Les virus herpétiques sont des pathogènes ubiquitaires caractérisés, entre autres, par la persistance de leur génome au sein de l'hôte. Parmi ceux-ci, le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à la mononucléose infectieuse, au carcinome du nasopharynx et au lymphome de Burkitt. L'homologie génomique qui existe entre certains virus herpétiques, principalement entre le gammaherpèsvirus murin 68 (MHV-68) et EBV, est établie depuis plusieurs années. Cette homologie est d'autant plus importante que ces virus sont reconnus par le système immunitaire de manière similaire chez leurs hôtes respectifs. Ce système se décline en deux volets complémentaires, soit l'immunité innée et l'immunité acquise. Les "Toll-like receptors" (TLRs) composent l'une des principales familles de récepteurs impliquées dans l'immunité innée. C'est donc sur cet aspect que le projet s'est concentré, et plus précisément sur l'activation du récepteur membranaire TLR2 par le virus MHV-68. Dans un premier temps, nous avons démontré que l'activation du TLR2 par MHV-68 mène à une augmentation de l'activité NF-KB. À l'aide de cellules fibroblastiques embryonnaires (MEFs) provenant de souris C57BL6 TLR2⁻/⁻ ou MyD88⁻/⁻, nous avons prouvé que la synthèse d'IL-6 et d'IFN-α induit par MHV-68 est partiellement dépendante du TLR2 et entièrement dépendante de MyD88. L'induction du gène TLR2 par MHV-68 a pu être établie in vivo à l'aide de souris transgéniques exprimant le gène de la luciférase sous le contrôle du promoteur du TLR2. L'utilisation de MHV-68 irradiée aux UV a donné des résultats similaires suggérant que la transcription génique et la replication virale ne sont pas essentielles à l'activation ni à l'induction du TLR2. Nous avons par la suite mis en évidence par cytometric de flux que le TLR2 était induit à la suite d'une infection par MHV-68 chez les granulocytes, les monocytes circulants et les monocytes inflammatoires recrutés au poumon. Nous avons finalement observé une diminution de la sécrétion d'IFN-α, d'IFN-β et d'IL-6 dans les poumons et la rate des souris TLR2⁻/⁻ et MyD88⁻/⁻ infectées, comparativement aux témoins (WT), et ce, de façon concomitante avec une augmentation de la charge virale. 11 s'agit de la première étude qui prouve que le virus MHV-68 est reconnu par le récepteur membranaire TLR2 murin.

L’herpèsvirus humain de type 6 (HHV-6) infecte les enfants en bas âge et sa prévalence est estimée à près de 95% dans la population mondiale. Ce virus se distingue des autres membres de la famille des herperviridae par sa capacité à s’intégrer aux chromosomes cellulaires. On estime qu’environ 1% de la population mondiale serait porteuse d’une copie du génome du HHV-6 par cellule (52, 73, 100, 119, 131). Le mécanisme de cette intégration est toujours inconnu. Nous pensons que la protéine U94 du HHV-6 joue un rôle important dans l'intégration chromosomique du génome viral. Elle serait nécessaire à l'éxécution d'une recombinaison homologue entre les séquences télomériques cellulaires et virales (motif TTAGGG). U94 a une homologie de séquence de 24% avec la protéine Rep68 responsable de l'intégration du génome de l’adeno-associated virus 2 (AAV-2) au chromosome 19 (123). Pour ce faire, quatre activités intrinsèques à la protéine Rep68 lui sont nécessaires : la liaison à l'ADN simple et double brin, l'ATPase, l'hélicase et l'endonucléase (54, 97). Le but de ce projet de recherche était de caractériser les activitités biochimiques de la protéine U94. Tout d’abord, nous avons démontré que la protéine U94A est localisée au noyau en accord avec les résultats obtenus par le laboratoire du Dr. Mori (87). Pour réaliser nos études, nous avons exprimé et purifié U94 chez E. coli en fusion avec la protéine maltose-binding protein (MPB). Nos résultats démontrent que les protéines MBP-U94A et MBP-U94B sont capables de lier préférentiellement l'ADN simple brin avec un motif CCCTAA (complément du motif télomérique TTAGGG). L’essai de liaison sur le Proteon™ XPR36 démontre également que la protéine MBP-U94B lie un ADN double brin ayant le motif télomérique cellulaire. Nos résultats nous ont amenés à vérifier si l'ARN de la télomérase, qui contient un motif CCCTAA, pouvait aussi être lié par les protéines MBP-U94A et MBP-U94B. Les résultats obtenus indiquent que MBP-U94 ne lie pas l'ARN, ni la séquence équivalente en ADN ce qui suggère que la liaison de U94 requiert plus d’une répétition du motif CCCTAA. En se basant sur des études de mutagenèse réalisées sur la protéine Rep68 (128, 129), nous avons générés des mutants U94A et U94B. Les résultats démontrent que la mutation K395A affecte négativement la capacité de liaison à l’ADN de U94. Les essais d'ATPase indiquent que MBP-U94A et MBP-U94B hydrolysent l'ATP en ADP et AMP en présence d'un ADN simple brin ou d’un ADN double brin. Divers mutants des activités d’ATPase/Hélicase et d’endonucléase présumées furent générés et devront être caractérisés. Ces résultats suggèrent que U94 possède les activités biochimiques nécessaires à l'intégration du génome viral aux chromosomes cellulaires. / Human herpesvirus 6 infects young children with an estimated prevalence of 95% in the world population. It differs from the other members of the herperviridae family by its capacity to integrate cell's chromosomes. It is estimated that approximately 1% of the world population carries a copy of the HHV-6 genome per cell (52, 73, 100, 119, 131). The chromosomal integration mechanisms used by HHV-6 are currently unknown. Our hypothesis is that the HHV-6 U94 protein plays an important role in chromosomal integration that we suspect occur through homologous recombination between cellular and viral telomeric sequences (TTAGGG). The U94 gene product shares 24% sequence homology with Rep68, a responsible for the genomic integration of adeno-associated virus 2 (AAV-2) (123). To promote integration, Rep68 relies on four intrinsic activities: binding to single and double stranded DNA, ATPase activity, helicase and endonuclease (54, 97). The goal of this research project is to characterize the biochemical properties of U94 and determine whether it posseses activities similar to Rep68. First, we confirmed the results of Dr. Mori's laboratory by showing that U94 is localized in the nucleus (87). Next, to conduct our studies, we’ve expressed and purified maltose-binding-U94 recombinant proteins (MBP-U94) in E. coli. Our results suggest that MBP-U94A and MBP-U94B preferentially bind single-strandred DNA containing the CCCTAA motif (complement to the TTAGGG telomeric motif). Surface plasmon resonance (SPR) experiments also indicate that MBP-U94B binds double-stranded DNA containing telomeric motifs. Since the telomerease RNA component TERC contains the CCCTAA motif, we investigated whether MBP-U94 could bind a single-stranded RNA molecule containing the CCCTAA motif. SPR analysis clearly indicates that MBP-U94 does not bind such RNA nor a single-stranded DNA molecule having a single CCCTAA motif, suggesting that more than one motif is required for proper binding. Based on published work on Rep68 (128, 129), we generated specific U94 mutants. Our results indicate that the K395A mutation greatly diminishes U94 binding to DNA pointing out the importance of this residue. ATPase assays were also performed and indicate that both MBP-U94A and MBP-U94B possess the ability to hydrolyze ATP into ADP and AMP when incubated in the presence of DNA. Several other mutants targeting the helicase and endonuclease activities were generated and will be tested in the near future. Altogether these results suggest that U94 has biological properties that are consistent with a role for this protein in the process of chromosomal integration of the HHV-6 genome into the host chromosomes.

Les herpèsvirus humains 6A/B (HHV-6A/B) sont deux virus ubiquitaires à l'échelle planétaire qui partagent 94% d'identité entre eux. Ces virus persistent tout au long de la vie de l'hôte en adoptant un état de latence. La latence d'HHV-6A/B est engendrée par l'intégration de leur génome entier aux télomères humains. Les télomères assurent la protection du génome cellulaire contre sa détérioration et dictent la durée de vie cellulaire. On estime que 1.1 % de la population mondiale possède la forme héritée du génome intégré d'HHV-6A/B (iciHHV-6A/B), ce qui signifie qu'environ 80 millions de personnes possèdent un génome d'HHV-6A/B dans un télomère de chaque cellule. Ceci signifie également que chez une personne iciHHV-6A/B, les virus peuvent se réactiver dans différents types de tissus cellulaires. Notamment, lors d'immunosuppression ou des traitements de chimiothérapie chez ces patients, la forme intégrée peut se réactiver et mène à de graves complications cliniques. Alors que les connaissances face à ces conséquences ont progressé, il demeure que les mécanismes fondamentaux utilisés par HHV-6A/B afin de s'intégrer aux télomères humains sont loin d'être élucidés. Les protéines précoces immédiates (IE) des herpèsvirus exercent plusieurs fonctions à des fins de réplications virales, dont celles d'être impliquées dans l'évasion du système immunitaire, dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans le remodelage des protéines qui gouvernent les télomères. L'expression soutenue des protéines IE des herpèsvirus tout au long de leur infection afin d'établir la phase lytique et latente, font de ces protéines des protagonistes intéressantes dans la quête de la compréhension du déroulement de l'intégration d'HHV-6A/B. Les protéines IE s'associent à des corps nucléaires formés par la protéine PML (PML-NBs) et compromettent l'intégrité de ceux-ci afin de favoriser l'infection virale. Cependant, il a été documenté que lors de l'infection par HHV-6A/B, leur protéine IE, IE1 (IE1A et IE1B, respectivement), s'associe aux PML-NBs sans occasionner la dégradation ou la destruction de ceux-ci. D'un point de vue télomérique, les PML-NBs s'associent aux télomères endommagés. Notamment, les PML-NBs sont impliqués dans la recombinaison homologue des télomères. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l'étude des mécanismes associés à l'intégration d'HHV-6A/B en portant une attention particulière à la caractérisation de la protéine IE1 d'HHV-6A/B (IE1A/B). Dans un premier temps, nous avons identifié les corps nucléaires de la protéine PML (PML-NBs) comme promoteurs de la SUMOylation d'IE1B. Ce résultat nous a conduits à identifier un motif d'interaction SUMO putatif d'IE1B, essentiel à la fois pour sa SUMOylation et pour son oligomérisation avec les PML-NB. Nous avons ensuite étudié le rôle des PML-NBs dans l'intégration d'HHV-6B et identifié que les cellules déficientes pour la protéine PML étaient moins susceptibles à l'intégration d'HHV-6B. Ces résultats corrèlent avec le résultat des PML-NBs qui influencent la localisation d'IE1B aux télomères. La deuxième étude est associée avec celle précédente dont l'objectif était de valider les résultats obtenus pour IE1B et HHV-6B avec IE1A et HHV-6A, dans un contexte de SUMOylation et d'absence de PML-NBs. Nous avons identifié des sites putatifs pour la SUMOylation d'IE1A, importants pour son oligomérisation. Par ailleurs, la localisation d'IE1A aux télomères et l'intégration d'HHV-6A furent influencées par la présence de PML-NBs. Ensemble, ces deux études ont mis en lumière l'importance de la SUMOylation pour l'oligomérisation d'IE1A/B, leur localisation aux PML-NBs et l'importance de ces derniers dans l'intégration d'HHV-6A/B. Lors de la troisième étude, nous nous sommes intéressés à étudier HHV-6A/B dans un contexte télomérique et ce, en nous penchant sur une protéine télomérique majeure, la protéine TRF2. Nous rapportons que la réplication de l'ADN d'HHV-6A/B augmente considérablement le nombre de répétitions télomériques dans les cellules infectées. En outre, nous démontrons que TRF2 se lient aux répétitions télomériques virales pendant l'infection et elle est importante pour l'intégration d'HHV-6A/B. La dernière étude de cette thèse avait l'objectif de caractériser la fonction d'IE1B dans un contexte de réparation de l'ADN. Nous avons mis en évidence qu'IE1B induit de l'instabilité génomique en inhibant la signalisation de la protéine détectrice de dommage de l'ADN, NBS1. Nous avons identifié deux régions protéiques d'IE1B responsables de l'interaction avec NBS1 et son inhibition. L'interaction/inhibition d'IE1B avec NBS1 mène à la diminution de la signalisation de dommage à l'ADN. Ces données corrèlent avec les évènements de différentes voies associées à la recombinaison homologue qui sont réduits en présence d'IE1B. Toutefois, NBS1 est importante pour l'intégration d'HHV-6B dans les cellules qui utilisent un mécanisme d'élongation des télomères basé sur la recombinaison homologue. Cette étude soulève la possibilité que d'autres protéines virales contrôlent l'action d'IE1B lors l'intégration afin de ne pas saturer l'instabilité génomique qui serait toxique à la survie cellulaire et virale. Dans l'ensemble, cette thèse identifie pour la première fois l'association de protéines cellulaires, PML, TRF2 et NBS1, dans l'intégration d'HHV-6A/B. Elle permet de mieux comprendre l'implication d'IE1B lors de l'infection d'HHV-6B et elle permet de percevoir une conséquence possible de l'iciHHV-6B. L'implication et l'importance d'IE1B dans l'instabilité génomique suggèrent qu'IE1B serait une cible thérapeutique pertinente dans le traitement des réactions d'HHV-6A/B. / Human herpesviruses 6A/B (HHV-6A/B) are two ubiquitous viruses distributed worldwide that share 94% identity between them. These viruses persist throughout the host's life through a state of latency. The latency of HHV-6A/B is generated by integrating their entire genome into human telomeres. Telomeres protect the host's genome from its deterioration and dictate the cell lifespan. It is estimated that 1.1% of the world's population has the inherited form of the integrated HHV-6A/B genome (iciHHV-6A/B), meaning that about 80 million people have an HHV-6A/B genome in one telomere of each cell. In an iciHHV-6A/B+ individual, viruses can reactivate in different types of cell tissue. Particularly, during immunosuppression or chemotherapy treatments in these patients, the integrated form can reactivate and lead to serious clinical complications. While knowledge about these consequences has grown, the fact remains that the fundamental mechanisms used by HHV-6A/B to integrate at human telomeres are far from clear. The immediate early proteins (IE) of herpesviruses perform several functions for viral replication purposes, including those involved in evading the immune system, responding to DNA damage, and remodeling the proteins that govern telomeres. The sustained expression of the IE proteins of herpesviruses throughout their infection in order to establish the lytic and latent phase make these proteins interesting protagonists in the quest to a better understanding of the process leading to the integration of HHV-6A/B. The IE proteins associate with nuclear bodies formed by the PML protein (PML-NBs) to compromise their integrity and promote viral infection. However, it has been documented that upon infection of HHV-6A/B, their IE protein, IE1 (IE1A/B), associates with PML-NBs without causing their degradation or destruction. From a telomeric perspective, PML-NBs associate at damaged telomeres. In particular, the PML-NBs are involved in the homologous recombination of telomeres. As part of this thesis, we were interested in studying the mechanisms associated with the integration of HHV-6A/B with particular interest in the characterization of the IE1 protein of HHV-6A/B. We first identified the PML NBs as promoters of IE1B SUMOylation. This result led us to identify a putative SUMO interaction motif of IE1B that is essential for both its SUMOylation and for the oligomerization of IE1B with PML-NBs. We then investigated the role of PML-NBs in the integration of HHV-6B and identified that cells deficient for PML were less susceptible to HHV-6B integration. These results correlate with the result that PML-NBs influence the localization of IE1B to telomeres. The second study is associated with the previous one whose objective was to validate the results obtained for IE1B and HHV-6B with IE1A and HHV-6A, in a context of SUMOylation and absence of PML-NBs. We have identified putative sites for IE1A SUMOylation, important for its oligomerization. Furthermore, the localization of IE1A to telomeres and the integration of HHV-6A was influenced by the presence of PML-NBs. Together, these two studies highlighted the importance of SUMOylation for the oligomerization of IE1A/B, their localization to PML-NBs and the importance of these in the integration of HHV-6A/B. In the third study, we were interested in studying HHV-6A/B in a telomeric context by studying a major telomeric protein, the TRF2 protein. We report that the replication of HHV-6A/B DNA dramatically increases the number of telomeric repeats in infected cells. In addition, we demonstrate that TRF2 binds to viral telomeric repeats during infection and is important for the integration of HHV-6A/B. The last study of this thesis aimed to characterize the function of IE1B in the context of DNA repair. We have shown that IE1B induces genomic instability by inhibiting the function of the DNA damage sensor protein, NBS1. We have identified two protein regions of IE1B responsible for the interaction with NBS1 and its inhibition. Interaction/inhibition of IE1B with NBS1 leads to decreased DNA damage signaling. These data correlate with the events of different pathways associated with homologous recombination which are reduced in the presence of IE1B. However, NBS1 is important for the integration of HHV-6B into cells that use a mechanism of telomere elongation based on homologous recombination. This study raises the possibility that other viral proteins control the action of IE1B during integration to not saturate genomic instability that would be toxic to cell and viral survival. Taken together, this thesis identifies for the first time the association of cellular proteins, PML, TRF2 and NBS1, in the integration of HHV-6A/B. It provides a better understanding of the implication of IE1B in the infection of HHV-6B and in identifying a possible consequence of iciHHV-6B. The implication and importance of IE1B in genomic instability suggests that IE1B may be an interesting therapeutic target in the treatment of HHV-6B reactivations.

L’herpèsvirus humain 6 (HHV-6) est un pathogène opportuniste dont l’infection et/ou la réactivation sont associées avec des maladies telles la roséole, des désordres du système nerveux central, et des complications suite à la transplantation d’organes. Le séquençage du génome viral a révélé l’existence de deux types de HHV-6 (A et B), se distinguant par des séquences dissemblables dans des régions spécifiques et des propriétés biologiques différentes. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine précoce-immédiate (IE) 2 de HHV-6A. Son expression précoce suite à l’infection et sa capacité de transactivation suggèrent qu’elle représente une protéine clé dans l’établissement d’une infection productive, grâce à son contrôle de la cascade d’expression des gènes viraux. De plus, le transcrit codant pour IE2 se situe dans la région la plus variable entre HHV-6A et -6B, suggérant que la biologie de cette protéine pourrait contribuer à expliquer les différences cliniques entre les deux types viraux. Afin de déterminer les protéines cellulaires recrutées par IE2 durant l’établissement de l’infection, nous avons criblé une librairie de cellules T à la recherche de partenaires d’interaction. Nous avons isolé la protéine Ubc9, enzyme jouant un rôle dans la voie de conjugaison de SUMO. Cette interaction a une importance fonctionnelle pour IE2, puisqu’Ubc9 réprime significativement l’activation de promoteurs par la protéine virale. Les domaines essentiels à la fonctionnalité d’IE2 n’avaient jamais été caractérisés. Nous avons démontré que les domaines N- et C-terminaux sont tous deux requis pour une transactivation optimale, et que la délétion de la queue C-terminale d’IE2 modifie significativement la transactivation et la localisation intranucléaire de la protéine. Nous avons également établi que la région R3 du promoteur précoce-immédiat de HHV-6A est positivement régulée par IE2. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus précise du rôle de la protéine IE2 dans l’initiation de l’infection par HHV-6. / Human herpesvirus 6 (HHV-6) is an opportunistic pathogen whose infection or reactivation are associated with diseases such as roseola, central nervous system disorders and organ transplant anomalies. Sequencing of the viral genome has exposed the existence of two HHV-6 variants (A and B), with diverging sequences in specific regions, and different biological characteristics. Our work focused on the characterization of HHV-6A immediate-early IE2 protein. Its prompt expression following infection and its transactivating ability suggest that IE2 constitutes a key protein for the establishment of a productive infection, owing to its control over the viral gene expression cascade. Moreover, the IE2 coding transcript is located in the most variable region between HHV-6A and -6B, suggesting that the biology of this protein could help explain the clinical differences between the two viral variants. In order to identify cellular proteins recruited by IE2 during the establishment of infection, we have screened a T-cell library for interaction partners. We have isolated Ubiquitin conjugating enzyme 9 (Ubc9), a protein involved in the small ubiquitin-related modifier (SUMO) conjugation pathway. This interaction has a functional relevance for IE2, with Ubc9 significantly repressing promoter activation by the viral protein. Protein domains essential for IE2 function had never been characterized. We have determined that the N- and C-terminal domains are both required for optimal transactivation, and that the deletion of the C-terminal tail of IE2 significantly alters transactivation and the intranuclear localization of the protein. Moreover, we have determined that the R3 domain of the immediate-early HHV-6A promoter represents an IE2 responsive element. Overall, this work provides a more precise image of the role of IE2 during the initiation of HHV-6 infection and a better comprehension of the biology of this complex virus.

L’herpèsvirus humain de type 6B (HHV-6B) infecte près de 100% des humains et établit une latence pour le reste de la vie de l’hôte. L’épidémiologie d’HHV-6A est moins connue. Ces deux virus sont capables d’intégrer leur génome dans les télomères des chromosomes humains. Lorsque cette intégration a lieu dans une cellule germinale et qu’il y a fécondation, ceci mène à un individu portant une copie du génome viral dans chacune des cellules de son corps. Cette condition, appelée inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), résulte en une transmission du génome viral intégré à 50% des descendants et est retrouvée chez environ 1% des humains. Malgré cette importante fréquence dans la population, l’intégration de HHV-6, de même que son infection et son effet sur ses cellules hôtes, demeurent peu caractérisés. Dans ce travail, nous avons étudié l’effet de l’infection d’HHV-6A et HHV-6B sur la réponse de dommages à l’ADN (DDR). Nous avons observé une forte réponse DDR localisée dans les compartiments de la réplication virale (RC), colocalisant avec une grande quantité d’ADN télomérique d’origine virale. De plus, les niveaux des ARNm des gènes TRF1, TRF2 et TPP1, membres du complexe shelterin protégeant les télomères, étaient surexprimés dans les cellules infectées. Cette augmentation se traduit par une surexpression de la protéine TRF2, recrutée aux séquences télomériques virales dans les RC. Finalement, nous avons étudié l’effet de BRACO-19, un inhibiteur de la télomérase, sur l’intégration d’HHV-6A et sa persistance. En utilisant un essai d’intégration récemment mis au point dans notre laboratoire, nous avons démontré que l’inhibition de la télomérase menait à une diminution significative de la fréquence de cellules porteuses d’intégration. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l’infection de HHV-6 et sur son mécanisme d’intégration potentiel, de même que la première observation d’une possible participation des protéines du complexe shelterin dans l’infection de HHV-6. / Human herpesviruse 6B (HHV-6B) is a very prevalent virus that infect nearly 100% of humans and establish a life-long latency. Much less is known regarding HHV-6A epidemiology. Both viruses can integrate their genome into the telomeres of human chromosomes. When this integration occurs in a germinal cell, it can lead to an individual carrying one copy of the viral genome in every cell of its body. This condition, called inherited chromosomally-integrated HHV-6 (iciHHV-6), will then be transmitted to 50% of offspring and is found in approximately 1% of individuals across the world. Despite being so frequent, much remains to be studied on HHV-6 infection and integration processes. In this work, we studied the effects of viral infection on DNA damage response (DDR) signaling. We observed a DDR located in viral replication compartments (RC), together with a large amount of telomeric sequences that we confirmed to be of viral origin. In addition, mRNAs coding for TRF1, TRF2 and TPP1, members of the shelterin complex protecting telomeres, were upregulated during infection. Consequently, TRF2 protein was overexpressed and relocated to viral telomeric sequences in RC. Lastly, we’ve examined the effects of BRACO-19, a compound that affects telomerase activity, on HHV-6 integration and persistence. Using an integration assay recently developed in our laboratory, we could demonstrate that in the presence of the telomerase inhibitor, the frequency of cells containing integrated HHV-6 was significantly reduced. This work brings new knowledge regarding HHV-6 infection and its potential integration mechanism, as well as the first observation of a possible participation of the shelterin complex proteins during HHV-6 infection.

Le virus humain herpès-8 (HHV-8) est un virus oncogene associé au développement de cancers dont le sarcome de Kaposi (KS) et le lymphome primitif des séreuses (PEL). Plusieurs études mettent en évidence l'importance de différents facteurs dont les cytokines pour la survie et la prolifération des cellules tumorales infectées par HHV-8. Les médiateurs lipidiques bioactifs, provenant de l'hydrolyse des phospholipides, jouent un rôle important dans plusieurs formes de cancer en influençant le développement, la progression ainsi que le potentiel métastatique. En effet, la littérature scientifique décrit de plus en plus clairement que l'autotaxine (ATX)/acide lysophosphatidique (LPA) ainsi que la cyclooxygénase-2 (COX-2)/prostaglandine E2 (PGE2) sont intimement liés au développement du cancer. Par conséquent, l'utilisation d'inhibiteurs ciblant la synthèse ou l'action biologique de ces médiateurs lipidiques représente une avenue thérapeutique fort prometteuse. À ce jour, le rôle des médiateurs lipidiques dans la tumorigénèse associée à HHV-8 n'est pas clairement défini. Cette thèse présente donc deux projets directement reliés à la surexpression de d'ATX et de COX-2 suivant une infection par HHV-8. Nos résultats démontrent que l'ATX, une enzyme responsable de la production de LPA, est surexprimée dans les lignées cellulaires, dans l'ascite et les biopsies cutanées provenant respectivement de patients atteints du lymphome primitif des séreuses et du sarcome de Kaposi. L'augmentation de l'activité enzymatique de l'autotaxine in vitro favorise la prolifération et/ou la survie des cellules infectées. Notre étude permet aussi de confirmer l'induction de la COX-2 suivant une infection des cellules endothéliales par HHV-8. De plus, nous avons étudié les effets de la protéine Kl5 d'HHV-8 sur l'expression et la régulation du gène de la COX-2. Nos résultats ont permis de démontrer que la protéine Kl5 induit l'expression du gène de la COX-2 via les facteurs de transcription NFAT et AP-1. L'ensemble des résultats obtenus au cours de mes études de doctorat met en évidence une conséquence importante et spécifique de l'infection par HHV-8 soit l'induction des enzymes permettant la production de lipides bioactifs. Le LPA mène à une augmentation de la prolifération et/ou de la survie des cellules infectées alors que la COX-2 est essentielle à une infection efficace in vitro ainsi qu'au maintient de la latence virale.

L'herpèsvirus humain 8 (HHV-8) est un pathogène reconnu récemment dont l'infection est associée à des maladies telles que le sarcome de Kaposi, le lymphome primitif des séreuses, et la maladie de Castleman. Le génome de HHV-8 code pour de nombreuses protéines impliquées dans l'interférence avec les mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine K-bZIP de HHV-8. Cette protéine précoce-immédiate dans le cycle viral, est issue du gène ORFK8, et est principalement décrite comme un répresseur transcriptionnel. L'étude de son impact sur la voie de transcription de l'interféron α/β a permis d'identifier un mécanisme original par lequel K-bZIP inhibe l'activation de l'interféron (IFN). En se fixant directement aux éléments de liaison de IRF3 contenus dans le promoteur de l'IFN, K-bZIP active faiblement sa transcription. En revanche, lors d'une activation des kinases cellulaires impliquées dans la transcription de l'IFN, K-bZIP entraîne une forte inhibition de l'expression du gène de l' Ifn-β. De plus, nous avons pu déterminer que K -bZIP avait un rôle inhibiteur dans la cascade d'activation induite par la liaison de l'IFN de type 1 sur son récepteur. Cette inhibition est indépendante de la phosphorylation des STATs et de la formation du complexe ISGF3. Nous avons également identifié le fait que la sumoylation joue un rôle déterminant dans la répression liée à K-bZIP. Enfin, grâce à la génération d'un ARN interférant dirigé contre le transcrit de l'ORFK8, nous avons démontré que K-bZIP est requis pour la réplication du génome viral, pour la production de virions matures, et pour une transactivation optimale des messagers lytiques viraux. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus affinée du rôle de la protéine K-bZIP dans le contexte viral.

Le virus Herpétique humain 6 (HHV-6), isolé il y a 20 ans, est un agent infectieux dont l'importance médicale est de plus en plus reconnue. Il existe deux variants distincts de HHV-6; HHV-6A et HHV-6B. Ces virus possèdent des propriétés biologiques différentes, notamment leur capacité à se propager dans diverses lignées cellulaires ainsi que leur association à des conditions pathologiques spécifiques. La maladie la plus commune définie cliniquement et associée au HHV-6B est la roséole universelle infantile (exanthema subitum). Des complications sévères de greffe de moelle osseuse, de cellules souches ou d'organes solides ont également été associées avec HHV-6. Récemment, un lien potentiel entre l'infection par HHV-6A et la maladie neurologique qu'est la sclérose en plaque (MS) a également été établi. HHV-6 est un virus à ADN qui contrôle de manière étroite le processus d'infection par une expression "en cascade" des gènes viraux. Les gènes IE, étant les premiers gènes exprimés suite à l'entrée du virus dans la cellule hôte, initient et contrôlent, non seulement la replication virale, mais également l'environnement cellulaire, de manière à permettre au virus d'établir une infection persistante au sein de l'hôte. Pour ces raisons, et parce qu'il reste beaucoup à comprendre, les protéines IE1 des virus HHV-6 sont devenues le sujet de notre étude. Au cours de nos recherches, nous avons découvert que des cellules qui exprimaient HHV6-IE1 avaient une production d'ARNm d'ifn-β diminuée de 90% suivant l'activation de la voix de l'IFN-β. Nous avons observé une diminution dose-dépendante de la quantité d'IRF3 nucléaire et dimerisé en présence de IE1. De plus, nous avons montré que IE1 perturbait l'"enhanceosome" de l'IFN-β en inhibant l'activité de liaison à l'ADN de IRF3. En présence des deux protéines (IE1A et IE1B), la quantité d'IRF3 lié est drastiquement réduite, ce qui diminue l'efficacité de transcription du gène de l'ifn-β. Stimulés par ces résultats, nous avons évalué la capacité d'IEl à interférer avec la cascade de signalisation de 1TFN de type I. Nous avons déterminé qu'IElB, contrairement à IE1A, possède un rôle inhibiteur et supprime l'induction des gènes répondant à 1TFN de type I. Ceci passe par un assemblage et une liaison non conforme du complexe ISGF3 aux séquences ISRE. IE1B se lie directement à STAT2, causant sa séquestration dans le noyau, et empêchant la formation du complexe actif ISGF3. De plus, nous avons identifié le domaine inhibiteur d'IElB (270-540 a.a.). De façon intéressante, une portion de 41 a.a. de ce domaine, normalement absente de la protéine IE1A, lorsque transféré à IE1A qui, permet a cette protéine d'influencer négativement l'expression des ISGs. De manière générale, ce travail fournit une analyse plus précise du rôle des protéines IE1 en tant qu'éléments viraux capables de réguler la réponse immune durant le processus infectieux.

Le virus Herpès humain de type 6B (HHV-6B) est un virus qui infecte environ 95% de la population mondiale et qui est relativement bénin chez les personnes immunocompétentes mais dont les réactivations sont potentiellement graves chez les immunodéprimés. HHV-6B est l’agent étiologique de la roséole de l’enfant ou exanthème subit. Comme tout virus herpétique, HHV-6B a développé diverses stratégies lui permettant de moduler le système immunitaire à son avantage afin de persister au sein de son hôte. La caractérisation de nouveaux mécanismes d’évitement utilisés par HHV-6B ou l’identification de cibles immunodominantes permettraient de mettre en place de nouvelles stratégies afin de combattre l’infection. Au cours de nos recherches, nous avons identifié que la protéine de tégument U54 d’HHV-6B inhibe la synthèse d’interleukine-2 (IL-2). Nous avons déterminé la voie de signalisation de la calcineurine (CaN) / NFAT comme étant le facteur antagonisé par U54 et caractérisé le mécanisme aboutissant à cette inhibition. De plus, en nous basant sur ces résultats, nous avons testé l’impact d’une abrogation de la voie CaN/NFAT par U54 sur la progression de cellules de cancer du sein. Nous avons démontré que l’expression d’U54 provoque une baisse significative de la proliferation de cellules de cancer du sein MCF-7. Ces résultats ont fait germer l’idée du ciblage de cellules de cancer du sein exprimant la protéine U54 couplé à un protocole d’immunothérapie adoptive anti-cancéreuse. Enfin, l’immunothérapie adoptive antivirale est également un sujet d’étude qui a été abordé. Nous avons identifié des épitopes de la protéine IE1 d’HHV-6B présentés dans le contexte de trois des allèles les plus communs dans la population caucasienne : HLA-A*02, HLA-A*03 et HLA-B*07. Ceci nous a permit de perpétrer une expansion clonale de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de lyser des cellules infectées qui pourraient servir à contrôler d’éventuelles réactivations virales chez des patients immunodéprimés. De manière générale, nos travaux permettent d’étendre les connaissances sur les mécanismes utilisés par HHV-6B pour contourner le système immunitaire de l’hôte mais également d’identifier des cibles permettant de développer un éventuel protocole d’immunothérapie adoptive.

HHV-6B, l'agent étiologique de la roséole infantile, infecte près de 90% de la population mondiale avant l'âge de 2 ans. Comme d'autres herpèsvirus, HHV-6B établit une latence à long terme dans la cellule hôte. Cette latence est toutefois distinguée des autres herpèsvirus par l'intégration du génome viral dans les télomères des cellules infectées. HHV-6B peut être hérité lorsque son génome est intégré dans des cellules germinales et a été identifié comme un agent prédisposant à l'angine de poitrine et à la prééclampsie chez la femme enceinte. Des séquences homologues aux télomères situées dans le génome de HHV-6B sont essentielles à l'intégration, cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents sont inconnus. Puisque l'intégration du génome viral requiert la présence de séquences homologues, nous avons étudié la relation entre HHV-6B et la machinerie de réparation de l'ADN. Nos travaux démontrent que le virus inhibe la signalisation de réparation des cassures double brin de l'ADN dans les cellules infectées. Plus précisément la protéine immédiate précoce 1 (IE1) de HHV-6B récapitule à elle seule les effets inhibiteurs observés en termes d'infection. Nous avons pu démontrer que les fonctions de la protéine cellulaire NBS1, un acteur initial de la signalisation des dommages à l'ADN, sont inhibées par IE1, ce qui empêche ainsi l'activation de la kinase ATM et la phosphorylation du marqueur de dommage d'ADN H2AX. Nous avons aussi constaté une interaction entre IE1 et NBS1 et caractérisé leur domaine d'interaction. Nos résultats démontrent donc que HHV-6B affecte la machinerie de réparation de l'ADN, mais la raison est toutefois encore inconnue et nécessite davantage d'étude.