Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont pour caractéristiques principales l'auto-renouvellement permettant de les avoir de manière quasi-illimité ainsi qu'un potentiel de différenciation, qui en théorie, peut permettre de générer l’ensemble de cellules de l'organisme. Ces deux caractéristiques en font un outil de choix pour une utilisation en médecine régénérative, disséquer certains mécanismes du développement humain, l'étude de maladies génétiques et la recherche de nouveaux médicaments. Durant mes travaux de thèse, j'ai utilisé les hPSC afin de mettre en place un nouveau modèle d'étude de l'amyotrophie spinale infantile (SMA). La SMA est une maladie neurodégénérative due à la mort spécifique des motoneurones (MN) de la moelle épinière qui provoque une atrophie des muscles striés. La première étape a consisté à la mise en place d'un protocole de différenciation efficace en motoneurones à partir des hPSC. A l'issue d'un criblage combinatoire de morphogènes, nous avons identifié une condition permettant la production de motoneurones spinaux de façon efficace (70%) et rapide (14 jours). Des conditions de génération de motoneurones craniaux (50%), sensitifs (65%) et inter-neurones (75%) ont également été identifiées. Ce protocole de différenciation optimisé a ensuite été appliqué sur des lignées de cellules souches induites à la pluripotence (hIPS) reprogrammées à partir de fibroblastes porteurs de la mutation causale de la SMA ainsi que sur des fibroblastes contrôles. Nous avons mis en place un système d'étude des motoneurones en plaque 384 afin d'étudier le phénotype de dégénérescence spécifique des MN-SMA sur des cultures à long terme, via des approches d'analyse à haut débit. Nos travaux montrent que notre modèle de la SMA récapitule certains des phénotypes connus de la SMA et peut être utilisé pour des approches de criblage pharmacologique. En parallèle, nous avons également utilisé les caractéristiques des hPSC afin d'étudier un mécanisme intervenant dans les étapes précoces du développement embryonnaire. Nous avons travaillé en collaboration avec l'équipe du Dr. Rougeulle afin d'étudier les mécanismes de l'inactivation du chromosome X. Nous avons notamment déterminé l'implication du facteur Xact dans la mise en place des évènements menant à la ré-activation du chromosome X.En conclusion, les hPSC sont donc devenue des outils primordiaux pour la modélisation, qu'elle soit développementale ou pathologique et devraient permettre d'accélérer la compréhension des mécanismes physiologiques. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are characterized by self-renewal and pluripotency abilities that refer to the capacity to proliferate indefinitively without commitment in vitro and to the ability to differentiate into multiple and specialized cell lineages. hPSCs are a useful tool for regenerative medicine, pathological modelling and new therapeutic molecule identification.My thesis project mainly focused on the development of a new cellular model for the study of spinal muscular atrophy (SMA). SMA is mainly characterized by a specific loss of spinal motor-neurons (sMN) that induces a progressive muscle weakness. The initial objective has been to define a protocol allowing the differentiation of sMN starting from hPSC. Using combinatorial analysis, we identified experimental condition that induced an efficient (70%) and rapid (14 days) generation of sMN. In parallel, we setted up the condition needed for the specification of different subtype of MN, such as spinal interneurons (77%) and sensory neurons (64%) in the same timeline.Then, we used human induced pluripotent stem cells (hIPS) from skin biopsies of SMA patients and unaffected fibroblasts. Characterization of the MNs viability was performed in 384 wells plates with high throughput screening. Moreover, our new system allowed us to reproduce in well characterized human PSC-derived MNs specific phenotype described for SMA thus providing a new tool for HT pharmacological screening and drug discovery. In addition, in collaboration with Dr.Rougeulle, we used hPSC to study specific mechanism occurring during early stages of embryonic development. In particular, we characterized the implication of Xact in the reactivation of chromosome X.

L'aspect expérimental de la pharmacocinétique nécessite le développement de techniques analytiques dans les milieux biologiques pour la quantification des médicaments dans les échantillons prélevés à des temps choisis. L'interprétation des données pharmacocinétiques implique ensuite le développement de modèles et de méthodes statistiques permettant l'évaluation des paramètres pharmacocinétiques caractéristiques des molécules considérées. Dans la première partie de ce travail, une méthode LC/MS/MS sensible et spécifique, a été développée et validée pour le dosage simultané de pralidoxime, diazépam et atropine dans le plasma. Une étude pharmacocinétique de chacun des trois composés chez le sujet sain recevant par voie intramusculaire l'association avizafone-atropine-pralidoxime, traitement recommandé pour l'intoxication par les agents organophosphorés, a ensuite été conduite. Les données issues du dosage plasmatique ont été analysées afin de caractériser la cinétique d'hydrolyse de l'avizafone et la pharmacocinétique de la pralidoxime. La modélisation individuelle, sujet par sujet, a permis de déterminer le meilleur modèle pharmacocinétique de la transformation d'avizafone en diazépam après injection intramusculaire d'avizafone seule ou en association avec atropine et pralidoxime. Une approche de pharmacocinétique de population a enfin été appliquée pour caractériser la pharmacocinétique de la pralidoxime après injection intramusculaire seule ou en association avec atropine et avizafone. Dans la deuxième partie de cette thèse, l'approche non compartimentale et la modélisation individuelle ont été appliquées à des données obtenues au cours d'une étude de pharmacocinétique évaluant l'administration orale de 50 mg de riluzole chez des enfants atteints d'amyotrophie spinale. Par simulations, il a été possible de montrer que l'administration de riluzole, à la dose de 50 mg deux fois par jour se traduirait par des concentrations résiduelles et maximales comparables à celles obtenues chez l'adulte après une dose de 100 mg deux fois par jour. La dose de 50 mg une fois par jour a donc été retenue pour l'étude clinique évaluant l'efficacité du riluzole chez les patients atteints d'amyotrophie spinale infantile. Mots-clés : Pharmacocinétique, Organophosphorés, Amyotrophie spinale infantile, Riluzole.

Les amyotrophies spinales infantiles (ASI) de type 1 (subdivisées en type 1 vrai et 1 bis), sont des maladies neuromusculaires qui paralysent progressivement l’enfant, mettant en jeu son pronostic vital lors de l’atteinte des muscles respiratoires. L’assistance respiratoire invasive par trachéotomie évite son décès, mais soulève un questionnement éthique compte-tenu de la gravité du handicap moteur. L’ASI de type 1 vrai représente la forme la plus grave. Ces enfants étant totalement paralysés et pouvant très difficilement communiquer, ils ne sont pas trachéotomisés et décèdent dans la petite enfance. Le type 1 bis étant un peu moins sévère avec possibilité pour l'enfant de s'exprimer, les équipes médicales françaises se positionnent généralement en faveur de la trachéotomie, ce qui ne fait pas l’unanimité au niveau international. Cette question soulève donc un questionnement éthique, car lorsque les professionnels évaluent la vie qu’elle va imposer à l’enfant ainsi qu’à sa famille, ils redoutent éventuellement qu’elle représente une obstination déraisonnable de soins. Mais qu’ils y soient favorables ou au contraire défavorables, ils ne peuvent décider seuls de la démarche à entreprendre et il leur est impossible d’exclure les parents du processus décisionnel. Au regard de ces problématiques, ce travail porte une attention particulière aux parents de ces enfants avec 2 thématiques de recherche approchées par des études qualitatives : L’une sur leur vécu de la prise de décision de recourir ou non à la trachéotomie, avec la réalisation de deux études phénoménologiques : une auprès de parents dont l’enfant est décédé sans trachéotomie, l’autre auprès de parents ayant un enfant vivant avec une trachéotomie. L’autre sur les conséquences de la trachéotomie pour l’enfant et sa famille, menée auprès de mamans d’enfants trachéotomisés. Les résultats de ces travaux mettent en exergue les difficultés d’être exposé à une telle prise de décision en tant que parent, et le cheminement ainsi que les évènements qui les mènent à un moment ou un autre à se positionner sur la question. Ils interrogent également la place dans la société de l’enfant tétraplégique, trachéotomisé et ventilo-dépendant. Son état représente un paroxystique degré de vulnérabilité physique et sociale, considérablement majoré par le fait qu’il ne peut pas, comme l’adulte, tenter de prendre sa vie en main. Ce sujet n’étant jamais évoqué dans la presse non spécialisée, ces situations restent souvent dans l’ombre alors qu’elles représentent des vies qui ont grandement besoin de tolérance et de solidarités humaines (individuelles et collectives) pour ne pas s’éteindre. Ces dernières déterminent en partie le devenir de l’enfant et favorisent ou au contraire, empêchent la création de sa place légitime au sein de la société / Childhood spinal muscular atrophy (SMA) type 1 (divided into true type 1 and 1a), are progressively paralyzing neuromuscular diseases that afflict children, affecting their prognosis when respiratory muscles are involved. Invasive ventilatory support by tracheotomy prevents death, but raises ethical issues in view of the severity of motor impairment. SMA type 1 represents the most severe form. These children are completely paralyzed and communicate only with great difficulty; they are not tracheotomized and die in infancy. For Type 1a, being somewhat less severe with the possibility for children to express themselves, French medical teams are generally positioned in favor of tracheotomy, which is not an internationally unanimous approach. This question raises an ethical issue because when professionals assess the life that will result for the child and family, they sometimes fear that it represents unreasonable and excessive care. Whether their views are favorable or unfavorable regarding ventilatory support, they cannot decide alone which approach should be undertaken; it is impossible to exclude parents from decision making. Given these issues, this study pays particular attention to parents of children with two research themes through qualitative research : One focus was on parents’ experience of deciding whether or not to accept tracheotomy, which was examined through two phenomenological studies: one with parents whose child died without a tracheotomy, the other with parents with children living with a tracheotomy. The other focus was on the consequences of a tracheotomy for the child and family, conducted among mothers of children with tracheotomies. The results of these studies highlight the difficulties of being faced with such a decision as a parent, and the journey and events that lead to one point or another on this issue. They also question the place in society of the quadriplegic child with a tracheotomy and ventilator dependence. The child’s condition represents a paroxysmal degree of physical and social vulnerability, significantly increased by the fact that he/she cannot, as adults, take his/her life in hand. This subject is never mentioned in the lay press; these situations often remain in the shadows while there are lives that are in dire need of tolerance and human solidarity (individual and collective) to not be extinguished. This partly determines the future of the child and promotes or, on the contrary, prevents the creation of his/her rightful place in society.