Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à l'X (CMTX), deuxième cause, en fréquence, de neuropathies héréditaire, est due à des mutations dans le gène Gjb1 codant pour la connexine 32. Afin de les utiliser comme modèle pré clinique, nous avons créé 5 lignées de souris transgéniques, ayant intégré un BAC humain portant une mutation observée dans plusieurs familles indépendantes. L'exploration de ces modèles a montré que la connexine 32 (Cx32) est impliquée dans le contrôle de la stabilité mitotique. Nous avons ensuite montré que cette instabilité implique l'activité des CaMKII et, peut être, de la kinase Pim1. Cette instabilité est corrigée par des inhibiteurs des CaMKII (KN62 et KN93). Nous avons retrouvé le même phénomène dans des cellules de malades CMTX. Nous avons également pu montrer que les animaux transgéniques montrent des anomalies du comportement locomoteur, corrigées par un traitement par des inhibiteurs de CaMKII. Finalement, nous proposons des pistes pour améliorer ces molécules, en synthétisant des analogues de KN93 / X-linked Charcot -Marie -Tooth (CMTX) disease, the second cause, in frequency, of hereditary neuropathies, is caused by mutations in the gene GJB1 encoding connexin 32. As a preclinical model, we created five lines of transgenic mice, which have integrated a human BAC contain mutation observed in several independent families. The exploration of models showed that the connexin 32 (Cx32) is involved in the control of mitotic stability. We then showed that this instability involves the activity of CaMKII and, perhaps, kinase Pim1. This instability is corrected by inhibitors of CaMKII (KN62 and KN93). We found the same phenomenon occuring in cells of CMTX patients. We also showed that transgenic animals show abnormal locomotor behavior corrected by treatment with inhibitors of CaMKII. Finally, we propose strategies to improve efficiency of these molecules by synthesizing analogues of KN93

Les systèmes neuromodulateurs jouent un rôle essentiel dans la mise en place et dansla régulation des réseaux moteurs spinaux afin d’adapter finement le rythme et le patronlocomoteur aux contraintes internes et externes de l’organisme. Il a été montré que desaltérations du fonctionnement de ces systèmes étaient impliquées dans de nombreusespathologies neurologiques. La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladieneurodégénérative caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et spinaux. Bienque les symptômes de la SLA n’apparaissent qu’à l’âge adulte, de plus en plus d’élémentsamènent à penser que des modifications précoces des réseaux locomoteurs spinaux ont lieudès les stades précoces du développement chez un modèle animal de la SLA, la souris SOD1.C’est dans ce cadre général que nous avons émis l’hypothèse que des altérations précoces dessystèmes neuromodulateurs pourraient intervenir dans la physiopathologie de la SLA. Dansun premier temps, nous avons comparé la modulation monoaminergique des réseaux moteursspinaux en réalisant des enregistrements extracellulaires de l’activité locomotrice générée parla préparation de moelle épinière isolée chez la souris nouveau-née sauvage et SOD1. Nousnous sommes ensuite attachés en combinant des enregistrements électrophysiologiques extraetintracellulaires avec des techniques d’immunohistochimie et de biologie cellulaire à décrirela mise en place et l’évolution avec l’âge des synapses cholinergiques reçues par lesmotoneurones en provenance d’interneurones de la lamina X : les boutons en C. Enfin, nousavons initié une approche (1) comportementale sur le long terme de l’activité motrice dessouris SOD1 et (2) des capacités plastiques des synapses glutamatergiques reçues par lesmotoneurones en culture. L’ensemble de ces travaux, nous a permis de mettre en évidence desaltérations précoces et évolutives des principaux systèmes neuromodulateurs spinaux:cholinergique, dopaminergique et noradrénergique chez les animaux SOD1. Nos résultatsmontrent pour la première fois (1) qu’une dynamique complexe des récepteurs M2 sous lesboutons en C existe et que celle-ci est perturbée chez les souris SOD1 et (2) que lesmotoneurones ne sont pas les seuls neurones à dégénérer dans la moelle de ces animaux maisque les neurones cholinergiques de la lamina X situés dans les segments lombaires L2 sontaussi la cible de processus neurodégénératifs. / Neuromodulatory systems play a crucial role in the establishment and regulation ofspinal motor networks to finely adjust the locomotor rhythm and pattern to the internal andexternal constraints. It is now well admitted that alterations in neuromodulatory functions areinvolved in diverse neurologic disorders. Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerativedisease characterized by the specific loss of cortical and spinal motor neurons. A growingbody of evidence now suggests that although ALS syndromes occur in adulthood, alterationscan be detected as early as at the embryonic stages in the spinal cord of the rodent model ofALS, the SOD1 mouse. In this context, we hypothesized that early alterations in the spinalneuromodulatory systems may be involved in the pathophysiology of ALS. To answer thisquestion, in a first step, we compared the monoaminergic modulation of spinal network byrecording extracellularly the fictive locomotion produced in the in vitro spinal cordpreparation form newborn wild-type and SOD1 mice. By combining extra- intracellularrecordings with immunohistochemical and cellular biology technics, we aimed, in a secondstep, to investigate the cholinergic synapses arising onto motoneurons and their neuronalsource, the lamina X interneurons as a function of the mouse age. Finally, we initiated (1) aninnovative behavioural study of mouse motor habits and (2) an analysis of the synapticplasticity of glutamatergic synapses imping on motoneurons in culture. Altogether, our datademonstrated early and progressive changes of the major spinal neuromodulatory systems:cholinergic, dopaminergic and noradrenergic. Our data show for the first time that: (1) M2receptors undergo a complex dynamic under C-bouton that is completely disturbed in SOD1motoneurons and (2) motoneurons are not the only cellular subtype to degenerate in SOD1mice. Indeed, we found evidence that neurodegenerative processes also target lamina Xcholinergic interneurons in the SOD1 spinal cord.

Le fer est un élément crucial dans le bon fonctionnement de l'organisme mais le fer en excès est toxique. Les maladies de surcharge en fer sont fréquentes, on parle d'hémochromatose. L'hémochromatose héréditaire est une maladie génétique autosomique récessive, due dans la majorité des cas à une mutation du gène HFE. L'hepcidine est un peptide sécrété par le foie en réponse au fer. Elle inhibe l'absorption intestinale et le recyclage par les macrophages du fer.<br />Pour mieux comprendre le mode d'action de l'hepcidine, nous avons utilisé un modèle de souris déficientes en hepcidine. Ces souris ont une surcharge en fer massive. Nous avons mis en évidence une augmentation de la quantité des protéines impliquées dans le transport<br />intestinal du fer et de ferroportine dans le duodénum, le foie et la rate chez ces souris.<br />Nous avons voulu tester l'effet thérapeutique de l'hepcidine dans l'hémochromatose. Nous avons montré que l'apport d'hepcidine transgénique à des souris KO Hfe empêchait l'apparition de la surcharge en fer chez ces souris. Nous avons ensuite développé un modèle murin de surexpression inductible de l'hepcidine. L'induction de l'hepcidine transgénique dans des souris KO Hfe déjà surchargées en fer entraîne une altération de la distribution du fer dans ces souris, le fer étant retenu dans les entérocytes et les macrophages, associée à une diminution de la ferroportine dans ces cellules. Nous avons donc pu montrer que l'hepcidine pouvait non seulement prévenir mais guérir la surcharge en fer dans l'hémochromatose HFEdépendante.<br />L'hepcidine semble donc jouer un rôle clé dans l'étiologie de l'hémochromatose et semble être un agent thérapeutique de choix pour cette maladie.

c-fos est un proto-oncogène et un gène de réponse précoce. Son activation transcriptionnelle est très rapide et transitoire, ce qui suggère un contrôle très strict.<br />Au cours de ma thèse, nous avons abordé deux aspects de la régulation transcriptionnelle de c-fos par des séquences intragéniques. Le premier consiste en un blocage de l'allongement des transcrits dans le premier intron, dont nous avons montré qu'il intervient dans les fibroblastes Ltk-, comme cela avait été découvert dans les macrophages. Ce blocage est levé par l'augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, et nous avons montré que ce phénomène est indépendant des CaM-Kinases et de la calcineurine, mais implique la calmoduline dans une nouvelle voie de signalisation.<br />Dans la seconde partie de mon travail de thèse, nous avons identifié, en aval de la région décrite ci-dessus, une nouvelle séquence intronique très fortement conservée qui possède les caractéristiques d'un promoteur. Nous avons montré que ce promoteur est fonctionnel en transfection transitoire, ce qui nous a encouragé à recourir aux souris transgéniques pour explorer ses territoires d'expression au cours du développement. Nos résultats préliminaires montrent que cette expression semble être limitée au système nerveux et aux glandes mammaires en développement.<br />Nous avons donc étudié deux régions régulatrices de la transcription de c-fos qui sont proches dans le gène, ce qui suggère un dialogue entre ces différentes fonctions.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thyroid carcinomas are the most common endocrine tumors in humans. There are three major types of carcinomas of thyrocyte origin, including papillary, follicular, and anaplastic carcinomas. Papillary thyroid carcinoma (PTC) is the most common type of thyroid malignancy accounting 80% of thyroid cancer cases, and present several histologic variants, namely classical (45%), follicular (18%), solid, diffuse-sclerosing, cribriform, … .Specific genetic events represent early initiating and late triggering events. Several genetic lesions have been identified in various thyroid carcinomas and some of them are specifically associated to one type thyroid cancer. For instance, RET/PTC is the most common molecular event in the radiation-associated PTC in childhood. <p>In the first part of the work, we studied two transgenic mouse models: the Tg-RET/PTC3 (Tg-RP3) mouse and the Tg-E7 mouse. Both strains express the human origin transgene (RET/PTC3 rearrangement or E7) exclusively in the thyroid under the control of the bovine thyroglobulin promoter. <p>Our study of these two models showed:<p>In both E7 and RET/PTC3 mouse models, the thyroids exhibited hyperplasia with own 'oncogene-dependent' follicular cell characteristics. Small follicular cells with hyperchromatic nuclei with an increased nucleus/cytoplasm ratio were numerous in the E7 mice, and large cells with convex apical border, a decreased nucleus/cytoplasm ratio, a pale nucleus and dispersed chromatin were found in the RET/PTC3 mice. <p>At 6, 10 months and later on, E7 mice developed huge heterogeneous, normal functional thyroid goiter, with no tumor formation. <p>As in previous studies on transgenic RET/PTC3 mouse models, the generally encountered features such as solid tumours were present. We also observed conventional variant of human PTC at late age (since 11 month-old) with quite low incidence (4%). In addition to solid and conventional variant PTCs, 28% of mice developed a peculiar big size thyroid tumor pattern with “proliferative papillary cystic changes with spindle cells and remodelling” and macrophage infiltration in the cysts at as early as 2 month of age; this kind of tumor histologically resembles the rare human young age 'diffused sclerosing' variant PTC (DSVP), but disappeared after 6 month. The other peculiar tumor exhibits morphological similarity with another rare human FAP-associated (Familial Adenomatous colonic polyposis) cribriform PTC, which showed a mixed architecture of several histological patterns (solid, follicular, cribriform). At 6 months, 26% of mice presented the cribriform tumor pattern.<p>From the analyse of the proliferation index in the two models, we conclude that RET/PTC3 fusion protein over stimulates MAPK and Akt/PKB-signalling pathways, through Ras-Raf-Mek-Erk, Ras-PI3-K/Akt/PKB, particularly in the large cells which were strongly positive for three proliferation markers. E7 bypasses these two pathways, by directly binding to Rb1 protein and releasing the E2F transcription factor which induces cell proliferation. <p>So RET/PTC3 and E7 mice present several morphologic features which mimic human PTC tumors; RET/PTC3 could therefore be used as a partial model for human PTCs. <p>Further investigation of gene expression will allow the characterization of the molecular phenotype of the observed variants.<p>In the second part of the work, we attempted to generate by xenobiotic administration an in vivo model of thyroid carcinoma. Chronic exposure of CD1 mice to acrylamide in the drinking water during 6 and 8 months at doses of 3mg/kg per day similar to those causing thyroid tumorigenesis after 2 years in rats, did not induce any thyroid tumors whatever the level of thyroid stimulation. <p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les interactions réciproques entre les systèmes immunitaires innés central et périphérique s’avèrent essentielles au maintien de l’homéostasie du CNS en conditions basales. En contexte neuropathologique, les actions concertées de ces deux systèmes connexes sont déterminantes pour instaurer les changements adaptatifs nécessaires au maintien de l’activité neuronale et un retour éventuel à l’équilibre homéostatique. Au cours de la dernière décennie, il fut établi que des anomalies dans les fonctions des cellules myéloïdes sont inhérentes à l’apparition et à la progression de pathologies neurodégénératives et psychiatriques. Plusieurs allèles de susceptibilité associées aux monocytes furent identifiées comme importants facteurs de risques, mais les fonctions exactes exercées par ces cellules en contextes neuropathologiques demeurent relativement obscures. Les deux études présentées dans cette thèse leur attribuent un rôle crucial dans la neuroprotection en contexte d’excitotoxicité ainsi que dans l’élimination de l’Ab cérébrovasculaire et parenchymale chez un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer. Dans un premier temps, nous rapportons chez la souris C57BL/6J que des macrophages dérivés des monocytes circulants envahissent transitoirement le parenchyme cérébral à la suite d’une insulte excitotoxique locale induite par le kaïnate. L’administration de cette excitotoxine réduit considérablement les niveaux des monocytes patrouilleurs dans le sang, et la délétion sélective de ces cellules amenuise significativement la survie neuronale. En fait, l’ampleur des lésions neuronales corrèle inversement avec l’abondance des monocytes patrouilleurs en circulation. Dans la seconde étude, nous avons observé que les monocytes patrouilleurs sont sélectivement mobilisés dans la cavité luminale des veines corticales truffées d’Ab, chez la souris APP/PS1. Ces monocytes ingèrent les dépôts vasculaires d’Ab depuis le côté luminal et rampent momentanément sur les parois avant de rejoindre la circulation sanguine avec leur cargo amyloïde. L’abrogation de ce phénomène, via la délétion spécifique des monocytes patrouilleurs, provoque une augmentation significative de la densité cérébrale des plaques amyloïdes. Par conséquent, ces études positionnent les monocytes patrouilleurs comme régulateurs clés de la survie neuronale et des niveaux d’Ab dans l’encéphale. L’élucidation de ces fonctions inédites introduit de nouvelles pistes de recherche et de thérapie pour la maladie d’Alzheimer et autres pathologies du CNS comportant des processus excitotoxiques. / The functional interplay between the central and peripheral immune systems is instrumental for preserving the CNS homeostasis. In neuropathological contexts, the reciprocal actions of peripheral and central immune cells orchestrate adaptive changes allowing the CNS to cope with the encountered stress, and eventually restore the homeostatic state. During the last decade, myeloid cells have emerged as key therapeutic targets for many autoimmune, neurodegenerative and even psychiatric diseases. Many disease susceptibility variants associated to myeloid cells were identified, but the precise functions assumed by monocytes have remained mostly elusive. The two studies described herein report on the pivotal role of patrolling monocytes in supporting neuronal surival during excitotoxicity, as well as eliminating Ab peptides from the CNS in a transgenic murine model of Alzheimer’s disease. In the first study, we show in mice that monocytes temporarily engraft the brain following a local excitotoxic insult induced by the glutamate analog kainate. Circulating levels of patrolling monocytes are also profoundly altered following the administration of the excitotoxin, and the targeted deletion of patrolling monocytes significantly compromised neuronal survival. Moreover, the extent of neuronal death negatively correlated with levels of patrolling monocytes in the blood. In the second study, we demonstrate that patrolling monocytes are selectively attracted to Ab-laden veins in the cerebral cortex of adult APP/PS1 mice. These monocytes do not crawl on the luminal side of Ab-positive arteries or Ab-free blood vessels. Interestingly, patrolling monocytes carry intracellular loads of Ab in veins, and eventually circulate back to the bloodstream. The selective removal of patrolling monocytes significantly increased Ab load in the brain. Therefore, our results indicate that patrolling monocytes are strategically positionned to promote neuronal survival following kainate administration and abate cerebral levels of Ab in APP/PS1 mice. These findings open new research and therapeutic avenues for Alzheimer’s disease as well as neuropathological disorders implicating excitotoxicity.

L’implication du virus Epstein-Barr (EBV) dans la progression de l’arthrite rhumatoïde (AR) est suspectée depuis plusieurs années. Il a précédemment été démontré que l’infection par le gammaherpèsvirus MHV-68 subséquente à l’injection de sérum arthritique aggrave l’inflammation articulaire. Cette réaction semble également spécifique au virus MHV-68 puisque ce phénomène n’est pas observable lors d’une infection par les virus mCMV ou HSV-1. La présence du génome viral détectée au niveau du tissu synovial indique que le virus peut être transporté par une sous-population cellulaire jusqu’aux articulations. La présence du virus a été décelée dans les monocytes inflammatoires, cellules présentes au niveau du liquide articulaire des souris infectées. Ces résultats démontrent que les monocytes inflammatoires jouent un rôle important dans l’exacerbation des symptômes induits par le virus MHV-68 dans un modèle murin d’arthrite. L’implication du TLR2, du TLR9, de même qu’EBV est également suggérée dans la pathogénèse de l’AR. / For several years, the Epstein-Barr virus (EBV) is suspected to be involved in rheumatoid arthritis (RA) pathogenesis. Using a mouse model of arthritis, it was previously demonstrated that infection of arthritic mice with the herpes virus MHV-68, resulted in exacerbation of inflammation in joints of mice. Furthermore, this phenomenon was MHV-68 specific since no other herpes virus such as HSV-1 of mCMV was found to increase joint inflammation of arthritic mice. The presence of MHV-68 genome in synovial tissues of arthritic mice and subsequently in inflammatory monocytes also suggest the potential role of these cells in virus transport to the joint of arthritic mice. Together, these findings demonstrate the key role of inflammatory monocytes in exacerbation of inflammatory symptoms induced by MHV-68 in arthritic mice. The involvement of TLR2, TLR9 and EBV is also suggested in RA pathogenesis.

La mauvaise localisation cytoplasmique et l'agrégation de la TDP-43, communément appelée pathologie TDP-43, est une caractéristique de nombreuses maladies neurodégénératives, notamment la SLA (sclérose latérale amyotrophique), la démence frontotemporale (FTD). La TDP-43 est une protéine de liaison ADN / ARN située principalement dans le noyau des cellules et contribue au métabolisme de l'ARN, à la condensation de la chromatine et à la régulation de la traduction. Il a été démontré que l'augmentation de la TDP-43 cytoplasmique dans la SLA / FTD supprime la traduction globale en se liant avec RACK1 sur le polyribosome. Cependant, l'impact de la pathologie du TDP-43 sur le profil de traduction neuronal cérébral in vivo reste inconnu. De nombreux groupes ont généré diverses souris transgéniques exprimant des mutations TDP-43 et ont montré des changements pathologiques rappelant la SLA humaine et la FTD chez ces souris. Auparavant, il a été rapporté que dans les cas de SLA, le TDP-43 se lie à la sous-unité p65 NF-κB et améliore son activité de signalisation dans le système nerveux central (SNC). En outre, un extrait de racine de plante médicinale appelée Withania somnifera et son actif withanolide Withaferin-A (WFA), un puissant inhibiteur de NF-ĸB, a réduit l'inflammation et montré des effets bénéfiques lorsqu'il est administré dans des modèles de souris ALS/FTD. Une étude a montré que le traitement WFA protégeait les neurones dopaminergiques et la fonction motrice chez les rats vieillissants. Il a été rapporté que WFA perturbe la réorganisation du modulateur essentiel NF-ĸB (NEMO) en modifiant de manière covalente la cystéine-397, et par conséquent endommage la signalisation IKKß. Dans la présente étude, nous avons testé le potentiel thérapeutique de deux inhibiteurs de NF-ĸB WFA et un nouvel analogue semi-synthétique de WFA nommé IMS-088 en utilisant des modèles de souris transgéniques pour FTD / ALS exprimant hTDP-43 mutants. En outre, nous avons également cherché à identifier le profil de traduction de l'ARN neuronal sous-jacent aux changements associés à la maladie dans la FTD / SLA. Le traitement de ces inhibiteurs de NF-ĸB à des souris mutantes exprimant hTDP-43 a amélioré les déficits cognitifs, réduit l'activité de NF-ĸB, réduit les agrégats cytoplasmiques de TDP-43 et augmenté les niveaux de marqueurs d'autophagie. En utilisant la spectrométrie de masse de peptides nouvellement synthétisés de ribosomes, nous avons également étudié l'impact du traitement IMS-088 sur le profil de traduction neuronal à l'aide d'un double RiboTag transgénique; souris hTDP-43A315T. Nous avons identifié et rapporté pour la première fois que la protéinopathie TDP-43 provoque une désorganisation neuronale du cytosquelette, y compris la répression traductionnelle des ARNm des neurofilaments. En outre, notre étude a révélé que l'induction de l'autophagie réduit la pathologie TDP-43 et améliore le défaut de traduction observé chez les souris modèles de la SLA / FTD. En se basant sur ces résultats, nous suggérons que ces inhibiteurs de NF-ĸB sont considérés comme des traitements potentiels pour les troubles neurodégénératifs avec protéinopathies TDP-43. / Cytoplasmic mis localisation and aggregation of TDP-43, commonly known as TDP-43 pathology is a characteristic hallmark of many neurodegenerative diseases including Amyotrophic lateral Sclerosis and Frontotemporal Dementia (FTD). TDP-43 is a DNA/RNA binding protein majorly located in the nucleus of the cells and plays a crucial role in RNA metabolism, chromatin condensation and translational regulation. Increased cytoplasmic TDP-43 in ALS/FTD has been shown to suppress global translation by binding with RACK1 on polyribosome. However, the impact of TDP-43 pathology on brain neuronal translational profile in vivo remains unknown. Many groups have generated various transgenic mice expressing TDP-43 mutations and showed pathological changes reminiscent of human ALS and FTD in these mice. Previously, it was reported that in ALS cases, TDP-43 binds with p65 NF-κB subunit and enhance its signalling activity in the central nervous system (CNS). Further, a root extract of herbal medicinal plant named Withania somnifera and its active withanolide Withaferin-A (WFA), a potent NF-ĸB inhibitors has reduced inflammation and shown beneficial effects when administered in ALS/FTD mouse models. A study has shown that WFA treatment protected the dopaminergic neurons and motor function in aging rats. WFA has been reported to disrupt the NF-κB essential modulator (NEMO) reorganization by covalently modifying Cysteine-397, and as a result damages IKKβ signalling. In the present thesis, we have tested the therapeutic potential of two NF-ĸB inhibitors WFA and a novel semisynthetic analog of WFA named IMS-088 using transgenic mouse models of FTD/ALS expressing hTDP-43 mutants. In addition, we also aimed to identify neuronal RNA translational profile underlying disease associated changes in FTD/ALS. Treatment of mutant hTDP-43 expressing mice with these NF-ĸB inhibitors ameliorated cognitive deficits, reduced NF-ĸB activity, reduced cytoplasmic TDP-43 aggregates and enhanced levels of autophagy markers. Using mass spectrometry of newly synthesized peptides of ribosomes, we also studied the impact of IMS-088 treatment on neuronal translational profile using a double transgenic RiboTag;hTDP-43ᴬ³¹⁵ᵀ mice. We identified and report for the first time that TDP-43 proteinopathy causes neuronal cytoskeletal disorganization including translational repression of neurofilament mRNAs. Further, our study revealed that induction of autophagy reduces TDP-43 pathology and improves the translational defect seen in mice models of ALS/FTD. Based on these finding, we suggest that these NF-ĸB inhibitors should be considered as potential therapeutics for neurodegenerative disorders with TDP-43 proteinopathies.