Thèse (Ph.D.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 173-195. Publié aussi en version électronique.

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont pour caractéristiques principales l'auto-renouvellement permettant de les avoir de manière quasi-illimité ainsi qu'un potentiel de différenciation, qui en théorie, peut permettre de générer l’ensemble de cellules de l'organisme. Ces deux caractéristiques en font un outil de choix pour une utilisation en médecine régénérative, disséquer certains mécanismes du développement humain, l'étude de maladies génétiques et la recherche de nouveaux médicaments. Durant mes travaux de thèse, j'ai utilisé les hPSC afin de mettre en place un nouveau modèle d'étude de l'amyotrophie spinale infantile (SMA). La SMA est une maladie neurodégénérative due à la mort spécifique des motoneurones (MN) de la moelle épinière qui provoque une atrophie des muscles striés. La première étape a consisté à la mise en place d'un protocole de différenciation efficace en motoneurones à partir des hPSC. A l'issue d'un criblage combinatoire de morphogènes, nous avons identifié une condition permettant la production de motoneurones spinaux de façon efficace (70%) et rapide (14 jours). Des conditions de génération de motoneurones craniaux (50%), sensitifs (65%) et inter-neurones (75%) ont également été identifiées. Ce protocole de différenciation optimisé a ensuite été appliqué sur des lignées de cellules souches induites à la pluripotence (hIPS) reprogrammées à partir de fibroblastes porteurs de la mutation causale de la SMA ainsi que sur des fibroblastes contrôles. Nous avons mis en place un système d'étude des motoneurones en plaque 384 afin d'étudier le phénotype de dégénérescence spécifique des MN-SMA sur des cultures à long terme, via des approches d'analyse à haut débit. Nos travaux montrent que notre modèle de la SMA récapitule certains des phénotypes connus de la SMA et peut être utilisé pour des approches de criblage pharmacologique. En parallèle, nous avons également utilisé les caractéristiques des hPSC afin d'étudier un mécanisme intervenant dans les étapes précoces du développement embryonnaire. Nous avons travaillé en collaboration avec l'équipe du Dr. Rougeulle afin d'étudier les mécanismes de l'inactivation du chromosome X. Nous avons notamment déterminé l'implication du facteur Xact dans la mise en place des évènements menant à la ré-activation du chromosome X.En conclusion, les hPSC sont donc devenue des outils primordiaux pour la modélisation, qu'elle soit développementale ou pathologique et devraient permettre d'accélérer la compréhension des mécanismes physiologiques. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are characterized by self-renewal and pluripotency abilities that refer to the capacity to proliferate indefinitively without commitment in vitro and to the ability to differentiate into multiple and specialized cell lineages. hPSCs are a useful tool for regenerative medicine, pathological modelling and new therapeutic molecule identification.My thesis project mainly focused on the development of a new cellular model for the study of spinal muscular atrophy (SMA). SMA is mainly characterized by a specific loss of spinal motor-neurons (sMN) that induces a progressive muscle weakness. The initial objective has been to define a protocol allowing the differentiation of sMN starting from hPSC. Using combinatorial analysis, we identified experimental condition that induced an efficient (70%) and rapid (14 days) generation of sMN. In parallel, we setted up the condition needed for the specification of different subtype of MN, such as spinal interneurons (77%) and sensory neurons (64%) in the same timeline.Then, we used human induced pluripotent stem cells (hIPS) from skin biopsies of SMA patients and unaffected fibroblasts. Characterization of the MNs viability was performed in 384 wells plates with high throughput screening. Moreover, our new system allowed us to reproduce in well characterized human PSC-derived MNs specific phenotype described for SMA thus providing a new tool for HT pharmacological screening and drug discovery. In addition, in collaboration with Dr.Rougeulle, we used hPSC to study specific mechanism occurring during early stages of embryonic development. In particular, we characterized the implication of Xact in the reactivation of chromosome X.

Altération de la régénération musculaire dans la maladie pulmonaire obstructive chronique. La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par une obstruction bronchique irréversible et progressive. L’atrophie musculaire périphérique y est fréquente et a un impact négatif sur la capacité fonctionnelle et la survie des sujets atteints. Toutefois, on ignore si une altération du processus de régénération musculaire est un processus ayant cours dans l’atrophie musculaire périphérique. Le but de la présente thèse était donc d’étudier les cellules satellites, principales cellules responsables de la régénération musculaire dans les muscles périphériques de patients ayant une MPOC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’historique de réplication du tissu musculaire et la sénescence des cellules satellites. Les changements morphologiques ayant lieu dans le muscle au cours de la progression de la maladie rendent le muscle plus susceptible aux dommages, induisant un raccourcissement prématuré des télomères. Un raccourcissement des télomères chez les sujets ayant une MPOC avec atrophie est concomitant avec une augmentation du nombre de cellules satellites sénescentes et de l’épuisement du potentiel de régénération compromettant le maintien de la masse musculaire chez ces sujets. Dans un deuxième et troisième temps, nous avons étudié les étapes amenant une cellule satellite vers une cellule musculaire dans les muscles périphériques et respiratoires de patients ayant une MPOC comparativement à des sujets contrôles. Les cellules satellites sont impliquées dans la réparation du tissu musculaire. Dans les cellules satellites provenant des sujets ayant une MPOC, une altération de la prolifération et de la différentiation a été observée. Ces résultats sont compatibles avec une altération de la régénération musculaire pouvant conduire à l’atrophie musculaire dans la MPOC. Le quatrième volet de ce projet s’intéressait à l’impact d’un entraînement en résistance sur l’activité des cellules satellites et le rôle joué par la myostatine dans ce contexte. La littérature montre que l’exercice en résistance est bien toléré et aide les patients ayant une MPOC à retrouver une meilleure qualité de vie. Cependant, il semble qu’ils n’y répondent pas tous aussi bien que les sujets contrôles. La capacité de réponse des cellules satellites à un entraînement en résistance semble inadéquate, suggérant ainsi un défaut de leur activation. Dans la dernière étude de cette thèse, nous avons voulu évaluer l’impact de l’inflammation systémique en étudiant SAA1, une protéine de phase aiguë et p21, une protéine du cycle cellulaire dans la dégradation des protéines des cellules musculaires. Les liens de causalité entre l’affection primaire et les différentes comorbidités demeurent nébuleux dans la MPOC. SAA1 et p21 sont augmentés dans les muscles squelettiques des patients ayant une MPOC et par ailleurs, SAA1 est capable d’induire la dégradation des protéines musculaires. Cette thèse expose les premiers éléments impliquant l’altération de la régénération musculaire avec la dysfonction musculaire observée chez les patients ayant une MPOC. Ces résultats vont certainement contribuer au développement de nouvelles thérapies et stratégies d’intervention dans le but d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes d’une MPOC. En somme, les travaux effectués dans le cadre de la présente thèse montrent que plusieurs mécanismes agissent de concert avec l’inactivité physique afin d’induire le phénotype dysfonctionnel dans les muscles des patients ayant une MPOC. / Skeletal muscle regeneration is altered in skeletal muscles of patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Chronic Obstructive Pulmonary Disease is associated with an irreversible and a progressive airflow obstruction. In COPD, the loss of muscle mass has a significant impact on quality of life and is associated with premature death. Many biochemical factors have been proposed to trigger and perpetuate the skeletal muscle atrophy in COPD. The maintenance of peripheral muscle mass may be compromised in patients with COPD due to premature cellular senescence and exhaustion of the regenerative potential of the muscles. Shortening of telomeres in patients with COPD is consistent with an increased number of senescent satellite cells and an exhausted muscle regenerative capacity, compromising the maintenance of muscle mass in these individuals. Muscle mass maintenance relies on the delicate regulation between protein degradation, synthesis and the addition of new myonuclei from satellite cells. Comparing the signalisation involved in the skeletal muscle regeneration between two muscles with different levels of activation within the same subjects is an interesting strategy to evaluate the impact of local versus systemic factors in the regulation of skeletal muscle regeneration. Impaired satellite cell activation, proliferation and differentiation affecting skeletal muscle regeneration could contribute to the progression of muscle dysfunction in patients with COPD. Resistance training, as provided in pulmonary rehabilitation, is an essential tool to promote muscle hypertrophy and increase muscle strength. However, hypertrophic response to resistance training is heterogeneous in patients with COPD. Failure in satellite cell function can lead to delayed, impaired or failed recovery after muscle injury, and such failures become increasingly prominent in cases of progressive muscle disease. Although the inflammatory response has been linked to the initiation and development of muscle atrophy, discrepancies exist in the literature concerning the presence and the nature of systemic and/or local inflammatory response in patients with COPD. This inflammation could be linked to the skeletal muscle protein imbalance and ultimately atrophy. The quest to identify a key inflammatory factor that could orchestrate the signaling cascade involved in contractile protein synthesis/degradation or even tissue renewal in peripheral muscles of patients with COPD is of major importance for future direction in this research field. This thesis demonstrates for the first time the role played by satellite cells in muscle atrophy associated with COPD. Better knowledge of the regenerative capacity in the context of COPD will enhance the understanding of the atrophying process and deepen the reasoning on training interventions in this population.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 69-82. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Dans plusieurs conditions chroniques, l' inflammation systémique coexiste avec l'atrophie Inusculaire. La myostatine est une protéine anti-anabolique qu ' on croit pouvoir être responsable du développement de l' atrophie musculaire. II exi ste des preuves indirectes liant les mécanismes inflammatoires à la régulation de l' expression et l'activité de la myostatine. Dans ces travaux, un 1i en direct entre l' inflamlnation et la production de myostatine dans les myotubes L6 a été démontré. L' administration de LPS au milieu de culture des myotubes a mené à ges augmentions des niveaux de Inyostatine qui étaient dépendants de la dose et de la période d' étude. La coincubation du LPS avec un inhibiteur du ±tumor necrosis factor¿ (TNF) a bloqué l' augmentation des niveaux de la myostatine. Cependant, la stimulation des myotubes directement avec TNF n' a pas produit d' auglnentation similaire en Inyostatine. Par ail1eurs, aucun changelnent n' a été observe dans l' activité de la voie de l' ubiquitine-protéasolne ou dans le niveau de différentiation des Inyotubes suggérant que l'activité de la Inyostatine ne soit pas Inodiftée dans ces conditions expérilnentales. Finalelnent, lesmyotubes stimulés avec le LPS ont Inontré une augmentation de l' activité de la voie de l' insulin-Iike growth factor - Akt - 'mamlnalian target of rapamycin (lGF-Akt-mTOR), silnilaire a celui qui a été observé chez les patients ayant une MPOC et une atrophie musculaire. Ces résultats démontrent que le LPS peut réguler le niveau de Inyostatine si TNF est biologiquement actif. De plus, les données recueillies à partir de ce Inodèle sont sinlilaires à ceux observés dans certains modèles in vivo, suggérant que l' inflamlnation et la myostatine aient un rôle à jouer dans le développement de l' atroph ie musculaire dans certaines conditions pathologiques hUlnaines. Ces résultats soulèvent des questions intéressantes qui demanderont à être investiguées.

L’atrophie et les dysfonctions musculaires sont des problèmes courants et d’origines variées. À titre d’exemple l’alitement prolongé, le SIDA, les cancers, l’hypogravité et le vieillissement peuvent tous entraîner une perte de masse et de force musculaire. Malgré les coûts économiques et sociaux élevés, relativement peu d’efforts ont été investis dans la caractérisation des processus qui gouvernent l’atrophie/dysfonction musculaire et dans le développement de traitements plus efficaces. Conséquemment, cette thèse vise à approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes qui régulent l’atrophie/dysfonction et la récupération des muscles atrophiés par sous-utilisation. Tout d’abord, nous avons caractérisé l’impact des leucocytes impliqués lors de la remise en charge du muscle soléaire atrophié par hypogravité. Ainsi, nous avons démontré que les mastocytes étaient activés par la remise en charge et que leur dégranulation orchestrait le recrutement des neutrophiles et des monocytes/macrophages. Ensuite, nos recherches ont indiqué que l’activité des neutrophiles pouvait être régulée en fonction de leur microenvironnement et que leur présence dans les muscles atrophiés et inflammés n’était pas nécessairement associée à l’induction de dommages secondaires. Par la suite, nous avons établi que la présence des macrophages était importante pour permettre la récupération optimale de la force des muscles atrophiés. Nous avons également démontré que l’activité myogénique des macrophages pouvait être optimisée en favorisant leur phénotype anti-inflammatoire avec le facteur de croissance hématopoïétique « macrophage-colony stimulating factor » (M-CSF). Finalement, nous avons caractérisé l’impact du « receptor activator of NF-kB » (RANK) et de son ligand RANKL, une voie signalétique impliquée dans le remodelage osseux et l’ostéoporose, sur l’atrophie/dysfonction musculaire. Nous avons démontré qu’une déficience de RANK ou le blocage de RANKL par l’ostéoprotégérine protègent contre la perte de force des muscles dénervés ou dystrophiques. Ce phénomène est associé à des modifications dans l’expression des protéines favorisant une recaptation plus efficace du calcium. De plus, RANK participe à la reconversion des fibres rapides vers lentes durant la période de remise charge. Globalement, nos travaux permettent de mieux comprendre les mécanismes entourant l’atrophie, la croissance et les dysfonctions musculaires et ouvrent la voie à de nouvelles pistes de traitement pour plusieurs maladies neuro-musculaires. / Muscle atrophy and dysfunction are characterized by a loss of muscle mass and force, which are commonly found in many pathologies or conditions such as AIDS, cancers, chronic obstructive pulmonary diseases, cast immobilization, hypogravity, bed rest or aging, to name a few. Muscle atrophy/dysfunction have also very high social and economic costs, but very few laboratories have investigated the cellular and molecular mechanisms behind these muscular problems. The aim of this thesis is therefore to enhance our understanding of different mechanisms governing muscle atrophy/dysfunction and regrowth by using different models of disuse and dystrophy. Thus, we have initially explored the roles of different leucocytes in atrophied and reloaded soleus muscle. Firstly, we looked at the role of mast cells and showed that the mechanical stress associated with muscle reloading is able to stimulate mast cell degranulation, which orchestrates the recruitment of neutrophils and monocytes/macrophages. Secondly, our experiments revealed that neutrophil activity is adaptable and that neutrophil-induced tissue damage is dependent on the microenvironment. In atrophied and reloaded muscles, the presence of neutrophils is not associated with secondary damage or promotion of muscle recovery. Thirdly, we demonstrated that the presence of macrophages is essential for optimal muscle force recovery from atrophy. Fourthly, we showed that the macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) promote the myogenic activity of macrophages by stimulating their anti-inflammatory phenotype. Finally, we investigated the impact of the receptor activator of NF-kB (RANK) and its ligand RANKL, a signalling pathway involved in bone remodelling and osteoporosis, on muscle atrophy and dysfunction. Our results showed that the specific deletion of RANK in the muscle or the blockage of RANKL with osteoprotegerin increased significantly force production in denervated and dystrophic muscles. These results were associated with various modifications in calcium handling protein expression favouring efficient calcium uptake. Moreover, we also demonstrated that RANK activation gives preference to the reconversion from fast-to-slow muscle fibers following hindlimb unloading/reloading. Overall, our results bring a better understanding of different mechanisms related to muscle atrophy, dysfunction and regrowth and potentially open new avenues for the treatment of several debilitating skeletal muscle conditions.

De nombreuses répercussions systémiques caractérisent la maladie pulmonaire obstructive chronique et contribuent à augmenter la morbidité de cette pathologie. Parmi celles-ci, la dysfonction musculaire périphérique et, plus particulièrement, l'atrophie du muscle squelettique présentent un intérêt distinctif compte tenu des conséquences néfastes qu'elles engendrent sur la capacité fonctionnelle des patients en plus de réduire l'espérance de vie. Les mécanismes exacts menant à la diminution de la masse musculaire ne sont pas complètement élucidés. Cependant, il apparaît de plus en plus clair que diverses causes agissent de concert avec l'inactivité associée à la MPOC pour induire le phénotype dysfonctionnel. Le maintien de la masse musculaire est régulé au niveau cellulaire pour un contrôle strict des voies de signalisation associées à la synthèse et la dégradation des protéines. Au cours de mes travaux de doctorat, je me suis intéressé, dans un premier lieu, à caractériser la variabilité induite par des outils de laboratoire fort utiles dans l'analyse de la signalisation cellulaire musculaire: la biopsie musculaire de Bergstrôm ainsi que le Western blot. Par la suite, j'ai caractérisé les effets sur la signalisation musculaire de trois causes suggérées dans la littérature pour induire l'atrophie musculaire dans la MPOC: l'hypoxémie, l'inflammation systémique et le tabagisme. Dans un premier lieu, les résultats présentés dans cette thèse démontrent la nécessité de standardiser le plus possible la procédure d'échantillonnage musculaire de façon à minimiser la variabilité induite et ainsi faciliter la détection de changements protéiques par Western blot. Dans un deuxième temps, nous avons mis en évidence les effets néfastes de l'exposition tabagique sur la signalisation musculaire et la nature réversible de ces effets lors de l'arrêt tabagique. Ensuite, nous avons démontré que l'hypoxie chronique induit une diminution de la synthèse et une augmentation de la dégradation protéique dans un modèle cellulaire. Finalement, l'utilisation d'un modèle murin exposé à l'hypoxie nous a permis de confirmer les effets délétères de l'hypoxie chronique sur la masse musculaire, tout en mettant en lumière une légère potentialisation de ces effets lorsque l'hypoxie est combinée à une inflammation systémique.

L'aspect expérimental de la pharmacocinétique nécessite le développement de techniques analytiques dans les milieux biologiques pour la quantification des médicaments dans les échantillons prélevés à des temps choisis. L'interprétation des données pharmacocinétiques implique ensuite le développement de modèles et de méthodes statistiques permettant l'évaluation des paramètres pharmacocinétiques caractéristiques des molécules considérées. Dans la première partie de ce travail, une méthode LC/MS/MS sensible et spécifique, a été développée et validée pour le dosage simultané de pralidoxime, diazépam et atropine dans le plasma. Une étude pharmacocinétique de chacun des trois composés chez le sujet sain recevant par voie intramusculaire l'association avizafone-atropine-pralidoxime, traitement recommandé pour l'intoxication par les agents organophosphorés, a ensuite été conduite. Les données issues du dosage plasmatique ont été analysées afin de caractériser la cinétique d'hydrolyse de l'avizafone et la pharmacocinétique de la pralidoxime. La modélisation individuelle, sujet par sujet, a permis de déterminer le meilleur modèle pharmacocinétique de la transformation d'avizafone en diazépam après injection intramusculaire d'avizafone seule ou en association avec atropine et pralidoxime. Une approche de pharmacocinétique de population a enfin été appliquée pour caractériser la pharmacocinétique de la pralidoxime après injection intramusculaire seule ou en association avec atropine et avizafone. Dans la deuxième partie de cette thèse, l'approche non compartimentale et la modélisation individuelle ont été appliquées à des données obtenues au cours d'une étude de pharmacocinétique évaluant l'administration orale de 50 mg de riluzole chez des enfants atteints d'amyotrophie spinale. Par simulations, il a été possible de montrer que l'administration de riluzole, à la dose de 50 mg deux fois par jour se traduirait par des concentrations résiduelles et maximales comparables à celles obtenues chez l'adulte après une dose de 100 mg deux fois par jour. La dose de 50 mg une fois par jour a donc été retenue pour l'étude clinique évaluant l'efficacité du riluzole chez les patients atteints d'amyotrophie spinale infantile. Mots-clés : Pharmacocinétique, Organophosphorés, Amyotrophie spinale infantile, Riluzole.

Thesis--Copenhagen. / Summary in Danish. Includes bibliographical references (p. 127-130).

La dysfonction musculaire est une des manifestations importantes de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Cette dysfonction musculaire amène plusieurs anomalies musculaires tant au niveau clinique, structural, métabolique que biochimique. Ces anomalies contribuent à l’intolérance à l’effort, la perte de masse maigre et de force musculaire, ainsi qu’à la diminution de la qualité de vie des patients atteints de la MPOC. Cette thèse a pour objectif général l’étude de la dysfonction musculaire périphérique dans la MPOC, plus précisément 1) l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans l’atrophie musculaire 2) l’étude du métabolisme musculaire à la suite d’un exercice en endurance et 3) l’étude de la réponse cellulaire suite à un exercice en résistance. Tout d’abord, nous avons démontré que la voie de signalisation des MAPK, plus précisément les protéines p38 MAPK, ERK 1/2 et JNK, pourrait jouer un rôle important dans le développement de l’atrophie musculaire chez les patients atteints de la MPOC. Par la suite, nous avons démontré que le SAA1 pourrait être impliqué dans la dysfonction des muscles périphériques chez les patients atteints de la MPOC. Le SAA1 est augmenté de façon significative tant au niveau de l’expression du gène que le niveau d’ARNm chez les patients présentant une MPOC. En second lieu, nous avons démontré une plus grande dépendance du système énergétique à la glycolyse a été observée lors d’un exercice en endurance chez les patients MPOC, ce qui pourrait contribuer à l’intolérance à l’exercice chez la MPOC. Finalement, nous avons déterminé qu’il existe une réponse cellulaire différente pour les protéines associées au maintien de la masse maigre suite à une session d’exercice en résistance chez les patients MPOC en comparaison à des sujets sains appariés pour l’âge. Cette thèse jette donc la lumière sur la contribution des voies de signalisation et des facteurs inflammatoires impliqués dans la dysfonction musculaire chez les patients présentant une MPOC et de la réponse à l’exercice tant en endurance qu’en résistance dans la MPOC. Ces résultats ajouteront aux connaissances moléculaires et cellulaires qui contribuent à la dysfonction musculaire périphérique et à l’intolérance à l’effort chez les patients atteints de la MPOC. / Peripheral muscle dysfunction is one of the most important systemic manifestations of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). This dysfunction brings many muscle abnormalities at the clinical, structural, metabolic and biochemical levels. These abnormalities contribute to the exercise intolerance, loss of muscle mass and force as well as diminishing quality of life of patients with COPD. This thesis as for general objective the investigation of peripheral muscle dysfunction in COPD, more precisely 1) the study of signalling pathways involved in muscle atrophy 2) the study of muscle metabolism in response to endurance exercise involved in exercise intolerance and 3) the study of muscle cellular adaptations to resistance exercise involved in the less than optimal response following resistance training in patients with COPD. First, we showed the possible contribution of the MAPKs, more precisely p38 MAPK, ERK1/2 and JNK, to the peripheral muscle dysfunction in COPD. The phosphorylation levels as well as the mRNA expression of these key proteins are elevated in patients with COPD compared to age-matched healthy controls. We also demonstrated that SAA1 could have a possible role in the peripheral muscle dysfunction in COPD. Secondly, we observed that patients with COPD have a greater reliance on the muscle glycolytic metabolism during an endurance exercise done until exhaustion, therefore possibly contributing to the exercise intolerance seen in patients with COPD. Lastly, we demonstrated that the cellular adaptation in response to resistance exercise training is different for proteins involved in muscle mass regulation in patients with COPD compared to age-matched healthy controls, thus possibly contributing to the less-than-optimal response to resistance exercise training in patients with COPD. This thesis puts at the forefront the signalling pathways and inflammatory markers contributing to the inherent peripheral muscle dysfunction in patients with COPD, as well as the investigation of exercise response in patients with COPD. These results will add to the scientific knowledge of the metabolic and cellular aspects of peripheral muscle dysfunction in COPD.