La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique neuromusculaire provoquée par des mutations du gène codant pour la dystrophine situé sur le chromosome Xp21. L'absence de cette protéine membranaire engendre une dégénérescence progressive des cellules, une augmentation de la concentration du calcium intracellulaire, des dommages oxydatifs, inflammatoires et ultimement une fibrose musculaire. Les patients souffrent également de plusieurs autres anomalies dont les plus importantes sont la cardiomyopathie et l'ostéoporose. Il n'y a actuellement aucune stratégie curative pour la DMD. Les corticostéroïdes sont prescrits pour prolonger la mobilité et l'espérance de vie, mais sont associés à une ostéotoxicité élevée. Bien qu'il existe une association entre l'ostéoporose et la dégénérescence musculaire, nous avons été les premiers à étudier le rôle du récepteur-activateur du facteur nucléaire kB (RANK), son ligand RANKL et du récepteur soluble ostéoprotégérine (OPG), principaux régulateurs du remodelage osseux, dans le contexte des maladies musculaires. Nos travaux antérieurs montrent que les myotubes différenciés secrètent l'OPG, expriment le récepteur RANK à leurs surfaces et dans le contexte de DMD l'expression de l'ARNm de RANK est 4 fois plus élevée dans les muscles de souris dystrophiques comparativement aux muscles sains. L'objectif de la présente thèse vise à exploiter cette voie afin de comprendre le mécanisme d'action de ces cytokines sur la physiopathologie musculaire et d'établir une stratégie thérapeutique pour la DMD en traitement unique ou combinée aux glucocorticoïdes. Dans un premier temps, nous avons investigué l'impact de la neutralisation systémique à long terme de RANKL sur l'intégrité et la fonction musculaire et osseuse dans un modèle sévère de dystrophie déficient en dystrophine/haploinsuffisant en utrophine. Ensuite, nous avons étudié les rôles physiopathologiques de l'OPG sur les tissus musculaires en caractérisant la fonction musculaire de souris déficientes en OPG. Finalement, nous avons débuté une étude sur l'effet de neutralisation systémique de RANKL sur l'ostéoporose associée à un traitement au deflazacort, un glucocorticoïde prescrit pour la DMD. Ainsi nous avons démontré que le traitement à long terme à l'anti-RANKL améliore la fonction et l'intégrité musculaire et osseuse chez les souris dystrophiques et protège contre l'ostéoporose induite par les glucocorticoïdes. À l'opposé, l'absence d'OPG induit, possiblement via RANKL, une faiblesse osseuse et musculaire et une atrophie sélective des fibres musculaires les plus puissantes. Ces avancées repoussent les connaissances au sujet de la voie RANK/RANKL/OPG au sein de la communication muscle-os et appuient l'anti-RANKL comme perspective thérapeutique chez les patients atteints de la DMD.

Les troubles musculo-squelettiques entraînent une dégradation simultanée des tissus osseux et musculaires. L’objectif de ce mémoire était d’évaluer si la voie RANK/RANKL/OPG, connue dans les os, joue un rôle important dans la régulation du tissu musculaire. Des souris spécifiquement déficientes en RANK musculaire (RANKmKO) et des souris contrôles (RANKf/f) ont subi une dénervation des nerfs sciatiques suivie d’une injection quotidienne de dexaméthasone pendant 7 jours (modèle animal de myopathie acquise aux soins intensifs). Après le sacrifice, les propriétés contractiles étaient mesurées et les propriétés immunohistochimiques étaient obtenues sur les muscles soléaires et longs extenseurs des doigts. Nos résultats démontrent que RANK musculaire est un régulateur de la fonction et du phénotype musculaire et que son absence améliore significativement la force musculaire des muscles rapides. Globalement, ces travaux nous permettent de mieux comprendre les dysfonctions musculaires et ouvrent la voie à de nouvelles pistes de traitement pour plusieurs formes de myopathies.

La dystrophie musculaire de Duchenne est caractérisée par une dégénérescence musculaire progressive accompagnée d’une fragilité osseuse exacerbée par la norme de soins actuelle. Au-delà de la relation mécanique qui unit leur croissance, maintenance ou dégénérescence, les muscles et les os interagiraient à l’échelle moléculaire via des sentiers signalétiques communs. La voie RANK/RANKL/OPG, un gouverneur du remodelage osseux, est au nombre de ces voies suite à la découverte de la triade en contexte musculaire, de la capacité des cellules musculaires à sécréter de l’OPG, de la localisation du récepteur RANK au sarcolemme et de l’effet inotropique de la délétionmusculaire de RANK sur l’atrophie induite par dénervation. Élément déterminant, le bénéfice musculaire d’un traitement au FL-OPG-Fc, protagoniste de la triade fusionnée à un fragment Fc, est supérieur aux stratégies pharmacologiques ou génétiques d’inhibitionde RANK/RANKL pour la souris dystrophique et suggère un effet biologique hors-triade. Malgré ces évidences morcelées et compte tenu de la structure du FL-OPG-Fc, un potentiel mécanisme d’action musculaire est inconnu. Ce mécanisme constitue l’idée originale de cette thèse et nécessite investigation à l’aide d’un modèle pré-clinique prédictif et fidèle au déroulement de la pathologie. Le but de cette thèse est 1) caractériser à différents stades de vie les propriétés fonctionnelles et contractiles d’un nouveau modèle dystrophique pré-clinique murin ainsi que les paramètres discriminants par rapport à la souris sauvage, 2) mettre à jour les connaissances sur la cohésion signalétique ainsi que le dialogue moléculaire bidirectionnel muscle-os en contexte de dystrophie musculaire et 3) investiguer la capacité du FL-OPG-Fc à interagir directement avec les cellulesmusculaires, en explorer la signalisation cellulaire puis vérifier la présence d’un effet bénéfique aigu sur la contractilité de muscles dystrophiques. Premièrement, nos recherches sur le nouveau modèle ont démontré que l’haploinsuffisance en utrophine dans la souris délétée en dystrophine n’a pas d’impact sur sa performance fonctionnelle et contractile à 1, 2 et 5 mois d’âge. Ces données ont permis d’établir que la souris déficiente en dystrophine était pertinente pour nos études,moyennant l’utilisation préférentielle de variables expérimentales discriminantes par rapport à la souris sauvage telles que la force maximale spécifique et la résistance aux contractions excentriques. Deuxièmement, en ce qui a trait aux voies communes et aux dialogues muscle-os en contexte de dystrophie musculaire, nos travaux de synthèse ont répertorié des interactions basées sur des myokines, ostéokines et cytokines de double origine déclenchant des sentiers signalétiques menant entre autres à l’inflammation, la fibrose, la synthèse ou la dégradation protéique. Collectivement, les sources citées par notre ouvrage soulignent l’importance de considérer les muscles et les os en tant qu’unité pour orienter les recherches précliniques vers le développement d’approches multifonctionnelles efficaces à traiter ces affections musculaires et osseuses de manière simultanée. Troisièmement, nos travaux de recherche ont montré que le FL-OPG-Fc peut directement associer et influencer le muscle squelettique grâce à son domaine de liaison à l’héparine tant pour les fibres saines que celles déficientes en dystrophine, et ce, au moins en partie de manière indépendante du récepteur RANK. Puis, cette liaison musculaire peut engendrer une cascade de signalisation cellulaire incluant les protéines FAK/Akt/CaMKII/PLN. Concrètement, nos résultats ont indiqué que le FL-OPG-Fc peut avoir un effet protecteur dans les cellules musculaires contre les dommages causés par une surcharge calcique. Finalement, le FL-OPG-Fc peut avoir un effet potentiateur sur les contractions tétaniques des muscles dystrophiques de phénotype rapide, effet nécessitant la présence du domaine de liaison à l’héparine pour s’opérer. Globalement, cette thèse apporte une contribution à l’avancement des connaissances sur le développement scientifique de modèles précliniques de DMD, sur les sentiers communs aux muscles et aux os, sur l’existence ainsi que le domaine de l’interaction du FL-OPG-Fc directement sur les cellules musculaires et sur une des voies de signalisation potentielles par laquelle le FL-OPG-Fc peut les influencer. Ces avancées biologiques repoussent les connaissances au sujet de la voie RANK/RANKL/OPG au sein de la communication muscle-os. Ces résultats peuvent également être mis en perspective de situations physiologiques comme la croissance, la maintenance et l’homéostasie, où ce dialogue pourrait s’exprimer dans la régulation réciproque du muscle et de l’os. Finalement, les connaissances générées au sujet de la protéine OPG pourront contribuer à la compréhension des rôles hors-triade de l’OPG répertoriés pour de multiples types cellulaires non-osseux.

Une synchronicité existe entre l’apparition de l’atrophie musculaire et osseuse (ostéoporose) mais, très peu de groupes de recherche se sont intéressés à la possibilité qu’une voie de signalisation commune puisse contrôler simultanément ces tissus dans un contexte pathologique. Le but de cette thèse est de caractériser les rôles du sentier signalétique principal du remodelage osseux soit la voie RANK/RANKL/OPG, sur le muscle squelettique sain ou pathologique. Premièrement, nous avons démontré que RANK est exprimé dans le muscle squelettique et que son absence dans ce tissu induit un effet inotropique sur le muscle rapide extensor digitorum longus (EDL), limitant ainsi la perte de force maximale spécifique, tout en augmentant l'atrophie musculaire, la fatigabilité et la proportion de fibres rapides. Ensuite, nous avons montré qu’un blocage pharmacologique de la voie RANKL/RANK par l’OPG atténue la perte de la force musculaire de manière dose-dépendante et préserve l'intégrité musculaire, en particulier des muscles rapides EDL de souris dystrophiques. Cette étude nous a également permis de démontrer que l’OPG-Fc a un effet intéressant mais plus limité sur la préservation de la force du muscle lent soleus (Sol). Par contre, nous avons découvert que l’OPG-Fc potentialise les effets positifs d'une faible dose de formotérol, un membre de la famille des β2-agonistes, et leur combinaison restaure complètement la fonction du Sol des souris dystrophiques. Finalement, nous avons débuté une étude mécanistique sur l’effet protecteur de l’OPG-Fc sur le muscle squelettique dystrophique. Structurellement, l'OPG-Fc pleine longueur contient quatre domaines TNFR (RANKL), deux domaines de la mort cellulaire par apoptose (TRAIL) et un domaine lié à l'héparine. Nos résultats indiquent que les injections d'anti-RANKL, d’anti-TRAIL et d’OPG-Fc tronquée (possédant seulement les domaines TNFR) ou la suppression génétique de RANK dans le muscle sont nettement moins efficaces sur la préservation de la force des muscles dystrophiques que celles d’OPG-Fc pleine longueur. Étonnamment, l'absence de Ca2+ extracellulaire réduit considérablement les effets de l’OPG-Fc pleine longueur sur la force des muscles dystrophiques dans un modèle de contractilité in vitro. Nos analyses en microscopie confocale ont démontré que l’OPG-Fc pleine longueur pourrait se lier à un récepteur présentement non identifié localisé sur les myotubes et que cette liaison entraîne possiblement une activation d’une kinase liée aux intégrines (ILK) et la surexpression d’une pompe calcique ATPase du réticulum sarcoplasmique appelée SERCA-2a, un déterminant clé de la performance musculaire. Les myotubes traités à l'héparinase, une enzyme connue pour cliver les domaines de l'héparine ou encore l’inhibition de l’ILK réduit significativement la surexpression de SERCA-2a induite par l’OPG-Fc. Cette thèse apporte globalement, une meilleure compréhension des fonctions de RANK/RANKL/OPG dans le muscle squelettique dénervé ou dystrophique et s’inscrit dans la liste des travaux pré-cliniques qui pourrait éventuellement contribuer à l’élaboration de nouveaux traitements pour les maladies musculaires et osseuses. / Although there is an obvious dynamic cross-talk between muscle and bone, a common signalling pathway that efficiently and synchronously controls these tissues has barely been investigated in all forms of muscle diseases. The aim of this thesis is to characterize the roles of RANK/RANKL/OPG, key regulators of bone remodeling, on skeletal muscle atrophy, phenotype and dysfunction. Firstly, we show that RANK is expressed in skeletal muscle and that muscle RANK deletion has inotropic effects in denervated fast-twitch extensor digitorum longus (EDL) muscles, preventing on one side the loss of maximum specific force while promoting muscle atrophy and fatigability, and increasing the proportion of fast-twitch fibers. We next demonstrate that a pharmacological treatment of dystrophic mdx mice with recombinant full-length OPG-Fc mitigates the loss of muscle force in a dose-dependent manner and preserves muscle integrity, particularly in EDL muscles. We also found that the full-length OPG-Fc has limited effects on slow-twitch soleus (Sol) muscles. However OPG-Fc potentiates the positive effects of a low dose of formoterol, a member of β2-agonists, and completely restores the function of the Sol dystrophic muscles. Finally, we investigated the mechanism by which the full-length OPGFc protects the dystrophic muscles. Structurally, the OPG protein contains four TNFR domains (RANKL), two death domains ( TRAIL) and a heparin-binding region. Our results indicate that anti-RANKL or anti-TRAIL or truncated OPG treatments (only TNFR domains) or RANK deletion are much less effective in preserving the strength of dystrophic muscles than full-length OPG-Fc. Surprisingly, the absence of extracellular Ca2+ significantly reduces the effects of full-length OPG-Fc on the force production of dystrophic muscles when incubated in a physiological bath in vitro. Confocal microscopy images showed that the full-length OPG-Fc binds directly to myotubes through a receptor that is currently unidentified activating possibly integrin-linked kinase (ILK) which upregulates sarco/endoplasmic calcium ATPase pump (SERCA-2a) expression in C2C12 myotubes. Heparinase, which cleaves heparin and heparin sulphate proteoglycan, or an inhibitor of ILK activity abrogates OPG-induced SERCA-2a expression, suggesting that OPG through ILK upregulates SERCA-2a expression, a key determinant of muscle performance. Overall, this thesis shed some light on RANK/RANKL/OPG functions in skeletal muscle which will potentially contribute to the development of new treatments for several forms of muscle and bone diseases.

L’atrophie et les dysfonctions musculaires sont des problèmes courants et d’origines variées. À titre d’exemple l’alitement prolongé, le SIDA, les cancers, l’hypogravité et le vieillissement peuvent tous entraîner une perte de masse et de force musculaire. Malgré les coûts économiques et sociaux élevés, relativement peu d’efforts ont été investis dans la caractérisation des processus qui gouvernent l’atrophie/dysfonction musculaire et dans le développement de traitements plus efficaces. Conséquemment, cette thèse vise à approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes qui régulent l’atrophie/dysfonction et la récupération des muscles atrophiés par sous-utilisation. Tout d’abord, nous avons caractérisé l’impact des leucocytes impliqués lors de la remise en charge du muscle soléaire atrophié par hypogravité. Ainsi, nous avons démontré que les mastocytes étaient activés par la remise en charge et que leur dégranulation orchestrait le recrutement des neutrophiles et des monocytes/macrophages. Ensuite, nos recherches ont indiqué que l’activité des neutrophiles pouvait être régulée en fonction de leur microenvironnement et que leur présence dans les muscles atrophiés et inflammés n’était pas nécessairement associée à l’induction de dommages secondaires. Par la suite, nous avons établi que la présence des macrophages était importante pour permettre la récupération optimale de la force des muscles atrophiés. Nous avons également démontré que l’activité myogénique des macrophages pouvait être optimisée en favorisant leur phénotype anti-inflammatoire avec le facteur de croissance hématopoïétique « macrophage-colony stimulating factor » (M-CSF). Finalement, nous avons caractérisé l’impact du « receptor activator of NF-kB » (RANK) et de son ligand RANKL, une voie signalétique impliquée dans le remodelage osseux et l’ostéoporose, sur l’atrophie/dysfonction musculaire. Nous avons démontré qu’une déficience de RANK ou le blocage de RANKL par l’ostéoprotégérine protègent contre la perte de force des muscles dénervés ou dystrophiques. Ce phénomène est associé à des modifications dans l’expression des protéines favorisant une recaptation plus efficace du calcium. De plus, RANK participe à la reconversion des fibres rapides vers lentes durant la période de remise charge. Globalement, nos travaux permettent de mieux comprendre les mécanismes entourant l’atrophie, la croissance et les dysfonctions musculaires et ouvrent la voie à de nouvelles pistes de traitement pour plusieurs maladies neuro-musculaires. / Muscle atrophy and dysfunction are characterized by a loss of muscle mass and force, which are commonly found in many pathologies or conditions such as AIDS, cancers, chronic obstructive pulmonary diseases, cast immobilization, hypogravity, bed rest or aging, to name a few. Muscle atrophy/dysfunction have also very high social and economic costs, but very few laboratories have investigated the cellular and molecular mechanisms behind these muscular problems. The aim of this thesis is therefore to enhance our understanding of different mechanisms governing muscle atrophy/dysfunction and regrowth by using different models of disuse and dystrophy. Thus, we have initially explored the roles of different leucocytes in atrophied and reloaded soleus muscle. Firstly, we looked at the role of mast cells and showed that the mechanical stress associated with muscle reloading is able to stimulate mast cell degranulation, which orchestrates the recruitment of neutrophils and monocytes/macrophages. Secondly, our experiments revealed that neutrophil activity is adaptable and that neutrophil-induced tissue damage is dependent on the microenvironment. In atrophied and reloaded muscles, the presence of neutrophils is not associated with secondary damage or promotion of muscle recovery. Thirdly, we demonstrated that the presence of macrophages is essential for optimal muscle force recovery from atrophy. Fourthly, we showed that the macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) promote the myogenic activity of macrophages by stimulating their anti-inflammatory phenotype. Finally, we investigated the impact of the receptor activator of NF-kB (RANK) and its ligand RANKL, a signalling pathway involved in bone remodelling and osteoporosis, on muscle atrophy and dysfunction. Our results showed that the specific deletion of RANK in the muscle or the blockage of RANKL with osteoprotegerin increased significantly force production in denervated and dystrophic muscles. These results were associated with various modifications in calcium handling protein expression favouring efficient calcium uptake. Moreover, we also demonstrated that RANK activation gives preference to the reconversion from fast-to-slow muscle fibers following hindlimb unloading/reloading. Overall, our results bring a better understanding of different mechanisms related to muscle atrophy, dysfunction and regrowth and potentially open new avenues for the treatment of several debilitating skeletal muscle conditions.

La polyarthrite rhumatoïde (PAR) est une maladie auto-immune dont le processus inflammatoire chronique aboutit à la formation d’érosions osseuses. Dans PAR, les neutrophiles peuvent exprimer le récepteur activateur NF-κB (RANK), facteur de régulation des réponses immunes et osseuses. Afin d’étudier le rôle de RANK exprimé par les neutrophiles inflammatoires dans la perte osseuse locale de la PAR, une arthrite expérimentale mimant la PAR est induite chez des souris dont le gène RANK est conditionnellement délété dans les neutrophiles (CKO-RANK). Les neutrophiles purifiés du liquide synovial des souris sauvages sont capables d’exprimer RANK et de former des cellules multinucléées résorbant une matrice calcifiée in vitro. La tomographie micro-informatisée des lésions articulaires montre la perte osseuse locale chez les souris sauvages avec arthrite alors que les souris CKO-RANK avec arthrite n’ont pas cette perte osseuse. Ces travaux montrent donc que ces neutrophiles inflammatoires exprimant RANK sont associés à la perte osseuse pathologique. / Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease whose chronic inflammation process results in the bone erosion formation. In RA, the neutrophils can express the receptor activator of NF-κB (RANK), a factor regulator of immune and bone responses. To study the role of RANK expressed by inflammatory neutrophils in pathological local bone resorption in RA, an experimental arthritis imitating RA is induced in mice with gene RANK conditional knock-out in neutrophils (CKO-RANK). Neutrophils purified from synovial fluid of wild-type mice are capable to express RANK and are capable to form the multinucleated cells resorbing bone matrix in vitro. Microcomputed tomography of the articular lesions shows the bone loss in wild-type mice with arthritis, while mice with CKO-RANK neutrophils with arthritis do not have this bone loss. Thus, these results show that inflammatory neutrophils expressing RANK can resorb bone of inflamed joints during arthritis.

Le neutrophile, le leucocyte le plus abondant de circulation, est un acteur majeur dans la réaction inflammatoire. Bien qu'il soit indispensable pour la défense de l'hôte, le dérèglement de l'activité des neutrophiles a également le potentiel de causer des dommages tissulaires importants. Nous sommes partis de l'hypothèse que l'exposition à long terme à des médiateurs inflammatoires pourrait changer le profil fonctionnel du neutrophile. À cette fin, nous avons incubé des neutrophiles circulants humains avec des cytokines facilitant la survie et trouvé une sous-population de ces cellules pouvant persister pendant plus de 72 heures. Par rapport aux neutrophiles fraîchement isolés, ces neutrophiles de longue durée de vie avaient un phénotype très différent avec des caractéristiques de surface modifiée. Leurs fonctions effectrices notamment le chimiotactisme, la production de superoxyde et de leucotriènes, la dégranulation et la synthèse de cytokines, etc. ont été également modifiées. Comme les médiateurs dérivés de neutrophiles ont été impliqués dans la propagation de l'inflammation dans l'arthrite rhumatoïde, on a essayé ensuite de placer le neutrophile ± reprogrammé ¿ dans ce contexte spécifique. Nous avons trouvé que le liquide synovial et des neutrophiles stimulés par le lipopolysaccharide pouvaient augmenter l'expression de surface du receptor activator of NF-kappa B ligand (RANKL), une molécule essentielle pour l'activation de la résorption osseuse, par le neutrophile. En effet, nous avons montré que le RANKL du neutrophile interagit avec le RANK exprimé par les ostéoclastes, et induit la différenciation des ostéoclastes et la résorption osseuse. En outre, le RANKL associé à la membrane est actif au sein du neutrophile lui-même, induit une phosphorylation du Src homology 2 domain-containing tyrosine phosphatase -1 et inhibe les fonctions des neutrophiles. De plus, nous avons procédé à la co-incubation des neutrophiles avec des synoviocytes d'arthrite rhumatoïde (RA-FLS). Cette co-incubation induit l'expression de RANK dans les neutrophiles. L'activation du RANK par son ligand biologique favorise la survie des neutrophiles, la dégranulation et la synthèse de cytokines. En conclusion, nous présentons des preuves que le neutrophile inflammatoire acquiert de nouvelles fonctions au-delà de celles associées à sa contrepartie classique circulant. Par ailleurs, l'expression de molécules ostéotropiques de l'axe RANKL-RANK-OPG positionne le neutrophile comme un lien cellulaire entre le squelette et le système immunitaire.