent and moderate expression of native full-length ApN targeted to white adipose tissue. We have obtained two different phenotypes according to the number of transgene copies integrated into the genome In our mouse lines with a modest copy number (6), we observed a decrease of expression (ARNm) and protein content of ApN in adipose tissue. This negative feedback on ApN production was associated with a phenotype of the glucose intolerance and insulin resistance, and with an increased adiposity due to low expression of molecules involved in energy expenditure, and to increased lipogenesis. We also observed a weak expression of AdipoR2, the receptor isoform responsible for the action of full-length ApN. On the contrary, mice with a high copy number (100), clearly overexpressed ApN in various sites of white fat (the downregulation of endogenous ApN being masked by the marked overexpression of exogenous ApN). This overexpression of ApN was associated with an expected improvement of glucose homeostasis and lipid profile. Furthermore, these mice showed reduced adiposity, due to increased energy expenditure and decreased adipocyte differentiation. Adipose tissue remodelling resulted in smaller (younger) adipocytes, characterized by a decrease of lipogenic enzymes and of adipocyte markers, as well as by an increased expression of uncoupling proteins and a preadipocyte marker (Pref-1). In this group of mice, the expression of AdipoR2 was enhanced possibly because of a local reduction of TNFα.